廣西良種杉木組培育苗快繁技術體系的優(yōu)化*

蔡玲，吳幼媚，黃金使，黃艷，黃宏喜，韋理電，蒙江春

(1.廣西林業(yè)科學研究院,廣西　南寧530002；2.國家林業(yè)局中南速生材繁育實驗室，廣西　南寧530002；3.廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，廣西　南寧530002;4.南寧樹木園，廣西　南寧530031；5.華山林場，廣西　環(huán)江547106)

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廣西良種杉木組培育苗快繁技術體系的優(yōu)化*

蔡玲1，2，3，吳幼媚1，2，3，黃金使1，2，3，黃艷4，黃宏喜1，2，3，韋理電5，蒙江春5

(1.廣西林業(yè)科學研究院,廣西南寧530002；2.國家林業(yè)局中南速生材繁育實驗室，廣西南寧530002；3.廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，廣西南寧530002;4.南寧樹木園，廣西南寧530031；5.華山林場，廣西環(huán)江547106)

以廣西良種杉木優(yōu)良無性系—柳327幼林萌芽條為外植體，通過采用正交設計方法對培養(yǎng)基激素組合、培養(yǎng)室光照強度和溫度等杉木快繁條件進行優(yōu)化。結果表明：繼代叢芽轉接時，叢芽中高≥1.3cm的單芽全部切除，接種于改良1/2 MS+6-BA 0.7mg/L+KT 0.3mg/L+IBA 0.1mg/L培養(yǎng)基內，培養(yǎng)35d，芽增殖系數(shù)達5.2，有效芽38株/瓶(500mL三角瓶)；將高≥1.3cm的組培單芽扦插于改良1/2 MS+KH2PO4100 mg/L+IAA 3mg/L+IBA 2mg/L+ABT60.8mg/L培養(yǎng)基內，然后置于溫度20～25℃，光照2 500～6 000Lx的培養(yǎng)環(huán)境條件下，培養(yǎng)45d，平均生根率達98.3%，根系數(shù)量為5.6條/株。經過優(yōu)化的杉木組培育苗體系達到了產業(yè)化生產的需求，為廣西良種杉木的快速繁育提供了技術支撐。

杉木；良種；組培苗；繼代培養(yǎng)；有效芽

杉木(Cunninghamialanceolata)是我國特有的重要造林用材樹種，具有速生、豐產、材性好和用途廣等優(yōu)良特性，在中國人工林中具有重要的地位[1～2]。隨著中國木材供需矛盾的突出，木材戰(zhàn)略儲備基地的建設，杉木的發(fā)展得到了高度重視，在杉木適生區(qū)正掀起一股人工林營造的高潮，良種苗木遠遠不能夠滿足市場的需求。杉木組織培養(yǎng)技術研究及推廣應用方面已有大量的報道。國內學者相繼報道了杉木組培嫩梢增殖與復壯的分析[3]，杉木組織培養(yǎng)繁殖體系建立研究[4]，杉木離體培養(yǎng)中的鈣、鎂效應[5]，杉木優(yōu)樹大量繁殖技術研究[6]，杉木優(yōu)良無性系組培快繁技術體系的建立[7]及速生優(yōu)良杉木組培繼代及生根培養(yǎng)研究[8]等內容的研究。本文以廣西杉木優(yōu)良無性系為研究對象，針對廣西良種杉木組培育苗過程中芽繼代培養(yǎng)增殖系數(shù)低，組培單芽扦插生根率低等問題，在蔡玲等杉木繼代芽增殖培養(yǎng)技術[9]和吳幼媚等杉木優(yōu)良無性系柳327組培不定根誘導技術[10]的研究基礎上，通過采用正交設計方法對培養(yǎng)基激素組合、培養(yǎng)室光照強度和溫度等條件進行優(yōu)化，旨在進一步提高組培繼代芽增殖系數(shù)和單芽扦插生根率，以增加杉木良種組培苗的生產量，降低其生產成本。

1　材料與方法

1.1材料

組培材料來自廣西林業(yè)科學院科技成果轉化中心，是以賀州黃洞林場的3年生杉木良種柳327嫁接無性系的幼林萌芽條為外植體，獲得其組培苗。

1.2方法

1.2.1芽增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗

在基本培養(yǎng)基改良1/2 MS培養(yǎng)基〔MS+200mg/LCa(NO3)2〕的基礎上，設計4個因素：6-BA、IBA、KT和VH(生物素)，3個水平，采用正交設計L9(34)布置試驗。共設計9個處理(表1)，每個處理接種30瓶(500mL的三角瓶)，每瓶接種芽5叢，每叢芽5～7株。重復3次，培養(yǎng)35d時統(tǒng)計新增芽數(shù)。芽增殖系數(shù)=新增芽數(shù)/接種芽總數(shù)。

表1　正交設計L9(34)試驗芽生長直觀分析

注：有效芽指繼代芽的高度不小于1.3 cm，葉展開數(shù)15～20片。

1.2.2繼代芽剪切方式的篩選

將繼代芽按A(叢芽內，芽高≥1.3cm的芽全部切除掉)、B(叢芽內，芽高≥1.3cm的芽切掉1/2)和C(不切除芽，按5～7株/叢的量分叢)3種方法切除后接入瓶內，接芽5叢/瓶，每叢芽5～7株。每個處理接種30瓶，培養(yǎng)35d時記錄有效芽數(shù)和芽生長發(fā)育的形態(tài)特征。有效芽的標準為高度≥1.3cm，葉展開數(shù)15～20片。

1.2.3生根培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗

選擇繼代35d，高≥1.3cm的壯芽進行不定根誘導培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基在改良1/2 MS培養(yǎng)基+IBA 2mg/L+IAA mg/L的基礎上，添加一定量的ABT6和KH2PO4。采用正交設計L9(34)方法布置試驗。9個處理(表2)，每個處理30瓶(200mL廣口瓶)，每瓶扦插20個組培單芽，重復3次，培養(yǎng)45d時統(tǒng)計苗木的生根率。生根率=組培單芽生根數(shù)/組培單芽扦插總數(shù)×100%。

表2　正交組合優(yōu)化單芽生根直觀分析

1.2.4光照強度和溫度對芽生根率的影響

將扦插好的壯芽分別置于光照強度為500～800Lx，1 000～2 000Lx，2 500～3 500Lx，2 500～6 000Lx，2500～7 000Lx，溫度為10～15℃，20～25℃，30～35℃組合成的9個環(huán)境進行培養(yǎng)(表3)。每個處理接種30瓶，每瓶接種20個單芽，3次重復，45d時統(tǒng)計平均生根率。

表3　培養(yǎng)室的溫度、光照條件對單芽生根影響的結果

注：同列內不相同字母表示經鄧肯氏新復極差法檢驗在p=0.05水平上差異顯著。

1.2.5其他培養(yǎng)條件

試驗時間2014年1月1日-12月30日，增殖培養(yǎng)基內含30g/L蔗糖、瓊脂粉4.6g/L，生根培養(yǎng)基內含20g/L蔗糖、瓊脂粉5.6g/L用1mol/LNaOH或HCl將培養(yǎng)基調至pH6.8,120℃的高溫和1.1Pa大氣壓條件下滅菌15min(增殖培養(yǎng)基)或20min(生根培養(yǎng)基)。除試驗外，培養(yǎng)室溫度25～28℃，光照1 000～6 000Lx，光照時間12～14h/d。

2　結果與分析

2.1芽增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化

杉木組培苗的繼代芽在1～9號培養(yǎng)基內，培養(yǎng)35d新芽增殖結果見表1。由表1R1、R2可以看出，對芽增殖影響由大到小依次為，6-BA>KT>VH>IBA；對有效芽形成影響由大到小依次為：6-BA=VH>KT>IBA，說明6-BA對芽的增殖和有效芽的培養(yǎng)均起著主導作用；添加KT能提高芽細胞分裂能力，有利于芽的增殖；添加VH對有效芽的培養(yǎng)有比較明顯的效果。從k1、k2來看,6-BA濃度為0.7mg/L、KT濃度為0.3mg/L、IBA濃度為0.1mg/L、VH濃度為60mg/L對芽的增殖系數(shù)和有效芽形成效果最好。根據(jù)正交試驗結果，初步確定杉木組培苗的快繁技術體系應含有0.7mg/L 6-BA+0.3mg/L KT+0.1mg/L IBA+60mg/L VH。處理7的芽增殖系數(shù)和有效芽數(shù)分別為5.2和25株/瓶，由此可見，7號組合為本試驗最理想的組合，6號次之，最差是1號組合，芽增殖系數(shù)和有效芽數(shù)分別僅2.5和5株/瓶。

2.2繼代芽剪切的方式對有效芽生長的影響

杉木組培苗的繼代芽轉接到新培養(yǎng)基時，剪切的方式對有效芽生長的影響結果見圖1。

3種剪切方式的有效芽平均數(shù)量由多到少依次為A(全部切掉芽)，B(芽切掉1/2)和C(不切除芽)。分析其原因，這是由于切除叢芽中一定量特定高度的單芽，增加了叢芽的透光度，降低了大芽對養(yǎng)分的消耗，有利于形成新的有效芽。

2.3生根培養(yǎng)基的優(yōu)化

將高度≥1.3cm的單芽接種于1～9號處理組合的培養(yǎng)基內，培養(yǎng)45d時統(tǒng)計組培苗的生根結果(表2)。不同的藥劑種類和濃度組合，組培單芽的生根率和苗木根系的數(shù)量存在差異。直觀分析結果表明，4個試驗因素，單芽生根率的R1極差大小排序為,IAA>ABT6>IBA>KH2PO4，苗木根系數(shù)量的R2極差大小排序為，IAA>ABT6>KH2PO4>IBA。分析結果表明，IAA對杉木組培單芽根系誘導和根系生長數(shù)量起著主導作用，IAA在1～3mg/L范圍內，隨著濃度的提高，平均生根率隨之增加，7號組合的生根率達到98.2%，其IAA濃度為3mg/L。ABT6，IBA和KH2PO4對杉木組培單芽根系誘導和根系生長數(shù)量的影響相對IAA較弱。IBA對苗木生根率的影響大于KH2PO4，而對根系數(shù)量的影響小于KH2PO4，說明添加IBA比較有利于杉木單芽根系的誘導，添加KH2PO4比較有利于根系的生長。表2顯示，7號組合生根效果最好，極差最大。根據(jù)正交試驗結果，初步確定杉木組培苗快繁技術體系應包含3mg/L IAA、1mg/L IBA、0.8mg/L ABT6、100mg/L KH2PO4。7號組合單芽生根率達98.2%，根系數(shù)量5.6條/株，也屬本試驗的最大值。理論與實踐結果一致。因此，7號組合是本試驗最理想的組合，達到了杉木組培苗產業(yè)化生產的技術要求。

注：A為高≥1.3cm的芽全部剪除；B為高≥1.3cm的芽剪除1/2；C為不剪芽。

2.4培養(yǎng)室溫度、光照強度對單芽生根的影響

將接種好的生根瓶苗分別置于9個光照強度和溫度組合的環(huán)境中培養(yǎng)，苗木生長45d時統(tǒng)計生根率結果見表3。

表3結果顯示，培養(yǎng)室溫度和光照條件對單芽的生根率具有顯著影響。試驗9個組合，培養(yǎng)室溫度偏低的1～3號組合，杉木組培苗的單芽始根時間最長，為27d；當培養(yǎng)室的溫度處于杉木生長適宜溫度20～25℃時，其單芽始根時間最短，15～19d，其中5號和6號組合15d。但當培養(yǎng)室溫度處于杉木生長偏高的溫度30～35℃時，苗木始根時間比組合4至組合6的平均始根時間長約6d。其單芽生根率大小排序為5>6>4>8>9>7>3>2>1。5號組合，單芽生根率高達98.3%，其次是6號，生根率90.3%。1號生根率僅23.2%。綜上所述，不同培養(yǎng)溫度對單芽生根率存在顯著性差異，溫度相同而光照強度不同，單芽生根率差異也顯著，說明只有當培養(yǎng)室的溫度處于杉木適宜生長溫度時，光照方能發(fā)揮較大的作用，即杉木單芽高生根率，不僅需要適宜的溫度條件，還需要較強的光照強度。本試驗最佳生根培養(yǎng)環(huán)境條件：培養(yǎng)室溫度20～25℃，光照強度2 500～6 000Lx；培養(yǎng)室溫度20～25℃，光照強度2 500～7 000Lx次之。

3　結論與討論

3.1結論

(1)6-BA對杉木組培苗芽的增殖起著主導作用，在6-BA濃度為0.7mg/L的基礎上，添加0.3mg/L KT、60mg/LVH和0.1mg/L IBA，能有效地促進細胞的分裂，提高杉木繼代芽的增殖系數(shù)，有效芽數(shù)量達到25株/瓶。

(2)繼代芽培養(yǎng)到35d后，培養(yǎng)基內營養(yǎng)將耗盡時，苗木生長緩慢或停止生長，此時必須將培養(yǎng)物轉接到新培養(yǎng)基上，否則苗木死亡。為了提高有效芽率，提高組培壯苗的產量，就繼代芽叢的剪切方法進行試驗，結果以A處理(全部切掉芽)效果良好，與不切芽相比較，其有效芽增加217%，大大降低了苗木生產的成本。A處理在芽轉接時，將高≥1.3cm的組培單芽全部剪除，一方面降低了大芽對培養(yǎng)基營養(yǎng)的消耗，提高了芽的透光度，促進嫩芽光合作用，充分利用培養(yǎng)基的營養(yǎng)快速生長，增加了有效芽；另一方面通過切斷芽的頂端優(yōu)勢，促進培養(yǎng)基細胞分裂素的循環(huán)速度，提高芽的增殖和生長。

(3)組培單芽不定根誘導和培養(yǎng)結果表明，IAA對杉木組培苗生根起著主導作用，在適宜IAA濃度的基礎上添加適量的ABT6和IBA，能有效地促進其單芽不定根的發(fā)生。

(4)杉木較喜光，但幼樹稍能忍耐側方蔽蔭。其生長量適宜的溫度條件為年平均氣溫16～19℃，然而，溫度條件偏高或偏低都不利于組培芽的生根。本試驗結果充分證明：當培養(yǎng)室溫度處于杉木生長偏低10～15℃時，芽活性下降，盡管將光照強度提高到2 500～3 500Lx，單芽的始根時間仍然較長，為27d，芽生根的效果不良，生根率僅41.6%。當培養(yǎng)室溫度為20～25℃時，適宜杉木組培苗生長，芽活性強，提高光照強度，能有效地縮短始根時間，僅15d，生根率也達到本試驗的最高值98.3%。

(5)本文通過組培快繁技術體系的優(yōu)化，廣西良種杉木組培快繁主要技術參數(shù)得到了有效提高。繼代芽增殖系數(shù)從4.8/35d[9]提高到5.2/35d；有效芽從21株/瓶[9]提高到38株/瓶；生根率從97.1%[10]提高到98.3%。

3.2討論

(1)為了降低苗木生產成本，在適宜IAA濃度的基礎上，僅添加ABT6或IBA，能否使杉木單芽生根率達到98.2%，有待進一步的研究。

(2)杉木組培快繁技術研究中發(fā)現(xiàn)，增殖芽在繼代過程中比較容易出現(xiàn)老化現(xiàn)象，造成組培苗造林后過早開花。如何通過改進組培技術，保持杉木組培增殖芽幼態(tài)化，延緩或遏制增殖芽老化有待進一步深入研究。

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The Production of Tissue Cultured Seedlings of Improved Varieties of Cunninghamia lanceolata

CAI Ling1,2,3,WU You-mei1,2,3,HUANG Jin-shi1,2,3,HUANG Yan4,HUANG Hong-xi1,2,3,WEI Li-dian5,MENG Jiang-chun5

(1.Guangxi Forestry Research Institute,Nanning Guangxi 530002,P.R.China;2.Key Laboratory of Central South Fast-growing Timber Cultivation of Forestry Ministry of China,Nanning Guangxi 530002,P.R.China;3.Guangxi Key Laboratory of Superior Timber Trees Resource Cultivation,Nanning Guangxi 530002，P.R.China;4.Nanning Arboretum, Nanning Guangxi 530031, P.R.China;5.Huashan Forest Farm, Huanjiang Guangxi 547106, P.R.China)

Using the clone of improved varieties ofCunninghamialanceolate,liu327 ,as the explant,several conditions such a hormone combination,light intensity,and temperature were optimized based on the method of orthogonal design in Guangxi in this study.The results showed that after subculture of 35 days,the proliferation of shoots was 5.2 fold and the number of effective buds was 38 plants per flask if single buds higher than 1.3 cm were cut off from clustered shoots and transferred to the modified 1/2MS medium + 0.7 mg/L 6-BA + 0.3mg/L KT + 0.1 mg/L IBA during the subculture of shoots.After rooting culture of 45 days with 20～25 ℃ temperature and 2 500～6 000Lx light intensity, the average of rooting percentage was 98.3%,each rooted plantlet has 5.6 roots and robust if single buds higher than 1.3 cm were cultured in the rooting medium with the modified 1/2MS medium+ 100 mg/LKH2PO4+ 3 mg/LIAA + 2 mg/LIBA + 0.8 mg/L ABT.This achieved the requirement for the commercial production of tissue cultured seedlings inCunninghamialanceolataand provided technical support for the rapid development of improved varieties ofCunninghamialanceolatain Guangxi.

Cunninghamialanceolata;improved varieties;tissue cultured seedlings;subculture;functional bud

2015-08-27

廣西2014年林業(yè)項目中林木良種資金——林木種質資源保存與利用(桂農[2014]51號),廣西林業(yè)科技項目(桂林科字[2012])。

蔡玲(1963-)，女，教授級高工，主要從事林木生物技術研究工作。E-mail：2496880519@qq.com

S 791.27

A

1672-8246(2016)04-0035-05

doi:10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.04.006