H2228細(xì)胞和EML4-ALK陽性肺癌組織中SOCS3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究

劉春來 李永文 董云龍 張洪兵 李穎 劉紅雨 陳軍

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤，總的5年生存率僅10%左右[1-3]?，F(xiàn)在的研究[4-10]表明，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、KRAS（kirsten rat sarcoma viral oncogene,K-ras）、人類棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4（echinoderm microtubule-associated- protein-like 4,EML4）和人類間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）重排形成的融合基因EML4-ALK等基因是肺癌發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動(dòng)基因（driver gene），應(yīng)用針對(duì)這些驅(qū)動(dòng)基因及信號(hào)通路的藥物進(jìn)行分子靶向治療，在取得明顯療效的同時(shí)又避免對(duì)正常細(xì)胞傷害，顯示了誘人的治療前景。EML4-ALK融合基因2007年由日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)，定位于2號(hào)染色體的短臂上（2p21和2p23）[5]。在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）人群中EML4-ALK陽性率約為3%-7%左右，但在女性、無或僅少量吸煙史的肺腺癌患者中EML4-ALK融合基因陽性率高達(dá)15%[11]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示EML4-ALK融合基因具有潛在致瘤性，是肺癌發(fā)生的驅(qū)動(dòng)基因，但其致瘤機(jī)制尚未闡明。EML4-ALK融合基因陽性患者對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）原發(fā)性耐藥，而可能對(duì)ALK抑制劑有效[12,13]。2011年8月美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)ALK抑制劑克唑替尼用于局部晚期或轉(zhuǎn)移性ALK陽性NSCLC的一線治療，對(duì)于ALK陽性的NSCLC患者，克唑替尼顯示出了一定的治療活性，并可延長(zhǎng)患者的生存期，其無進(jìn)展生存期為9.7個(gè)月，但是，克唑替尼與EGFR-TKI一樣，使用一段時(shí)間后會(huì)產(chǎn)生獲得性耐藥，而揭示EML4-ALK的致瘤機(jī)理對(duì)EML4-ALK患者的治療及克服耐藥將產(chǎn)生重要作用[6,9]。

細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（suppressor of cytokine signaling, SOCS）是一類在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用的負(fù)調(diào)控因子，主要通過抑制JAK-STAT（janus protein tyrosine kinase, signal transducers and activators of transcription）等信號(hào)通路的持續(xù)激活來調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[14-16]。由于JAK-STAT信號(hào)通路是多種腫瘤驅(qū)動(dòng)基因重要下游信號(hào)通路，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，SOCS啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，包括肝癌、胃癌、肺癌和血液系統(tǒng)腫瘤等，但是在EML4-ALK融合基因陽性肺癌中的情況卻未見報(bào)道[17-21]。本研究的目的在于探討人類EML4-ALK融合基因陽性肺癌組織和細(xì)胞中SOCS3啟動(dòng)子異常甲基化情況，為進(jìn)一步闡明SOCS3在EML4-ALK陽性肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要儀器 人NSCLC細(xì)胞株H2228細(xì)胞，A549細(xì)胞購于ATCC、人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞、人胚胎腎上皮細(xì)胞HEK293細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津市肺癌研究所保存；7例ALK陽性患者來自于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肺部腫瘤外科的手術(shù)病例。RMPI1640和DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及Trizol試劑購自Life Technologies公司（Carlsbad, CA, USA）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、Premix Ex TaqHotstart Version購自Takara公司（Dalian, China）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司（Madison, WI, USA）；QIAampDNA Mini Kit和EpiTect Bisulfite Kit購自Qiagen公司（Hilden, Germany）；甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5’-氮雜-2’-脫氧胞苷（5’-Aza-dC）購自Sigma-Aldrich公司（Kansas, Missouri, USA）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 除HEK293細(xì)胞用含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的DMEM（dulbecco's modified eagle medium）培養(yǎng)，其他細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿，37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，0.25%胰酶-EDTA（ethylenediamine tetracetic acid）消化傳代，所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。5’-Aza-dC溶于二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）溶液中，10 μmoL/L處理6孔板中細(xì)胞（每孔2×105細(xì)胞），每個(gè)濃度3個(gè)孔，處理72 h。

1.3 組織及細(xì)胞DNA提取 細(xì)胞及組織按QIAamp DNA Mini Kit說明書步驟進(jìn)行DNA提取，DNA提取后瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA純度，并用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。

1.4 甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR, MSP）

1.4.1 基因組DNA亞硫酸鹽修飾分別取800 ng DNA按照EpiTect Bisulfite Kit（QINGEN）的說明書進(jìn)行亞硫酸鹽處理，反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，處理?xiàng)l件：99 ℃、5 min，60 ℃、25 min，99 ℃、5 min，60 ℃、85 min，99℃、5 min，60 ℃、175 min，最后置20 ℃不超過24 h。純化回收的DNA -20 ℃保存?zhèn)溆?，用于甲基化特異PCR分析。

1.4.2 MSP-PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物的凝膠純化取20 ng DNA為模板進(jìn)行啟動(dòng)子目的片段的擴(kuò)增。采用巢式PCR法，第一輪PCR引物序列為： SOCS3-F 5'-GATTYGAGGGGGTTTAG TTTTAAGGA-3'，SOCS3-R 5'-CCACTACCCCAAAAACCC TCTCCTAA-3'，反應(yīng)條件為：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，設(shè)置降落PCR，每個(gè)循環(huán)降落0.5 ℃，14個(gè)循環(huán)；再加20個(gè)循環(huán)的95 ℃、30 s，53 ℃、30 s，72 ℃、30 s。第二輪PCR取1 μL第一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，甲基化引物序列為：M-F 5'-GGAGATTTTAGGTTTTCGGAATATTTC-3'，M-R 5'-CCCCCGAAACTACCTAA ACGCCG-3'，非甲基化引物序列為U-F 5'-GTTGGAGATTT TAGGTTTTTGGAATATTTT-3'，U-R 5'-AAACCCCCAAAA CTACCTAAACACCA-3'，反應(yīng)條件：95 ℃、5 min，95℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定，并設(shè)以雙蒸水為模板的陰性對(duì)照。

1.4.3 亞硫酸鹽測(cè)序上述PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，交由北京華大基因公司測(cè)序，根據(jù)甲基化位點(diǎn)的個(gè)數(shù)計(jì)算分析SOCS3基因啟動(dòng)子甲基化水平。

1.5 Real-time PCR Trizol法常規(guī)提取5'-Aza-dC處理細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀定量，以Reverse Transcriptase Kit（Promega）將2 μg RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。20 ng cDNA為模板，與ABI SYBR Green Master Mix （ABI）及相應(yīng)引物混合，置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System instrument and software（Applied Biosystems, USA）進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃、20 s；40個(gè)PCR循環(huán)（95 ℃、10 s；60 ℃、20 s；72 ℃、10 s）。以PGK作為內(nèi)參照，未處理樣本作為矯正因子，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析，ΔCT=CT-CT（PGK），ΔΔCT=ΔCT（24 h、48 h、72 h）-ΔCT（0 h）（H2228、A549、H460、B2B）[22]。

1.6 蛋白免疫印跡（Western blot） RIPA裂解收集細(xì)胞蛋白溶液，BCA法測(cè)濃度，與5×SDS-PAGE蛋白緩沖液充分混勻，100 ℃煮沸10 min使蛋白變性后，取30 μg蛋白上樣量上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，100 V轉(zhuǎn)膜65 min、5%脫脂牛奶的1×TBST中室溫封閉1 h，加入鼠抗人SOCS3單克隆抗體，1：500稀釋，4 ℃孵育過夜。加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，顯色曝光[23]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，同一細(xì)胞系兩組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOC3啟動(dòng)子區(qū)CpG島的查找及MSP引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用USUC數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)人SOCS3 DNA啟動(dòng)子序列并獲取啟動(dòng)子上游2,000 bp，再通過MethPrimer在線分析網(wǎng)站和Methyl Primer Expressv 1.0軟件分析這段序列的CPG島，采用標(biāo)準(zhǔn)：堿基對(duì)＞300，GC＞50%，觀察值/預(yù)測(cè)值＞0.6。結(jié)果顯示SOCS3啟動(dòng)子的CpG島長(zhǎng)度545 bp，位于871 bp-1,415 bp。通過Methyl Primer Expressv 1.0軟件設(shè)計(jì)出PCR引物。

2.2 MSP法檢測(cè)細(xì)胞和肺癌腫瘤組織中SOCS3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài) 提取7例EML4-ALK陽性肺癌患者腫瘤組織和EML4-ALK陽性腫瘤細(xì)胞H2228、EML4-ALK陰性腫瘤細(xì)胞A549、HEK-293細(xì)胞、人胎盤細(xì)胞的DNA，應(yīng)用重亞硫酸鹽處理，未甲基化的胞嘧啶（C）將轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），而甲基化的胞嘧啶（C）不變。將上述經(jīng)重亞硫酸鹽處理后的DNA用MSP引物擴(kuò)增，來檢測(cè)SOCS3啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況。圖1所示MSP結(jié)果顯示H2228細(xì)胞、A549細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞、H460細(xì)胞和7例腫瘤組織中的3例SOCS3啟動(dòng)子區(qū)存在不同程度的甲基化，BEAS-2B細(xì)胞及人胎盤組織細(xì)胞中不存在SOCS3啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測(cè)序分析，證實(shí)SOCS3啟動(dòng)子區(qū)存在DNA甲基化（圖2）。

2.3 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5’-Aza-dC處理，上調(diào)SOCS3表達(dá)為了進(jìn)一步探討DNA甲基化對(duì)SOCS3表達(dá)的調(diào)控情況，我們用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5’-氮雜-2’-脫氧胞苷（5’-AzadC）處理上述細(xì)胞。以10 μm/孔連續(xù)處理不同的細(xì)胞72 h后分別提取RNA和蛋白，用Real-time PCR及Western blot檢測(cè)SOCS3表達(dá)水平的變化情況，以DMSO處理組作為對(duì)照組。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，A549細(xì)胞和H2228細(xì)胞中SOCS3的表達(dá)水平有明顯提高，分別提高了4.97倍（P＜0.05）和3.66（P＜0.05）倍。而在BEAS-2B細(xì)胞和H460細(xì)胞中SOCS3的表達(dá)則變化不明顯甚至表現(xiàn)為降低（圖3）。進(jìn)一步通過Western blot來驗(yàn)證去甲基化處理后SOCS3表達(dá)水平的變化，結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果一致（圖4）。

3 討論

SOCS3是經(jīng)典的JAK-STAT信號(hào)通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白之一，其可以通過抑制STAT的磷酸化及其二聚體的形成或者直接抑制JAK的磷酸化來負(fù)向調(diào)節(jié)JAK-STAT通路，從而抑制細(xì)胞的持續(xù)增殖和分化[14,16,24,25]。SOCS功能異常導(dǎo)致其對(duì)JAK-STAT通路的抑制作用隨之消失，而啟動(dòng)子異常甲基化是SOCS3功能異常的重要機(jī)制。

SOCS家族分子的超甲基化在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，如肺癌、肝癌、前列腺癌、食管癌等[26-29]。比如，日本的學(xué)者用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡的方法發(fā)現(xiàn)肝癌組織中SOCS3的表達(dá)低于正常肝組織，并且通過特異性敲除小鼠SOCS3基因，使得SOCS3對(duì)STAT3的抑制作用消失導(dǎo)致STAT3持續(xù)活化，其抗細(xì)胞凋亡的作用隨之增強(qiáng)，致癌物誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的作用也隨之增加，證明了超甲基化導(dǎo)致的SOCS3表達(dá)缺失與肝癌的發(fā)生有關(guān)[20]。

我們的研究證實(shí)在EML4-ALK陽性細(xì)胞H2228及部分EML4-ALK陽性患者腫瘤組織中存在SOCS3基因的異常甲基化，轉(zhuǎn)甲基化酶抑制劑5’-Aza-dC處理能在mRNA水平和蛋白水平增加SOCS3的表達(dá)，MSP及基因測(cè)序分析進(jìn)一步證實(shí)這些細(xì)胞中存在異常甲基化修飾。因此，在上述肺癌細(xì)胞中SOCS3的表達(dá)受異常甲基化調(diào)控。

由于SOCS蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)在已經(jīng)有學(xué)者嘗試將SOCS家族蛋白激活劑用于臨床前研究，并取得了一定的進(jìn)展，比如，有研究[15,18,30,31]指出腫瘤的治療中激活SOCS后再用JAK抑制劑的效果比單用JAK激酶抑制劑的效果要好；Kim等[30,32,33]學(xué)者發(fā)現(xiàn)恢復(fù)SOCS1和SOCS3的表達(dá)能夠增加宮頸癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性；在NSCLC中也發(fā)現(xiàn)恢復(fù)SOCS3的表達(dá)不僅能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而且還能增加其對(duì)放療的敏感性。因此提示針對(duì)SOCS的靶向治療的研究，將會(huì)為腫瘤靶向治療提供新的思路。

圖1 MSP方法檢測(cè)肺癌細(xì)胞株及EML4-ALK陽性肺癌樣品中SOCS3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。M：甲基化特異；U：非甲基化特異Fig 1 MSP assay for SOCS3 promoter in different lung cancer cell lines and EML4-ALK (+) lung cancer tissues.M：methylated-specific; U:unmethylated-specific.

圖2 H2228細(xì)胞SOCS3啟動(dòng)子MSP分析后測(cè)序驗(yàn)證Fig 2 The MSP result of SOCS3 promotor were verified by DNA sequencing in H2228 cells

圖3 Real-time PCR檢測(cè)5'-Aza-dC處理不同肺癌細(xì)胞后，SOCS3表達(dá)水平的變化情況。*P＜0.05Fig 3 The analysis of SOCS3 expression by Realtime PCR in human lung cancer cell lines after 5'-Aza-dC treatment.*P＜0.05

圖4 Western blot檢測(cè)肺癌細(xì)胞株經(jīng)5'-Aza-dC處理后SOCS3表達(dá)水平的變化Fig 4 The analysis of SOCS3 expression by Western blot in human lung cancer cell lines after 5'-Aza-dC treatment