UPLC-MS法同時(shí)測定牛奶中磺胺類、喹諾酮類、甾體激素類及四環(huán)素類獸藥殘留

李　寧，張玉龍，林　濤，王繼良，劉宏程*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)　藥學(xué)院，云南　昆明　650500；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南　昆明　650223)

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UPLC-MS法同時(shí)測定牛奶中磺胺類、喹諾酮類、甾體激素類及四環(huán)素類獸藥殘留

李寧1,2，張玉龍1,2，林濤2，王繼良1，劉宏程2*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，云南昆明650500；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南昆明650223)

建立并優(yōu)化了同時(shí)測定牛奶中10種磺胺類、6種喹諾酮類、8種甾體激素類以及1種四環(huán)素類藥物共25種獸藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品中目標(biāo)藥物經(jīng)5%乙酸乙腈提取，HLB固相萃取小柱凈化后，通過UPLC-MS測定，外標(biāo)法定量。25種獸藥在不同加標(biāo)濃度下的回收率為61.6%～119.2%，組內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%～13.4%，組間RSD為5.8%～14.2%，方法檢出限為0.5～2.0 μg/kg。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；牛奶；獸藥殘留；磺胺類；喹諾酮類；甾體激素類；四環(huán)素類

作為現(xiàn)代人們生活中不可或缺的食品之一，牛奶的營養(yǎng)價(jià)值得到了廣泛認(rèn)可和推崇。但部分生產(chǎn)者為了控制奶牛疾病，盲目而大量地使用各類獸藥，長此以往造成細(xì)菌和病毒產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致只能增大劑量或同時(shí)使用多種藥物，形成了惡性循環(huán)。還有一些生產(chǎn)者為了增加產(chǎn)量和提高生產(chǎn)效率，對(duì)奶牛使用各種甾體激素類藥物，而該類藥物的脂溶性較大，易分泌進(jìn)入牛奶中，成為直接導(dǎo)致兒童性早熟及性發(fā)育異常的重要因素[1-2]。我國農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告僅對(duì)5種甾體激素類藥物的殘留限量做出了規(guī)定[3]，鑒于生產(chǎn)者用藥的多樣性及復(fù)雜性，建立一種能夠同時(shí)快速測定多種獸藥殘留的分析檢測方法勢在必行。

目前國內(nèi)牛奶中獸藥殘留的檢測方法大多是針對(duì)抗菌抗病毒藥物[4-9]，也有部分檢測甾體激素類藥物的報(bào)道[10-13]，但鮮有同時(shí)檢測抗菌藥物與甾體激素類藥物的方法，尤其是本實(shí)驗(yàn)中3類(磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類)廣泛使用的抗菌代表性藥物與危害性日漸增長的甾體激素類藥物同時(shí)檢測的方法。

超高效液相色譜法因其分離效率高、柱效高、耗液少等優(yōu)點(diǎn)受到了研究者的青睞[14]。本研究采用的Waters QDa質(zhì)譜檢測器可與色譜分析儀器完美兼容，且經(jīng)過預(yù)先優(yōu)化，可在穩(wěn)定處理各種分析的同時(shí)降低意外共流出物或成分所帶來的風(fēng)險(xiǎn)。該儀器方法將保留時(shí)間和質(zhì)譜分析相結(jié)合，為化合物鑒定提供了更優(yōu)的分析選擇性，可在無需高端質(zhì)譜儀的情況下提供分子信息和高質(zhì)量定性質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用SIR選擇性檢測模式可實(shí)現(xiàn)可靠的定量檢測。通過質(zhì)譜檢測分析確認(rèn)痕量成分，進(jìn)而提升分析的質(zhì)量和效率，實(shí)現(xiàn)完整快速的色譜分離及化合物鑒定，簡化了實(shí)驗(yàn)室藥品分析的工作流程。實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化建立了一種能夠同時(shí)快速測定多種抗菌藥物及甾體激素類藥物的分析檢測方法，給日常分析檢測工作提供借鑒的同時(shí)為國家制定食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)及檢測方法提供了參考。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Waters H-class超高效液相色譜儀、QDa質(zhì)譜儀、BEH C18(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)色譜柱均購自美國Waters公司，電子天平(瑞士梅特勒公司)，渦旋混勻器(海門市其林貝爾儀器有限公司)，KQ-500DB超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，氮?dú)獯蹈蓛x(美國Organomation Associates)。

乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)，乙酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制25種標(biāo)準(zhǔn)藥物儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確稱取每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用甲醇配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃冰箱保存。

25種標(biāo)準(zhǔn)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確移取適量每種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液混合，用甲醇配成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃冰箱保存。

Na2EDTA緩沖溶液:準(zhǔn)確稱取1.29 g檸檬酸、1.09 g磷酸氫二鈉、3.72 g Na2EDTA-2H2O，加超純水90 mL溶解，用氫氧化鈉固體調(diào)至pH 6.0左右，定容至100 mL保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2樣品前處理樣品制備:購于超市的純牛奶于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

提取:稱取5 g牛奶試樣于50 mL離心管中，加入5 mL Na2EDTA緩沖溶液(pH 6.0)，渦旋混勻1 min，45 ℃水浴超聲3 min，加入10 mL 5%乙酸乙腈和2 g氯化鈉、4 g無水Na2SO4，渦旋混勻1 min，超聲提取5 min，5 000 r/min高速離心5 min，取上清液待凈化。

凈化:移取上清液于10 mL具刻度玻璃管中，40 ℃下氮?dú)鉂饪s至近干，加入5 mL 緩沖液溶解稀釋，待上樣。HLB固相萃取小柱依次經(jīng)6 mL甲醇、6 mL水、3 mL緩沖溶液活化，取稀釋液上樣，6 mL水淋洗，正壓擠干或負(fù)壓抽干小柱，8 mL甲醇-乙酸乙酯洗脫液(3∶7)洗脫，收集洗脫液，40 ℃下氮?dú)鉂饪s吹干，1 mL甲醇定容，渦旋混勻1 min，過0.22 μm濾膜，待分析。

1.2.3超高效液相色譜-質(zhì)譜條件超高效液相色譜條件:C18高效液相色譜柱(Waters BEH C181.7 μm×2.1 mm×50 mm)；載氣為高純氮?dú)?≥99.999%)；流動(dòng)相:A為甲醇，B為含10 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積1 μL；梯度洗脫步驟為:0～1 min，0～10%A；1～6 min，10%～60%A；6～7 min，60%～80%A；7～8 min，80%～10%A。

質(zhì)譜條件:檢測器:Waters QDa質(zhì)譜儀；離子源:ESI源；掃描方式:正離子SIR掃描；掃描質(zhì)量數(shù)范圍為m/z30～500；采樣速率8點(diǎn)/s；毛細(xì)管電壓:0.8 kV；錐孔電壓:15 V。

2　結(jié)果與討論

2.1色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)選用BEH C18(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)色譜柱分離目標(biāo)化合物以達(dá)到有效分離的目的。由于磺胺類、喹諾酮類和四環(huán)素類藥物均呈酸堿兩性，流動(dòng)相pH值對(duì)保留和分離的影響大。實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水和乙腈-水作流動(dòng)相時(shí)的峰形和響應(yīng)，以及甲酸、甲酸銨和乙酸銨的離子化效率，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%甲酸水溶液(含1 mmol/L乙酸銨)作流動(dòng)相時(shí)離子化效率高，峰形好，響應(yīng)較高(見圖1)。酸度過低會(huì)出現(xiàn)峰拖尾，過高則分離效果差。

本實(shí)驗(yàn)采用Waters QDa質(zhì)譜檢測器，操作簡便，能夠降低共流出物或基質(zhì)本身的干擾，雖然靈敏度與三重四極桿質(zhì)譜儀有一定的差距，但與紫外檢測器相比，能夠明顯減少雜質(zhì)峰，同時(shí)可在較短的時(shí)間內(nèi)完成儀器的自檢及調(diào)諧，快捷方便，基本能滿足常規(guī)檢測要求。

2.2提取條件的優(yōu)化

目標(biāo)化合物均易溶于丙酮、乙腈等非極性或中等極性溶劑，而乙腈具有較好的蛋白沉淀作用，有利于提取，因此選用乙腈作為提取溶劑，且以5%酸化乙腈對(duì)目標(biāo)化合物的提取更優(yōu)。當(dāng)僅用酸化乙腈提取時(shí)發(fā)現(xiàn)喹諾酮類和四環(huán)素類藥物基本未檢出，這是由于喹諾酮類藥物分子結(jié)構(gòu)中的3-羧基和4-羰基可與Ca2+,Mg2+,Al3+,Zn2+等金屬離子螯合，四環(huán)素類藥物同樣容易與金屬離子螯合而影響提取效果，所以考慮加入EDTA緩沖溶液。一方面EDTA緩沖液可與基質(zhì)中的金屬離子螯合而使目標(biāo)化合物分布到有機(jī)相中，且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲水浴30～40 ℃對(duì)EDTA和金屬離子的螯合置換過程有一定幫助；另一方面，緩沖溶液起到了稀釋基質(zhì)的作用，一定程度上減小了基質(zhì)效應(yīng)的影響。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)緩沖溶液的pH值對(duì)提取效果有很大影響，分別考察了pH 4.0，7.0，9.0時(shí)的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于磺胺、喹諾酮和四環(huán)素均屬于兩性化合物，因此過酸和過堿都不利于提取，而pH值對(duì)雌激素的影響則較小。此外，酸堿環(huán)境對(duì)3類化合物的影響大小也不同，其中酸性環(huán)境對(duì)于磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的影響大于堿性環(huán)境，而四環(huán)素類藥物則反之。在近中性條件下，目標(biāo)化合物更易與金屬離子形成不溶性絡(luò)合物，因此最終選擇pH 6.0的EDTA緩沖溶液進(jìn)行后續(xù)考察。

2.3凈化條件的優(yōu)化

2.4線性范圍與檢出限

在最佳儀器條件下，配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以定量離子峰面積對(duì)其濃度進(jìn)行線性回歸分析，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以牛奶空白基質(zhì)進(jìn)行檢出限(LOD=3m1h0/(m0h1)，m1和h1分別表示加標(biāo)量和化合物峰高；m0和h0分別表示牛奶基質(zhì)量和基線高度)和定量下限(LOQ=3LOD)計(jì)算，結(jié)果如表1所示。25種目標(biāo)藥物在1～50 μg/kg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，LOD為0.5～2.0 μg/kg，LOQ為1.5～6.0 μg/kg。

表1　25種目標(biāo)藥物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限

2.5回收率與精密度

以鮮牛奶和普通牛奶進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)，分別以1LOQ,5LOQ和10LOQ作為加標(biāo)水平，每個(gè)水平平行試驗(yàn)6次，結(jié)果如表2所示。25種目標(biāo)藥物的平均回收率為61.6%～119.2%，組內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%～13.4%，組間RSD為5.8%～14.2%。鮮牛奶的回收率普遍低于普通純牛奶，分析其原因可能與蛋白量、含鈣量等基質(zhì)成分有關(guān)，但基本滿足日常分析對(duì)牛奶中目標(biāo)藥物的測定要求。

表2　25種獸類藥物不同加標(biāo)水平下的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

(續(xù)表2)

2.6實(shí)際樣品的測定

隨機(jī)抽取在售的鮮牛奶和純牛奶各18份，采用本方法測定，在1份純牛奶樣品中檢出磺胺間二甲氧嘧啶21.5 μg/kg，1份純牛奶樣品中檢出磺胺甲基嘧啶10.6 μg/kg、恩諾沙星15.3 μg/kg，但均未超過我國農(nóng)業(yè)部限量標(biāo)準(zhǔn)；1份鮮牛奶樣品中檢出孕酮4.5 μg/kg，我國農(nóng)業(yè)部未對(duì)其作出限量規(guī)定，但未超過美國規(guī)定的5 μg/kg限量標(biāo)準(zhǔn)，其他樣品未見檢出。

3　結(jié)　論

本研究建立了牛奶中10種磺胺類、6種喹諾酮類、8種甾體激素類和1種四環(huán)素類共25種獸類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，優(yōu)化了固相萃取法的樣品前處理?xiàng)l件。該方法操作較簡便，靈敏度高，可滿足牛奶中25種獸類藥物的痕量分析要求，尤其適于實(shí)驗(yàn)室外的分析檢測。

[1]Lan J L,Nian J Q,Yang X B.ChinaDairy(蘭建麗,粘靖祺,楊曉波.中國乳業(yè)),2014,150:45.

[2]Ye A L,Yang Y,Zhang J,Liu M,Hou L J,Zhou J L.J.Chromatogr.A,2013,1278:126-132.

[3]Liu H C,Li N,Lin T,Shao J L,Li Q W.Chin.J.Chromatogr.(劉宏程,李寧,林濤,邵金良,黎其萬.色譜),2015,33(11):1163-1168.

[4]Meng J,Yang Y H.Chin.J.FoodHyg.(孟娟,楊永紅.中國食品衛(wèi)生雜志),2012,30(6):560-567.

[5]Ban F G,Hu X J,Wu N P,Peng L,Meng L,Zhou H X,Mao J H.Chin.J.Veter.Drug(班付國,胡興娟,吳寧鵬,彭麗,孟蕾,周紅霞,毛建輝.中國獸藥雜志),2014,48(6):40-51.

[6]Fang H W,Lu Y P,Zhou Y,Jiang X M,Yang Y.J.Instrum.Anal.(方慧文,盧躍鵬,周原,江小明,楊永.分析測試學(xué)報(bào)),2013,32(2):262-266.

[7]Xiong C L,Guo P,Zhan C R,Liu G B,Wan J C.J.Instrum.Anal.(熊春蘭,郭平,占春瑞,劉光斌,萬建春.分析測試學(xué)報(bào)),2013,32(2):193-198.

[8]Guo D H,Deng X J,Zhao S Z,Zhu J,Xia C F,Chen S S,Song Y.Chin.J.Anal.Chem.(郭德華,鄧曉軍,趙善貞,朱堅(jiān),夏崇菲,陳舜勝,宋越.分析化學(xué)),2010,38(3):318-324.

[9]Wang L,Li Y Q,Wang H B,Guan Y L.Chin.J.Anal.Chem.(王煉,黎源倩,王海波,官艷麗.分析化學(xué)),2011,39(2):203-207.

[10]Luo H T,Huang X L,Wu H Q,Zhu Z X,Huang F,Lin X S.J.Instrum.Anal.(羅輝泰,黃曉蘭,吳惠勤,朱志鑫,黃芳,林曉珊.分析測試學(xué)報(bào)),2011,30(12):1329-1337.

[11]Liu H C,Zou Y H,Li Q W,Er Z.Chin.J.Anal.Chem.(劉宏程,鄒艷紅,黎其萬,佴注.分析化學(xué)),2008,36(2):245-248.

[12]Xue M,Wang A,Wang Y,Wang D,Lü Z,Meng Z H,Zhang W B.Chin.J.Anal.Chem.(薛敏,王安,王瑜,王丹,呂稚,孟子暉,張維冰.分析化學(xué)),2011,39(6):793-798.

[13]Tang X S,Zhang Q X,Du X F,Chen W.Sci.Technol.FoodInd.(唐曉姝,張秋香,杜先鋒,陳衛(wèi).食品工業(yè)科技),2013,34(6):53-56.

[14]John O M,Lesa C,Michelle W,Richard O K,Steven J L,Martin D.J.Chromatogr.A,2013,1292:83-95.

Analysis of Sulfonamide,Quinolones,Steroid Hormones and Tetracyclines Residues in Milk by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

LI Ning1,2，ZHANG Yu-long1,2，LIN Tao2，WANG Ji-liang1，LIU Hong-cheng2*

(1.School of Pharmaceutical Science,Kunming Medical University,Kunming650500,China；2.Institute of Agricultural Quality Standard & Testing Technique,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming650223,China)

A comprehensive method was developed and optimized for the simultaneous analysis of sulfonamides,quinolones,steroid hormones and tetracycline by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS).The veterinary drugs in milk samples were extracted with 5% acetic acid-acetonitrile solution,and then the mixture was centrifuged.The supernatant was purified with an HLB solid phase extraction column,and analysed by UPLC-MS and quantified by the external standard method.Average recoveries of 25 veterinary drugs at three spiked levels ranged from 61.6% to 119.2% with relative standard deviations(RSDs) of 2.5%-13.4%.The method limits of detection(LOD) for target compounds were in the range of 0.5-2.0 μg/kg.

ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS);milk;veterinary drugs residues；sulfonamides;quinolones；steroid hormones;tetracycline

2015-11-25；

2015-12-16

云南省科技惠民計(jì)劃(2013RA012)；云南省科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)計(jì)劃(2014DA001)

劉宏程，博士，研究員，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，Tel:0871-65160403，E-mail:liuorg@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.014

O657.63;O629.8

A

1004-4957(2016)06-0714-05