羊肚菌胞內(nèi)多糖的提取及單糖組成分析*

矯麗曼

(遼寧省楊樹研究所，遼寧　蓋州115200)

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羊肚菌胞內(nèi)多糖的提取及單糖組成分析*

矯麗曼

(遼寧省楊樹研究所，遼寧蓋州115200)

以人工培養(yǎng)的羊肚菌菌絲為材料，通過單因素和正交試驗的方法，篩選羊肚菌胞內(nèi)多糖(MIP)的最佳提取方法，并用硅膠G薄層層析和高效液相色譜法對MIP純品的單糖組分進行分析。結(jié)果表明，羊肚菌多糖最佳的提取工藝為加水倍數(shù)25倍、提取溫度90℃、浸提時間2h、用95%乙醇沉淀多糖，其多糖得率為7.694%。其MIP由D-甘露糖和D-半乳糖兩種單糖組成，摩爾比為1︰1.059。

羊肚菌；胞內(nèi)多糖；提取工藝；薄層層析；高相液相色譜

進入21世紀后，中國林下經(jīng)濟迅速發(fā)展，林下經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)能夠大幅度提高林地的利用效率以及森林產(chǎn)業(yè)的綜合效益，利用林地的資源優(yōu)勢，促進林下經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)的深入發(fā)展，使其集約化、產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化發(fā)展，最終實現(xiàn)農(nóng)民收入的增加，成為中國林業(yè)發(fā)展新的經(jīng)濟增長點。當前中國林下經(jīng)濟發(fā)展的基本模式主要包括森林景觀利用、林下產(chǎn)品采集加工、林下養(yǎng)殖和林下種植等4種模式。其中林下種植，就是利用林下資源，適當?shù)匕l(fā)展藥類、菌類、牧草等種植類產(chǎn)品[1]。

中國真菌的半野生栽培技術(shù)已取得了成功，適合這種半野生栽培的菌種也很多。羊肚菌(MorchellaconicaFr)就是其中一種。羊肚菌(Morchella)是一種珍貴的食(藥)用菌，具有補腎、補腦、提神的功能。多糖是其主要的功能成分，是一種有效的生物系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑，具有較高的藥用價值，可明顯改善腰腿疼痛、手麻木、盤骨不舒等癥狀[2]。羊肚菌人工栽培最早成功的是1982年Ower等發(fā)明的羊肚菌(M.esculenta)人工栽培方法[3]。中國從20世紀80年代至今也有羊肚菌(M. spp.)栽培成功的報道[4～5]，關(guān)明進行了林下羊肚菌栽培技術(shù)探索，實驗采用改良的土豆培養(yǎng)基制作母種，選擇以楊樹(Populus)或樺樹(Betula)為主的針闊葉林作為播種場地，種植羊肚菌獲得成功[6]。劉紅民對楊樹林下羊肚菌菌種的制備及林下栽培方法進行了研究[7]。本文以人工培養(yǎng)的羊肚菌菌絲為材料，對羊肚菌胞內(nèi)多糖的提取方法及其單糖組成進行了研究，以期為進一步研究楊樹林下栽培的菌種及其多糖藥用價值的開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料和試劑

1.1.1材料

羊肚菌購自中國科學院微生物研究所菌種保存中心。

1.1.2試劑

苯酚、硫酸、無水乙醇、硅膠G、甲醇、冰乙酸、氯仿、乙腈、苯胺、二苯胺、磷酸、鼠李糖、木糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖。

1.2儀器設(shè)備

DHG-9240(A)型鼓風干燥箱；LGJ-10型冷凍干燥儀；AL104型電子天平；HZQC型恒溫浴振蕩器；UV2501PC紫外分光光度計；高效液相色譜儀Waters 600(美國Water公司)；Ultrahydrogel 2000和Ultrahydrogel 500色譜柱串聯(lián)(美國沃特世公司)；SPD-10A示差折光檢測器(日本島津公司)；LC-10AT流動泵；層析柱(2.0cm×40cm)。

1.3方法

1.3.1多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖的含量[8]。

1.3.2羊肚菌胞內(nèi)多糖(MIP)的基本提取方法[9]

取長滿羊肚菌菌絲的發(fā)酵培養(yǎng)基，用紗布濾出菌絲，蒸餾水清洗3次，40℃干燥12h，粉碎后充分研磨，得到羊肚菌菌絲干粉。5g的羊肚菌菌絲干粉，加入20倍體積的水，在80℃條件下浸提2h，提取液4 000rpm離心15min，上清液經(jīng)紗布過濾，濾液減壓濃縮至原體積的1/3，濃縮液加入3倍體積的95%乙醇，沉淀12h。然后4 000rpm離心15min，沉淀在40℃下減壓干燥即為羊肚菌胞內(nèi)粗多糖。

1.3.3各提取因素對多糖得率的影響[10～11]

在基本提取方法的基礎(chǔ)上，只改變一個條件，其他條件不變，每組試驗3次重復，分別研究加水倍數(shù)(分別為5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍)、提取溫度(分別為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)、浸提時間(分別為1h、2h、3h、4h、5h)、提取次數(shù)(分別為1次、2次、3次、4次、5次)、乙醇濃度(分別為70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%)對羊肚菌胞內(nèi)多糖得率的影響。

1.3.4正交試驗法確定MIP的最佳熱水提取法[12～13]

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)各個因素對多糖得率影響的顯著性程度以及各個因素的有效影響范圍，選擇顯著的因素及其有效的水平，設(shè)計正交試驗，來確定最佳的熱水提取法。

1.3.5 不同提取方法對多糖得率的影響[14～15]

將最佳提取法中的熱水分別替換0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L的鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液和氯化鈉溶液，每組試驗3次重復。同熱水提取法相比，研究稀酸、稀堿、稀鹽提取法對多糖得率的影響。

1.3.6MIP的單糖組成分析

(1)單糖的水解[16～17]脫蛋白后的多糖溶液經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析和SephadexG-100凝膠柱層析進行分離純化；用紫外光譜、醋酸纖維素薄膜電泳和SephadexG-200葡聚糖凝膠柱層析方法進行純度鑒定，得到均一組分MIP純品，用2mol/L的硫酸110℃水解，即為多糖的水解液。

(2)薄層層析法[18～20]取活化過的硅膠G薄板一塊，依次點鼠里糖、木糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖、果糖、半乳糖溶液和多糖水解液，用冰乙酸︰氯仿︰水=35︰30︰5做展層劑。根據(jù)色斑顏色及Rf值即可初步鑒定出MIP水解液中含有的單糖樣品。

(3)高效液相色譜法[21～23]將多糖的水解液用高效液相色譜分析，并與標準單糖對照，確定單糖的組成種類，計算各單糖的摩爾比。

2　結(jié)果與分析

2.1各提取因素對多糖得率的影響

2.1.1加水倍數(shù)對多糖得率的影響

加水倍數(shù)對多糖得率的影響見圖1。

圖1　加水倍數(shù)對多糖得率的影響

由圖1可見，隨著加水倍數(shù)的增加，多糖得率也隨著逐漸增大。達到20倍后多糖得率增幅不大，而且隨著加水倍數(shù)的增加，會增加后續(xù)提取液的濃縮工作量，因此，提取過程的加水倍數(shù)應選擇20倍。

2.1.2提取溫度對多糖得率的影響

由圖2可見，隨著提取溫度的提高，多糖得率也逐漸增大；而且當溫度達到80℃時，增幅較大，隨后增幅明顯減弱。因此提取溫度應選擇80℃。

圖2　提取溫度對多糖得率的影響

2.1.3浸提時間對多糖得率的影響

由圖3可見，隨著提取時間的延長，多糖得率逐漸增大；當提取時間達到2h，多糖得率的增幅較大，隨后其增幅變小。因此，提取時間應選擇2h。

2.1.4提取次數(shù)對多糖得率的影響

由表1可見，隨著提取次數(shù)的增加，多糖得率有逐漸增大的趨勢，但增幅很小，從多糖得率上來看，提取5次與提取1次相比，多糖總得率只增加了0.324%，因此，可以確定提取次數(shù)對多糖得率的影響作用不明顯，可以作為次要因素考慮。

圖3　浸提時間對多糖得率的影響

提取次數(shù)/次12345多糖得率/%6.8346.9987.0377.0827.158

2.1.5乙醇濃度對多糖沉淀效果的影響

由圖4可見，隨著乙醇濃度的增加，多糖得率逐漸增大，而且增大的幅度相同，因此提取過程的乙醇濃度應選擇100%乙醇，即無水乙醇。

圖4　乙醇濃度對多糖得率的影響

2.1.6正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果,確定加水倍數(shù)、浸提溫度、提取時間、乙醇濃度為影響多糖得率的主要因素，而且確定各個因素的水平，其中加水倍數(shù)(A)分別為：20倍、25倍、30倍；浸提溫度(B)分別為：70℃、80℃、90℃；提取時間(C)分別為：2h、3h、4h；乙醇濃度(D)分別為：90%、95%、100%。因此，正交試驗采用L9(34)的方法(表2)進行試驗，來確定最佳方法。

表2　正交試驗及結(jié)果分析

注：A為加水倍數(shù)(倍)，B為浸提溫度(℃)，C為提取時間(h)，D為乙醇濃度(%),Ki表示任意列上水平號為i時所對應的試驗結(jié)果之和，k表示平均值，R表示極差。

從表2的正交試驗R值可以看出，A、B、C、D 4個因素對多糖得率的影響程度依次為：B>C>A>D。正交試驗確定最佳多糖提取工藝為A2B3C2D2，即加水倍數(shù)為25倍、90℃、提取3h、用95%乙醇沉淀多糖。照正交試驗確定的最佳組合A2B3C2D2，進行多糖提取試驗，并設(shè)3次重復，此時粗多糖的平均得率為7.547%，與表2中的第6次試驗A2B3C1D2的結(jié)果相比，A2B3C2D2組合的多糖得率略小于A2B3C1D2的多糖得率，因此，羊肚菌胞內(nèi)多糖最佳提取工藝為:A2B3C1D2。即加水倍數(shù)為25倍、浸提溫度為90℃、提取時間為2h、用95%乙醇沉淀多糖，多糖的得率為7.694%。

2.2不同提取溶劑對多糖得率的影響

從圖5可以看出，采用稀HCl溶液提取羊肚菌胞內(nèi)多糖時，隨著HCl溶液濃度的增加，多糖的得率有明顯的下降趨勢；采用稀NaOH溶液提取時，隨著NaOH溶液濃度的增加，多糖得率也有下降的趨勢；采用NaCl溶液提取時，隨著NaCl溶液濃度的增加，多糖的得率有較小的下降趨勢。

圖5　不同濃度的溶劑對多糖得率的影響

最佳熱水提取法多糖的得率為7.694%，酸、堿、鹽溶液提取羊肚菌胞內(nèi)多糖時，多糖的得率沒有提高，反而下降，從7.694%分別降到2.194%、1.657%、6.189%。因此，選用熱水提取法提取較為適宜。

2.3MIP的單糖組分分析結(jié)果

2.3.1硅膠G薄層層析分析結(jié)果

如圖6所示，各種單糖顯示出不同的顏色。多糖水解樣品的斑點顏色與幾種標準單糖樣品都很相似，Rf值也和幾種標準單糖樣品相近，初步確認該多糖含有幾種單糖成分，必須通過高效液相色譜來確定它的單糖組成。

注：1為L-鼠李糖，2為D-木糖，3為D-葡萄糖，4為半乳糖醛酸，5為D-甘露糖，6為D-果糖，7為D-半乳糖，8為多糖水解樣品。

圖8　MIP水解液的HPLC色譜圖

2.3.2高效液相色譜法分析結(jié)果

從圖7和圖8可以看出，與標準單糖的保留時間對比，MIP純品完全水解液里含有二種單糖：D-甘露糖和D-半乳糖，摩爾比為1︰1.059?？梢奙IP主要由D-甘露糖和D-半乳糖組成。

3　結(jié)論與討論

3.1各單因素對多糖得率的影響

采用L9(34)的正交試驗設(shè)計，得到羊肚菌胞內(nèi)多糖的最佳熱水提取工藝，即加水倍數(shù)為25倍、浸提溫度為90℃、提取時間為2h、95%乙醇沉

淀多糖，該提取工藝的多糖得率為7.694%。在羊肚菌胞內(nèi)多糖提取率的各個因素中，影響程度依次為：浸提溫度>提取時間>加水倍數(shù)>乙醇濃度。究其原因，可能在多糖釋放過程中，細胞壁是一個薄薄的屏障，溫度越高，提取時間越長，細胞壁越容易破損，多糖越容易釋放；同樣，在一定溫度下，提取時間越長，細胞壁破損程度越大，多糖越容易釋放；利用了反萃取的技術(shù)，以乙醇作為萃取液，乙醇濃度越大，越易吸收細胞內(nèi)的水分，使其多糖越容易沉淀。因條件和時間限制，未對其他的提取法做比較分析，例如采用超聲破碎，液氮研磨，酶解等方法破壞細胞壁，然后釋放出多糖，尚待在今后實驗中作深入研究。

3.2不同提取溶劑對多糖得率的影響

采用正交試驗確定了最佳的提取方法為熱水提取法。

3.3MIP單糖組成分析

經(jīng)過高效液相色譜分析得出，MIP主要由D-甘露糖和D-半乳糖組成，摩爾比為1︰1.059，兩者均屬于吡喃糖。

本文主要對羊肚菌菌絲中的胞內(nèi)多糖提取和單糖組成進行了研究，未對分離純化、分子結(jié)構(gòu)及其生物活性進行分析。今后應著重于羊肚菌多糖的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及其生物活性，尤其是在抗腫瘤機理等方面研究。

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Extraction and Monosaccharide Composition of Intracellular Polysaccharide of Morchella conica Fr.

JIAO Li-man

(Liaoning Provincial Institute of Poplar，Gaizhou Liaoning 115200，P.R.China)

The mycelium of the plantedMorchellaconicaFr as materials,the best extraction method of intracellular polysaccharide by single factor analysis and orthogonal experiment were studied.The composition sugars of MIP was also analyzed with Silica gel G thin-layer chromatography and HPLC.The results show that the optimal extraction technology is :the water multiple with 25,the extractive temperature with 90℃,the extractive time with 2 hours,the alcohol concentration with 95%.At this condition,the yield is 7.694% ,and the MIP is constituted by D-mannose and D-galactose,the mol proportion is 1︰1.059.

MorchellaconicaFr.；intracellular polysaccharide；extractive technology；thin-layer chromatography；HPLC

2015-08-27

遼寧省科技攻關(guān)及成果產(chǎn)業(yè)化項目(2014207011)。

矯麗曼(1981-)，女，工程師，碩士研究生，主要從事楊樹轉(zhuǎn)基因育種和楊樹林下食用菌栽培等方面研究工作。E-mail：jiaoliman1025@163.com

Q 946.3

A

1672-8246(2016)04-0130-06

doi:10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.04.022