Neuritin對大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷影響的研究

李曉天，趙 冬，代林志，朱立倉，田衛(wèi)東，唐仕軍，朱文學(xué)，楊 鵬，王業(yè)忠

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·論著·

Neuritin對大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷影響的研究

李曉天，趙 冬，代林志，朱立倉，田衛(wèi)東，唐仕軍，朱文學(xué)，楊 鵬，王業(yè)忠

目的探究Neuritin對大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后早期腦損傷過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子GRP78及血-腦脊液屏障通透性的影響。方法2014年4月—2015年9月選取成年健康雄性SD大鼠144只，按照隨機數(shù)字表法分為對照組、假手術(shù)組(Sham組)、SAH組、Neuritin組，各36只。再依據(jù)簡單隨機抽樣法分別于3、6、12、24、48、72 h抽取每組6只大鼠處死，Neuritin組于處死前1 h采用立體定向技術(shù)向側(cè)腦室注射Neuritin。建模后6、12、24、48、72 h處死大鼠前，記錄各組大鼠Garcia神經(jīng)功能評分；建模后3、6、12、24、48、72 h處死大鼠后，采用HE染色觀察SAH建立情況，側(cè)腦室微量注射亞甲藍鑒定Neuritin注射情況；采用Western blotting法檢測大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子GRP78表達水平；采用甲酰胺浸泡法檢測大鼠腦內(nèi)伊文藍(EB)含量以評價血-腦脊液屏障通透性。結(jié)果SAH組、Neuritin組建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神經(jīng)功能評分均低于對照組和Sham組(P<0.05)；Neuritin組建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神經(jīng)功能評分均高于SAH組(P<0.05)。SAH組大鼠大腦表面彌散分布積血，其中在willis環(huán)、小腦延髓池及腦干腹側(cè)有大量積血存在。Neuritin組大腦腹面有亞甲藍循環(huán)存在，大腦背面無亞甲藍，Neuritin側(cè)腦室注射成功。SAH組建模后3、6、12、24、48、72 h GRP78表達水平高于對照組、Sham組(P<0.05)；Neuritin組建模后6、12、24、48、72 h GRP78表達水平低于SAH組(P<0.05)。SAH組大鼠建模后3、6、12、24、48、72 h腦組織EB含量均高于對照組、Sham組(P<0.05)；Neuritin組大鼠建模后3、12 h腦組織EB含量高于SAH組，建模后6、48、72 h腦組織EB含量低于SAH組(P<0.05)。結(jié)論SAH后早期腦損傷過程中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，神經(jīng)營養(yǎng)因子Neuritin可顯著改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子GRP78表達水平，改善早期腦損傷過程中大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分，并對血-腦脊液屏障通透性產(chǎn)生影響。

蛛網(wǎng)膜下腔出血；腦損傷；神經(jīng)生長因子類；血腦屏障；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；Neuritin；GRP78

李曉天，趙冬，代林志，等.Neuritin對大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷影響的研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(24)：2908-2914.[www.chinagp.net]

LI X T,ZHAO D,DAI L Z,et al.Effects of Neuritin in early brain injury after subarachnoid hemorrhage of rats[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2908-2914.

蛛網(wǎng)膜下腔出血( subarachnoid hemorrhage,SAH)是由于腦底或腦表淺部位顱內(nèi)血管破裂，血液流入蛛網(wǎng)膜下腔而形成[1]。SAH是常見的腦血管疾病之一，盡管內(nèi)外科治療方法逐漸改進，但其病死率仍高達30%～50%，且在存活的患者中，33%需要長期生活照顧[2]。最近幾年國內(nèi)外有研究者提出了早期腦損傷(early brain injury，EBI)這一概念，其是指SAH發(fā)生后72 h內(nèi)出現(xiàn)的全腦直接損傷，并指出EBI是SAH患者預(yù)后不良的主要因素，EBI包括顱內(nèi)壓升高、腦血流量減少、急性腦血管痙攣、血-腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)破壞、腦水腫、微循環(huán)功能障礙和腦細胞凋亡等[3-4]，而神經(jīng)元的壞死和凋亡是導(dǎo)致EBI中神經(jīng)功能損害的關(guān)鍵機制[5-6]。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡(programmed cell death,PCD)，是由一系列細胞代謝變化引起的細胞自我毀滅，是在基因控制下，通過合成特殊蛋白而完成的細胞主動死亡過程，是細胞主要功能性活動之一[7]。目前，已知的誘導(dǎo)細胞凋亡的途徑有線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)途徑。未折疊或折疊錯誤的蛋白質(zhì)在ER上過度積累，導(dǎo)致ER產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)從而激活保護細胞的信號通路，通常稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)，又名免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP)，屬于熱休克蛋白70 (HSP70)家族。GRP78是ER眾多的分子伴侶蛋白中最具特征性的一個[8]。在ER應(yīng)激條件下，GRP78的表達上調(diào)非常明顯，因而GRP78的誘導(dǎo)表達被廣泛作

本研究要點：

目前已知的誘導(dǎo)細胞凋亡的途徑有線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，而在蛛網(wǎng)膜下腔出血過程中，是否存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑介導(dǎo)的細胞凋亡，鮮有文獻報道。本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的感受器，其在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠的表達水平較對照組明顯增加，進一步證實了本課題組先前發(fā)現(xiàn)的蛛網(wǎng)膜下腔出血后存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑介導(dǎo)的細胞凋亡。本研究以神經(jīng)營養(yǎng)因子Neuritin為干預(yù)因素，發(fā)現(xiàn)其可顯著降低蛛網(wǎng)膜下腔出血后GRP78的表達水平，改善蛛網(wǎng)膜下腔出血后大鼠血-腦脊液屏障通透性，并最終改善大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)行為學(xué)評分，為臨床治療蛛網(wǎng)膜下腔出血提供新的靶點。

為UPR激活的標志[9]。Neuritin是新近發(fā)現(xiàn)的一種與神經(jīng)可塑性相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，于神經(jīng)系統(tǒng)高度表達，可促進神經(jīng)元突觸生長、成熟，防止神經(jīng)元凋亡[10-11]。有研究表明，Neuritin在腦損傷組織中表達明顯增高[12]。本研究通過觀察Neuritin在大鼠SAH后EBI過程中對ER應(yīng)激通路中GRP78及BBB通透性的影響，來探討其在SAH后EBI中的作用，為今后臨床進一步治療SAH提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料2014年4月—2015年9月選取SPF級成年健康雄性SD大鼠288只，體質(zhì)量250～350 g，月齡3～4個月[13]。大鼠購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心，許可證號：SYXK(新)2011-0002。動物飼養(yǎng)平均溫度26 ℃，濕度40%左右。按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組、假手術(shù)組(Sham組)、SAH組、Neuritin組，每組36只。

1.2主要試劑GRP78單克隆抗體購自英國Abcam公司，內(nèi)參β-actin購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，伊文藍(EB)、甲酰胺購自美國Sigma公司。

1.3建模方法

1.3.1SAH組、Sham組、對照組大鼠模型的建立[14-15]采用視交叉前池注血法建立SAH動物模型，將大鼠采用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，分離暴露股動脈并穿刺置管，大鼠取俯臥位固定在腦立體定位儀上，常規(guī)消毒鋪巾后，沿大鼠顱頂矢狀線逐層切開頭皮、肌肉，鈍性分離骨膜，取冠狀縫前5 mm，中線旁開3 mm 處為鉆孔點，用電動牙科鉆鉆孔，暴露額極，用1 ml注射器針頭挑破硬腦膜，可見腦脊液流出，將自制PE10導(dǎo)管從額極沿前顱窩底向雙耳連線中點送入，進入深度為10 mm，骨蠟封閉鉆孔。PE10導(dǎo)管外露端連接1 ml無菌注射器，回抽見清亮腦脊液后，取自體股動脈血0.3 ml，連接PE10導(dǎo)管，在12 s內(nèi)勻速注入蛛網(wǎng)膜下腔。注射完畢后小心拔出導(dǎo)管，骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮，保持大鼠頭低位 30 min。Sham組除將自體血換為0.3 ml 0.9%氯化鈉溶液注入蛛網(wǎng)膜下腔外，余步驟同SAH組。對照組僅行顱骨鉆孔，不予其他任何處理。3組建模后分別按照簡單隨機抽樣法于3、6、12、24、48、72 h抽取6只大鼠處死。

1.3.2Neuritin組不同時間點大鼠模型建立在SAH模型基礎(chǔ)上，按照簡單隨機抽樣法于3、6、12、24、48、72 h抽取6只大鼠注射Neuritin，建立Neuritin模型后處死。側(cè)腦室注射Neuritin的具體操作：每6只大鼠在處死前1 h再次進行10%水合氯醛腹腔注射麻醉，方法同前。麻醉生效后，大鼠取俯臥位固定在腦立體定位儀上，使大鼠頭頂部處于水平位，定位右側(cè)側(cè)腦室穿刺點，為冠狀縫后側(cè)0.8 mm，矢狀縫右側(cè)1.6 mm，鉆孔至硬腦膜。微量進樣器抽取Neuritin溶液150 μl后，并將微量進樣器固定在腦立體定向儀上，在鉆孔位置垂直進針至硬膜下4.5 mm，勻速注入(約15 μl/min)，并在 12 min 內(nèi)注完,留針 5 min 后退針。注射完畢后，骨蠟封閉骨孔，再次消毒，縫合頭皮。

1.3.3SAH建模成功標準HE染色見大鼠蛛網(wǎng)膜下腔有積血存在即可證實SAH模型建立成功。

1.4觀察指標

1.4.1神經(jīng)行為學(xué)評分于建模后6、12、24、48、72 h處死大鼠前，記錄各組大鼠Garcia神經(jīng)功能評分[16]，共評價6個項目：自主活動、四肢活動對稱性、前肢伸展活動、攀爬能力、本體感覺、胡須觸碰反射，最高18分，最低5分，得分越低表明大鼠神經(jīng)功能受損程度越嚴重。

1.4.2形態(tài)學(xué)觀察對照組、SAH組、Neuritin組于建模后3、6、12、24、48、72 h根據(jù)簡單隨機抽樣法分別抽取其中1只大鼠于麻醉后斷頭取腦，對照組、SAH組于10%甲醛溶液中固定至少24 h，組織石蠟包埋，切片HE染色，光鏡下觀察；Neuritin組在立體定向下注射微量亞甲藍于大鼠側(cè)腦室，注射后斷頭取腦，并進行腦組織甲醛溶液固定切片，以鑒定Neuritin是否注射成功。

1.4.3Western blotting法檢測GRP78表達水平4組大鼠處死后取大鼠大腦皮質(zhì)于-80 ℃冰箱凍存，并于凍存1個月內(nèi)進行實驗。凍存后大鼠大腦皮質(zhì)總蛋白濃度調(diào)至10 mg/ml，上樣量總蛋白不超過200 μg(即20 μl)，Western blotting法具體操作方法見文獻[17]。應(yīng)用Quantity one軟件進行蛋白條帶結(jié)果分析。

1.4.4EB標準曲線制備及EB含量〔μg/g(濕重腦組織)〕測定[18]采用電子天平稱取EB 5 mg溶于25 ml 甲酰胺中，混勻后取0.3 ml加入5.7 ml甲酰胺中混勻作為第1管，從第1管取3.0 ml加入3.0 ml甲酰胺中混勻作為第2管，從第2管取3.0 ml加入3.0 ml甲酰胺中混勻作為第3管，以此類推共9管，EB的濃度分別為10.000 mg/L、5.000 mg/L、2.500 mg/L、1.250 mg/L、0.625 mg/L、0.313 mg/L、0.157 mg/L、0.079 mg/L、0.040 mg/L，第10管為蒸餾水進行空白對照，60 ℃水浴48 h，然后從每管分別取100 μl置于96孔板中，酶標儀630 nm波長處進行比色，測定不同管的OD值，制作標準曲線。各組大鼠于處死前1 h，分別用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉生效后暴露各組大鼠右側(cè)股靜脈，2% EB(0.2 ml/100 g)經(jīng)右股靜脈注入大鼠體內(nèi),1 h后0.9%氯化鈉溶液經(jīng)左心室進行心臟灌流,直至右心房流出清澈液體。斷頭取腦正中剖開,左右大腦半球稱重后按1 g/1 ml比例浸入甲酰胺溶液后勻漿,將勻漿液置入60 ℃恒溫水浴箱中放置48 h，然后在4 ℃下以10 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)。吸取上清液100 μl置于96孔板中，酶標儀630 nm波長處測定甲酰胺中EB的OD值，即EB含量，并根據(jù)其評價BBB通透性。根據(jù)標準曲線，定量分析各組大鼠腦組織中EB含量。腦組織EB含量(μg/g)=樣品EB含量(μg/ml)×甲酰胺容量(ml)/腦重(g)。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠Garcia神經(jīng)功能評分比較4組建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神經(jīng)功能評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SAH組、Neuritin組建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神經(jīng)功能評分均低于對照組和Sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Neuritin組建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神經(jīng)功能評分均高于SAH組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2對照組、SAH組、Neuritin組大鼠形態(tài)學(xué)觀察對照組大鼠大腦肉眼觀無積血(見圖1a，本文圖1彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)，SAH組大鼠大腦表面彌散分布積血，其中在willis環(huán)、小腦延髓池及腦干腹側(cè)有大量積血存在(見圖1b)，對照組及SAH組大腦HE染色切片見圖1c～d。Neuritin組大鼠側(cè)腦室注射亞甲藍后，肉眼觀可見大腦腹面有亞甲藍循環(huán)存在，大腦背面無亞甲藍(見圖1e～f)，固定切片可見側(cè)腦室有亞甲藍分布(見圖1g)，提示Neuritin側(cè)腦室注射成功。

2.3各組大鼠不同時間點GRP78表達水平比較4組建模后3、6、12、24、48、72 h GRP78表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SAH組建模后3、6、12、24、48、72 h GRP78表達水平高于對照組、Sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Neuritin組建模后6、12、24、48、72 h GRP78表達水平低于SAH組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2、圖2)。

2.4各組大鼠腦組織EB含量比較4組大鼠建模后3、6、12、24、48、72 h腦組織EB含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SAH組大鼠建模后3、6、12、24、48、72 h腦組織EB含量均高于對照組、Sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Neuritin組大鼠建模后3、12 h腦組織EB含量高于SAH組，建模后6、48、72 h腦組織EB含量低于SAH組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

表1　各組大鼠不同時間點Garcia神經(jīng)功能評分比較±s，分)

注：Sham=假手術(shù)，SAH=蛛網(wǎng)膜下腔出血；與對照組比較，aP<0.05；與Sham組比較比較，bP<0.05；與SAH組比較，cP<0.05

表2　各組大鼠不同時間點GRP78表達水平比較±s)

注：與對照組比較，aP<0.05；與Sham組比較比較，bP<0.05；與SAH組比較，cP<0.05

表3　各組大鼠不同時間點腦組織EB含量比較±s，μg/g)

注：EB=伊文藍；與對照組比較，aP<0.05；與Sham組比較比較，bP<0.05；與SAH組比較，cP<0.05

注：a、b分別為對照組及SAH組肉眼觀；c、d分別為對照組及SAH組HE染色切片(×100)；e、f、g分別為Neuritin組側(cè)腦室注射亞甲藍大腦腹面觀、背面觀及甲醛溶液腦組織固定切片情況

圖1模型建立及鑒定

Figure 1Model building and identification

注：Sham=假手術(shù)，SAH=蛛網(wǎng)膜下腔出血

圖2各組GRP78表達電泳圖

Figure 2Electrophoretogram of the expression level of GRP78 protein in different groups

3　討論

SAH是神經(jīng)外科常見病、多發(fā)病，具有致死率高、致殘率高、患者預(yù)后差等特點。在存活的患者中，50%以上的患者存在認知功能障礙和神經(jīng)學(xué)癥狀，而影響SAH預(yù)后的主要原因有腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)和EBI。有臨床研究顯示，顯著改善SAH患者的CVS后，其臨床預(yù)后并無明顯改善[19]。而越來越多的臨床研究表明，EBI才是影響SAH患者預(yù)后的主要原因，SAH后腦損傷是一個多通路的病理生理學(xué)過程，其可導(dǎo)致腦血流(CBF)顯著減少，造成急性腦缺血[20-21]，且導(dǎo)致患者預(yù)后不良的最重要因素是急性SAH給腦組織帶來的不可逆性損傷[22]。因此，筆者認為，腦組織細胞死亡和BBB損傷是EBI過程中的重要環(huán)節(jié)。

本研究采用Garcia神經(jīng)功能評分法對大鼠模型進行神經(jīng)行為學(xué)評分，因建模3 h時大鼠麻醉未醒，無法進行Garcia神經(jīng)功能評分，因此不予以測定。本研究結(jié)果顯示，SAH組、Neuritin組建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神經(jīng)功能評分均低于對照組和Sham組，表明SAH后EBI過程中可引起神經(jīng)功能障礙；Neuritin組建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神經(jīng)功能評分均高于SAH組，提示Neuritin具有緩解SAH后大鼠神經(jīng)損傷的作用。

目前，已知的誘導(dǎo)細胞凋亡的途徑有線粒體途徑、死亡受體途徑和ER途徑。當(dāng)細胞受到理化因素刺激時，細胞ER內(nèi)的穩(wěn)態(tài)環(huán)境失衡，進而激活相應(yīng)的信號通路，引發(fā)細胞內(nèi)一系列反應(yīng)，稱為ER應(yīng)激。此時未折疊或折疊錯誤的蛋白質(zhì)在ER上過度積累，導(dǎo)致ER產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)從而激活保護細胞的信號通路，通常稱為UPR[23]。UPR是ER一種應(yīng)激性的自我保護反應(yīng)，如果刺激過強或持續(xù)過久，UPR不足以恢復(fù)和維持ER穩(wěn)態(tài)，則啟動程序性死亡，走向細胞凋亡[24-25]。ER有3條保護細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分別為PERK通路、ATF6通路、IRE1通路。GRP78是ER穩(wěn)態(tài)的感受器，當(dāng)ER應(yīng)激時GRP78與PERK、ATF6、IRE1解離，啟動ER應(yīng)激的3條主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對細胞進行保護[26]。本課題組在前期的研究中證實，ER應(yīng)激在自發(fā)性SAH后EBI中發(fā)揮重要作用[27-28]。本研究結(jié)果顯示，SAH組建模后3、6、12、24、48、72 h GRP78表達水平高于對照組、Sham組，進一步證明SAH后存在ER應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡，Neuritin組建模后6、12、24、48、72 h GRP78表達水平低于SAH組，表明Neuritin可降低ER應(yīng)激的發(fā)生進而減輕ER應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡。

BBB是一個動態(tài)的擴散屏障[29]，EB與血漿蛋白結(jié)合可作為BBB損害、血漿蛋白外滲、血管源性腦水腫的定性指標。本課題組采用酶標儀法檢測滲入腦組織EB含量，作為判斷BBB通透性變化、血管源性腦水腫的定性指標。本研究結(jié)果顯示，SAH組大鼠建模后3、6、12、24、48、72 h腦組織EB含量均高于對照組、Sham組，表明SAH組存在BBB破壞；建模后6、48、72 h腦組織EB含量低于SAH組，表明Neuritin可改善SAH后BBB通透性的損傷。但Neuritin組大鼠建模后3、12 h腦組織EB含量高于SAH組，原因可能為Neuritin注射本身就是一種損傷，因此具體分子機制有待進一步研究。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子Neuritin對于大鼠SAH后EBI具有積極作用，可降低ER應(yīng)激，改善SAH后BBB通透性的損傷，并可改善其損傷后的神經(jīng)行為情況,但其對BBB通透性改善的具體機制、ER應(yīng)激通路的具體作用靶點及具體作用機制尚不明確，且其最佳藥物濃度尚需明確，需進一步深入研究。Neuritin作為一種新近發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，是否對SAH后除ER應(yīng)激介導(dǎo)的細胞通路亦或是其他作用靶點有其他積極作用，還需進一步研究。

綜上所述，大鼠SAH后存在ER介導(dǎo)的細胞凋亡，神經(jīng)營養(yǎng)因子Neuritin可以顯著降低ER應(yīng)激的發(fā)生，進而降低ER介導(dǎo)的細胞凋亡，并可改善大鼠SAH后BBB通透性，并最終改善大鼠SAH后神經(jīng)行為學(xué)評分及預(yù)后，為臨床治療SAH提供新的靶點。

作者貢獻：李曉天進行實驗具體實施、資料數(shù)據(jù)收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責(zé)；趙冬、代林志、朱立倉、田衛(wèi)東、唐仕軍、朱文學(xué)、楊鵬進行部分實驗實施、評估及部分資料收集處理；王業(yè)忠進行實驗質(zhì)量、數(shù)據(jù)、資料控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：毛亞敏)

Effects of Neuritin in Early Brain Injury After Subarachnoid Hemorrhage of Rats

LIXiao-tian,ZHAODong,DAILin-zhi,ZHULi-cang,TIANWei-dong,TANGShi-jun,ZHUWen-xue,YANGPeng,WANGYe-zhong.

DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversity,Shihezi832000;WeifangPeople′sHospital,Weifang261000,China

WANGYe-zhong,DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversity,Shihezi832000；WeifangPeople′sHospital，Weifang261000,China；E-mail：Wangyz2008@126.com

ObjectiveTo investigate the effects of Neuritin in endoplasmic reticulum stress factor-GRP78 and blood-brain barrier permeability during the process of early brain injury(EBI)after subarachnoid hemorrhage(SAH)of rats.Methods144 healthy adult male SD rats were selected from April 2014 to September 2015,and they were divided into control group,Sham group,SAH group and Neuritin group with 36 rats in each group,according to random number table method.Then according to simple random number table method,6 rats were selected to be executed from each group at time points of 3,6,12,24,48,72 h respectively and lateral ventricle injection with Neuritin was given to rates in Neuritin group by stereotactic technique 1 h before execution.6,12,24,48,72 h after modeling,Garcia neurological score of rats in each group was recorded before their execution;3,6,12,24,48,72 h after modeling,HE staining was used to observe the SAH establishment situation,Meilan was microinjected into lateral ventricles to identify Neuritin injection condition.we detected the protein expression of endoplasmic reticulum stress factor GRP78 in cerebral cortex of rats by Western blotting method,and the Evans blue (EB) content in brain of rats by formamide immersion method to evaluate the blood-brain barrier permeability.Results6,12,24,48,72 h after modeling,Garcia neurological scores of rats in SAH group and Neuritin group were lower than those of control group and Sham group (P< 0.05);6,12,24,48,72 h after modeling,Garcia neurological score of rats in Neuritin group was higher than that of SAH group (P< 0.05).Hematocele was scattered in the surface of brain of rats in SAH group,and there also was large amount of hematocele in willis ring,cerebellar medulla and ventral brainstem.Meilan circulated around the ventral side of the brain of rats in Neuritin group,while no Meilan in the reverse side of the brain.Intracerebroventricular injection of rats in Neutritin group was succeeded.3,6,12,24,48,72 h after modeling,GRP78 expression level of rats in SAH group was higher than that of control group and Sham group (P< 0.05);6,12,24,48,72 h after modeling,GRP78 expression level of rats in Neuritin group was lower than that of SAH group (P< 0.05).3,6,12,24,48,72 h after modeling,EB content of brain tissue of rats in SAH group was higher than that of control group and Sham group (P< 0.05);3,12 h after modeling,EB content of brain tissue of rats in Neuritin group was higher than that of SAH group (P< 0.05),6,48,72 h after modeling,EB content of brain tissue of rats in Neuritin group was lower than that of SAH group (P< 0.05).ConclusionThere are endoplasmic reticulum stress responses in the process of EBI after SAH.Neurological factor Neuritin can significantly change the protein expression of endoplasmic reticulum stress factor GRP78,improve the neurobehavioral scores of rates in EBI process,and influence the blood-brain barrier permeability.

Subarachnoid hemorrhage;Brain injury;Nerve growth factors;Blood-brain barrier;Endoplasmic reticulum stress;Neuritin;GRP78

國家自然科學(xué)資金資助項目(81360185)

832000新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(李曉天，趙冬，代林志，朱立倉，田衛(wèi)東，唐仕軍，朱文學(xué)，楊鵬，王業(yè)忠)；濰坊市人民醫(yī)院(李曉天)

王業(yè)忠，832000新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；E-mail：Wangyz2008@126.com

R 743.35

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.008

2015-12-23；

2016-06-13)