米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞骨橋蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)的影響

楊 眉，蔣春樊，哈春芳

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·論著·

·專(zhuān)題研究·

米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞骨橋蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)的影響

楊 眉，蔣春樊，哈春芳

背景目前子宮內(nèi)膜異位癥的治療方法仍比較有限，而米非司酮在臨床上可用于治療子宮內(nèi)膜異位癥，但其具體機(jī)制尚未明確。目的探討米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中骨橋蛋白(OPN)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)的影響。方法選取2014年8月—2015年3月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦科因卵巢巧克力囊腫行卵巢囊腫剝除術(shù)或患側(cè)附件切除術(shù)的子宮內(nèi)膜異位癥患者21例為研究對(duì)象。按照術(shù)前是否接受米非司酮治療將其分為米非司酮組(11例)和對(duì)照組(10例)。獲取所有患者在位、異位內(nèi)膜組織，采用免疫組化法檢測(cè)其中OPN、MMP-9表達(dá)水平；取對(duì)照組患者在位子宮內(nèi)膜組織，培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，以不同劑量(0、0.1、1.0、10.0 mmol/L)米非司酮進(jìn)行干預(yù)，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9表達(dá)水平。結(jié)果米非司酮組在位、異位內(nèi)膜組織中OPN、MMP-9表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.05)。0.1 mmol/L、1.0 mmol/L米非司酮干預(yù)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9 mRNA表達(dá)水平低于0 mmol/L(P<0.05)；1.0 mmol/L、10.0 mmol/L米非司酮干預(yù)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9 mRNA表達(dá)水平高于0.1 mmol/L(P<0.05)；10.0 mmol/L米非司酮干預(yù)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9 mRNA表達(dá)水平高于1.0 mmol/L(P<0.05)。結(jié)論米非司酮可明顯下調(diào)子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜中OPN、MMP-9表達(dá)水平，從而抑制子宮內(nèi)膜的侵襲、黏附以及種植性轉(zhuǎn)移。

子宮內(nèi)膜異位癥；米非司酮；骨橋蛋白質(zhì)；基質(zhì)金屬蛋白酶9

楊眉，蔣春樊，哈春芳.米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞骨橋蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)的影響[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(24)：2925-2929.[www.chinagp.net]

YANG M,JIANG C F,HA C F.Influence of mifepristone on the expression of osteopontin and matrix metalloproteinase 9 in the endometrium epithelial cells of patients with endometriosis[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2925-2929.

子宮內(nèi)膜異位癥是一種婦科常見(jiàn)疾病，以子宮內(nèi)膜的異位黏附、侵襲為特點(diǎn)[1-2]。本課題組前期研究證明，骨橋蛋白(OPN)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵性作用[3-4]。臨床上米非司酮可以用于治療子宮內(nèi)膜異位癥，但其具體機(jī)制尚未明確[5-6]。為此，本研究分析米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步明確米非司酮治療子宮內(nèi)膜異位癥的分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)為Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥；(2)處于月經(jīng)分泌期。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并重大內(nèi)科疾病及有激素治療史患者。

1.2研究對(duì)象選取2014年8月—2015年3月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦科因卵巢巧克力囊腫行巧克力囊腫剝除術(shù)或患側(cè)附件切除術(shù)的子宮內(nèi)膜異位癥患者21例為研究對(duì)象，年齡21～49歲，平均年齡(34.2±5.4)歲；術(shù)前給予米非司酮治療(10 mg/d，1次/d，療程3個(gè)月)11例(米非司酮組)，未進(jìn)行藥物治療10例(對(duì)照組)。子宮內(nèi)膜異位癥診斷經(jīng)2位病理科醫(yī)師復(fù)診明確。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.3研究方法

1.3.1獲取內(nèi)膜組織術(shù)中行診刮術(shù)獲取在位、異位內(nèi)膜組織。

1.3.2免疫組化法檢測(cè)在位、異位內(nèi)膜組織中OPN、MMP-9表達(dá)水平收集在位、異位內(nèi)膜組織，用4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，二甲苯脫蠟，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。加入小鼠抗人OPN及MMP-9單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司，均為1∶100稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。DAB顯色，顯微鏡下等同條件下觀察并拍照。應(yīng)用Image-Pro Rlus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)

本研究?jī)r(jià)值：

目前子宮內(nèi)膜異位癥的治療方法仍比較有限，米非司酮在臨床上可用來(lái)治療子宮內(nèi)膜異位癥，但其具體機(jī)制尚未明確。本研究證明，米非司酮可下調(diào)子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜中OPN、MMP-9表達(dá)水平，從而抑制子宮內(nèi)膜的侵襲、黏附以及種植性轉(zhuǎn)移。這有助于推動(dòng)藥物治療子宮內(nèi)膜異位癥的新進(jìn)展，為后續(xù)對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥從機(jī)制上進(jìn)行有效的藥物干預(yù)、指導(dǎo)臨床治療和隨訪(fǎng)提供依據(jù)。

行分析，每張切片選取5個(gè)高倍鏡(×400)視野，分別計(jì)算每高倍鏡視野下的OPN、MMP-9的IOD值，即OPN、MMP-9表達(dá)水平。

1.3.3子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)取對(duì)照組患者在位子宮內(nèi)膜組織，低溫條件下迅速送往實(shí)驗(yàn)室，剪成1 cm3小塊，膠原酶消化，采用差速離心法去除間質(zhì)細(xì)胞，將純度95%以上的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞達(dá)到60%融合時(shí)，去除培養(yǎng)液，將細(xì)胞置于無(wú)血清的培養(yǎng)液中12 h。將培養(yǎng)液換為含不同劑量(0、0.1、1.0、10.0 mmol/L)米非司酮(美國(guó)Sigma公司)的DMEM/Ham′s F12培養(yǎng)液48 h，并加入活性炭，進(jìn)一步去除胎牛血清。

1.3.4反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9表達(dá)水平Trizol裂解細(xì)胞，檢測(cè)并計(jì)算出RNA的濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR，條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。OPN上游引物：5′-ACAGCCGTGGGAAGGACAGTTA-3′，下游引物：5′-CCTGACTATCAATCACATCGGAATG-3′；MMP-9上游引物：5′-AGTCCACCCTTGTGCTCTTCCC-3′，下游引物：5′-TCTGCCACCCGAGTGTAACCAT-3′；β-actin上游引物：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物：5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算出OPN、MMP-9 mRNA表達(dá)水平[3]。

2　結(jié)果

2.1米非司酮組與對(duì)照組在位、異位內(nèi)膜組織中OPN、MMP-9表達(dá)水平比較米非司酮組在位、異位內(nèi)膜組織中OPN、MMP-9表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1、圖1～4)。

Table 1Comparison of expression levels of OPN and MMP-9 in the eutopic and ectopic endometrium of patients in mifepristone group and control group

組別例數(shù)在位內(nèi)膜組織OPN MMP-9異位內(nèi)膜組織OPN MMP-9對(duì)照組103.31±1.314.81±1.535.13±1.475.50±2.15米非司酮組111.25±0.712.89±1.382.09±1.283.27±2.04t值3.012.653.103.40P值0.0180.0210.0120.005

注：OPN=骨橋蛋白，MMP-9=基質(zhì)金屬蛋白酶9

注：A1～A3為對(duì)照組，B1～B3為米非司酮組

圖1米非司酮組與對(duì)照組在位內(nèi)膜組織中OPN的表達(dá)

Figure 1Expression of OPN in the eutopic endometrium of patients in mifepristone group and control group

注：A1～A3為對(duì)照組，B1～B3為米非司酮組

圖2米非司酮組與對(duì)照組在位內(nèi)膜組織中MMP-9的表達(dá)

Figure 2Expression of MMP-9 in the eutopic endometrium of patients in mifepristone group and control group

注：A1～A3為對(duì)照組，B1～B3為米非司酮組

圖3米非司酮組與對(duì)照組異位內(nèi)膜組織中OPN的表達(dá)

Figure 3Expression of OPN in the ectopic endometrium of patients in mifepristone group and control group

注：A1～A3為對(duì)照組，B1～B3為米非司酮組

圖4米非司酮組與對(duì)照組異位內(nèi)膜組織中MMP-9的表達(dá)

Figure 4Expression of MMP-9 in the ectopic endometrium of patients in mifepristone group and control group

2.2不同劑量米非司酮干預(yù)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9 mRNA表達(dá)水平比較不同劑量米非司酮干預(yù)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。0.1 mmol/L、1.0 mmol/L米非司酮干預(yù)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9 mRNA表達(dá)水平低于0 mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1.0 mmol/L、10.0 mmol/L米非司酮干預(yù)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9 mRNA表達(dá)水平高于0.1 mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；10.0 mmol/L米非司酮干預(yù)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9 mRNA表達(dá)水平高于1.0 mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

Table 2Comparison of mRNA expression levels of OPN and MMP-9 in endometrium epithelial cells that intervened with mifepristone at the different doses

米非司酮(mmol/L)OPNmRNAMMP-9mRNA01.001.000.10.56±0.13a0.48±0.16a1.00.70±0.19ab0.75±0.21ab10.00.96±0.25bc1.05±0.26bcF值66.3042.75P值<0.001<0.001

注：與0 mmol/L比較，aP<0.05；與0.1 mmol/L比較，bP<0.05；與1.0 mmol/L比較，cP<0.05

3　討論

目前關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥的研究多集中在內(nèi)膜異位黏附、種植的具體機(jī)制，但仍不十分清楚[7]。眾多研究顯示，OPN在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過(guò)程中可誘導(dǎo)細(xì)胞的侵襲、黏附、抗凋亡能力增強(qiáng)，并促進(jìn)血管生成[3]。而MMP-9是分子量最大的一種明膠酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽并表達(dá)于細(xì)胞膜表面，促使細(xì)胞向周?chē)?rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移[3,8]。目前對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的藥物治療主要是甾體激素類(lèi)藥物，如米非司酮，但其具體機(jī)制尚未明確[5-6,9-10]。本研究組前期論證了雌激素調(diào)節(jié)OPN/MMP-9通路導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)，可能是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的重要因素[3]。米非司酮是一種抗孕酮和抗糖皮質(zhì)激素的甾體類(lèi)藥物，那么米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9的表達(dá)起到什么樣的作用呢？

本研究結(jié)果顯示，米非司酮組在位、異位內(nèi)膜組織中OPN、MMP-9表達(dá)水平均低于對(duì)照組，0.1 mmol/L、1.0 mmol/L米非司酮干預(yù)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9 mRNA表達(dá)水平低于0 mmol/L，1.0 mmol/L、10.0 mmol/L米非司酮干預(yù)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9 mRNA表達(dá)水平高于0.1 mmol/L，10.0 mmol/L米非司酮干預(yù)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中OPN、MMP-9 mRNA表達(dá)水平高于1.0 mmol/L，提示米非司酮可抑制子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞OPN、MMP-9表達(dá)，其最佳干預(yù)劑量為0.1 mmol/L。米非司酮為19-去甲類(lèi)固醇、炔諾酮的衍生物，通過(guò)與其受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而發(fā)揮作用，在臨床上已廣泛用于抗早孕、中孕引產(chǎn)、軟化宮頸等，亦可用于子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺疾病的治療[11-13]。本研究組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，米非司酮可降低子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠在位、異位內(nèi)膜中OPN、MMP-9表達(dá)水平[14]。而其他學(xué)者的研究顯示，米非司酮可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合下丘腦、垂體組織中的孕激素受體，使卵巢功能受抑制，出現(xiàn)閉經(jīng)現(xiàn)象，進(jìn)一步導(dǎo)致異位的子宮內(nèi)膜萎縮[15]。米非司酮通過(guò)直接抑制雌、孕激素受體的合成從而阻斷內(nèi)膜對(duì)雌、孕激素的反應(yīng)性，使異位內(nèi)膜萎縮[16]。米非司酮可通過(guò)抑制異位內(nèi)膜細(xì)胞白介素6、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的合成，提升異位內(nèi)膜中人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶(PTEN)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因、Fas表達(dá)水平，抑制異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡[17-18]。米非司酮可通過(guò)作用于下丘腦、垂體、子宮內(nèi)膜等多水平抑制在位、異位內(nèi)膜對(duì)雌激素的反應(yīng)，從而下調(diào)在位、異位內(nèi)膜中OPN、MMP-9表達(dá)水平。

本研究從組織及細(xì)胞層面驗(yàn)證了米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜OPN、MMP-9表達(dá)的抑制作用，但其對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的治療機(jī)制可能是多層面的，OPN、MMP-9表達(dá)的下調(diào)只是多種機(jī)制之一。另外，米非司酮可抑制雌、孕激素受體的合成，其是否造成子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞雌、孕激素受體比例變化，其與子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞受體結(jié)合的具體機(jī)制如何，均不明確，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，米非司酮可明顯下調(diào)子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜中OPN、MMP-9表達(dá)水平，從而抑制子宮內(nèi)膜的侵襲、黏附以及種植性轉(zhuǎn)移，這可能也是米非司酮治療子宮內(nèi)膜異位癥的重要機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)：楊眉進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；楊眉、蔣春樊進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；哈春芳進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Influence of Mifepristone on the Expression of Osteopontin and Matrix Metalloproteinase 9 in the Endometrium Epithelial Cells of Patients With Endometriosis

YANGMei,JIANGChun-fan,HAChun-fang.

DepartmentofObstetricsandGynecology,XiangyangCentralHospital,AffiliatedHospitalofHubeiUniversityofArtsandScience,Xiangyang441021;NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,ChinaCorrespondingauthor:HAChun-fang，DepartmentofGynecology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity;KeyLaboratoryofFertilityPreservationandMaintenanceoftheMinistryofEducation,Yinchuan750004,China;E-mail:hachunfang@163.com

BackgroundThe therapeutic method towards endometriosis is still in limitation,and mifepristone can be used to treat endometriosis in clinic,but its specific mechanism still remains unclear.ObjectiveTo investigate the influence of miferpristone on the expression of osteopontin (OPN) and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) in the endometrium epithelial cells of patients with endometriosis.Methods21 patients with endometriosis,who suffered ovarian cyst enucleation or adnexectomy due to ovarian chocolate cyst in Department of Gynecology in General Hospital of Ningxia Medical University from August 2014 to March 2015,were recruited in the study.They were divided into mifepristone group (11 cases) and control group (10 cases) based on whether they had undergone mifepristone therapy.The eutopic and ectopic endometrium of all these patients were obtained through surgery,and immunohistochemistry method was used to detect the expression level of OPN and MMP-9;the culture of endometrium epithelial cells in the eutopic endometrium of patients in control group were performed with the intervention of different doses of mifepristone (0,0.1,1.0,10.0 mmol/L),and inverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method was used to investigate the expression level of OPN and MMP-9 in the endometrial epithelial cells.ResultsThe expression levels of OPN and MMP-9 in mifepristone group both in eutopic and ectopic endometrium were lower than those in control group (P<0.05).The mRNA expression levels of OPN and MMP-9 in endometrium epithelial cells after the intervention of mifepristone at a dose of 0.1 and 1.0 mmol/L were lower than those at 0 mmol/L (P<0.05);the mRNA expression levels of OPN and MMP-9 in endometrium epithelial cells after the intervention of mifepristone at a dose of 1.0 and 10.0 mmol/L were higher than those at 0.1 mmol/L (P<0.05);the mRNA expression levels of OPN and MMP-9 in endometrium epithelial cells after the intervention of mifepristone at the dose of 10.0 mmol/L were higher than those at 1.0 mmol/L (P<0.05).ConclusionMifepristone can obviously lower the expression levels of OPN and MMP-9 in endometrium of endometriosis,and thus inhibit the invasion,adhesion and implantation metastasis of endometrium.

Endometriosis;Mifepristone;Osteopontin;Matrix metalloproteinase 9

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160078)

441021 湖北省襄陽(yáng)市中心醫(yī)院 湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(楊眉)，病理科(蔣春樊)；寧夏醫(yī)科大學(xué)(楊眉)；寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦科，生育力保持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(哈春芳)

哈春芳，750004 寧夏銀川市，寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦科，生育力保持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；E-mail：hachunfang@163.com

R 711.71

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.011

2016-03-05；

2016-07-05)