鈣處理對葡萄柚果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)代謝及其相關(guān)基因表達(dá)的影響

鄧 佳， 史正軍*， 王連春， 吳海波， 劉惠民

( 1西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué)，昆明 650224;2西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224)

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鈣處理對葡萄柚果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)代謝及其相關(guān)基因表達(dá)的影響

鄧 佳1， 史正軍1*， 王連春2， 吳海波2， 劉惠民1

( 1西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué)，昆明 650224;2西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224)

【目的】研究采前、采后鈣處理對葡萄柚果實(shí)細(xì)胞壁組分、細(xì)胞壁降解酶活性變化及其相關(guān)基因表達(dá)的影響，可為了解鈣與果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)代謝之間的關(guān)系，揭示鈣對果實(shí)軟化的作用機(jī)理，為調(diào)控葡萄柚果實(shí)膳食纖維含量，提高果實(shí)質(zhì)地品質(zhì)提供理論依據(jù)?！痉椒ā吭囼?yàn)于2011年2月至11月在云南省玉溪市葡萄柚果園進(jìn)行，供試品種為‘里約紅’葡萄柚，該品種于2005年嫁接于當(dāng)?shù)卣枘荆晷芯酁?m×3m。試驗(yàn)由采前和采后鈣處理兩部分組成。采前鈣處理在幼果初期、幼果末期、膨大初期、膨大末期、轉(zhuǎn)色期，葉面噴施2%CaCl2; 采后鈣處理在果實(shí)成熟采后浸于2%CaCl2溶液5min, 室溫貯藏。之后每15天取樣一次，每次取10個果實(shí)，測定葡萄柚果肉細(xì)胞壁組分、細(xì)胞壁降解酶活性及其基因表達(dá)量?！窘Y(jié)果】隨葡萄柚果實(shí)后熟軟化，緊密結(jié)合型果膠(共價結(jié)合型果膠)解聚為松散結(jié)合型果膠(水溶性果膠、離子結(jié)合型果膠)，緊密結(jié)合型半纖維素(24%KOH可溶性半纖維素)解聚使其含量下降，而松散結(jié)合型半纖維素含量增加(4%KOH可溶性半纖維素)。果實(shí)PG、PME、Cx、α-L-Af和β-Gal酶活性及其基因表達(dá)量均隨果實(shí)軟化呈不同程度增加。PME活性在果實(shí)采收后表現(xiàn)出較高含量，而PG活性在果實(shí)貯藏前期急劇增加，其酶基因的表達(dá)量與酶活性變化趨勢基本一致。Cx、α-L-Af和β-Gal活性在貯藏中、后期上升較快，相關(guān)酶基因的表達(dá)量亦明顯增加。鈣處理顯著地降低果實(shí)細(xì)胞壁降解酶活性和基因表達(dá)水平，其中采后鈣處理對α-L-Af和β-Gal活性和基因表達(dá)在貯藏中、后期的調(diào)控作用較顯著，酶活性和基因表達(dá)均維持在較低水平?！窘Y(jié)論】外源鈣處理降低細(xì)胞壁降解酶活性及其基因表達(dá)，抑制了細(xì)胞壁物質(zhì)的解聚，采后鈣處理對細(xì)胞壁物質(zhì)代謝的調(diào)控效果優(yōu)于采前鈣處理。外源鈣處理抑制了細(xì)胞壁降解酶基因表達(dá)水平，降低了細(xì)胞壁降解酶活性，減緩了果膠、半纖維素的解聚，從而達(dá)到調(diào)控果實(shí)膳食纖維含量、維持果實(shí)質(zhì)地品質(zhì)、延長果實(shí)貨架期壽命的目的。

葡萄柚; 鈣處理; 細(xì)胞壁物質(zhì); 細(xì)胞降解酶; 基因表達(dá)

葡萄柚(Citrus paradisiMacf.)屬蕓香科柑桔屬植物，葡萄柚果實(shí)柔軟多汁，采后貯藏過程中因質(zhì)地軟化易受到霉菌感染引發(fā)蒂腐病、綠霉病等生理性病害，縮短貯運(yùn)壽命，降低其商品價值[1]。果膠-纖維素-半纖維素總體結(jié)構(gòu)的破壞和果膠、纖維素等細(xì)胞壁物質(zhì)解聚是果實(shí)軟化的開端。多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲酯酶(PME)、纖維素酶(Cx)和糖苷酶等細(xì)胞壁降解酶是果實(shí)成熟和軟化過程中影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的重要酶，研究細(xì)胞壁降解酶在果實(shí)軟化過程中的作用機(jī)理，對提高果實(shí)質(zhì)地品質(zhì)，調(diào)控果實(shí)膳食纖維含量具有重要意義。

鈣與果實(shí)的貯藏質(zhì)地品質(zhì)密切相關(guān)，它是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的必要物質(zhì)。在采前或采后用鈣制劑進(jìn)行處理，能明顯降低細(xì)胞壁降解酶作用，維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定，有效防止果實(shí)硬度下降，提高果實(shí)抗病性，防止生理病害，延長果實(shí)貯藏壽命和貨架期[1]。本試驗(yàn)以‘里約紅’葡萄柚果實(shí)為試材，利用生理生化和分子生物學(xué)方法，研究采前、采后鈣處理對葡萄柚果實(shí)細(xì)胞壁組分、細(xì)胞壁降解酶活性變化及其相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期了解鈣元素與果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)代謝之間的關(guān)系，揭示鈣對果實(shí)軟化的作用機(jī)理，為調(diào)控葡萄柚果實(shí)膳食纖維含量，提高果實(shí)質(zhì)地品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試材料與方法

試驗(yàn)于2011年2月至2011年11月在云南省玉溪市嘎灑鎮(zhèn)金土地公司葡萄柚果園進(jìn)行，供試品種為‘里約紅’葡萄柚，該品種于2005年嫁接于當(dāng)?shù)卣枘?，株行距?m×3m。

采后處理(post-Ca): 隨機(jī)選取無病、蟲、傷和成熟度一致的果實(shí)進(jìn)行處理。常溫下將果實(shí)置于濃度為2%CaCl2溶液浸泡5分鐘，通風(fēng)室溫晾干[3]。

對照處理(control): 除不噴施鈣或在2%CaCl2中浸泡，其余同上述處理。

1.2指標(biāo)及測定方法

1.2.1 果實(shí)失重率稱重測定，每組處理測定5個果實(shí)。果實(shí)失重率(%)=[(貯前果實(shí)質(zhì)量-貯藏后果實(shí)質(zhì)量)/貯前果實(shí)質(zhì)量]×100。

1.2.2 果肉硬度GY-B型硬度計測定，探頭直徑3.5mm。隨機(jī)取3個果實(shí)，在每個果實(shí)赤道面位置去皮對稱四側(cè)測定，取平均值，單位N。

1.2.3 果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)的提取、分離及含量測定細(xì)胞壁物質(zhì)的提取和分離參考Redgwell等及Rose等[4-5]的方法并略加改進(jìn)，分別提取乙醇不溶物(alcoholinsolubleresidue,AIR)、水溶性果膠(WSP)、離子結(jié)合型果膠(ESP)、共價結(jié)合型果膠(SCSP)、4%KOH可溶性半纖維素(4KSF)和24%KOH可溶性半纖維素(24KSF)。果膠含量用咔唑法測定，半纖維素用蒽酮法測定，每樣重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.4 細(xì)胞壁降解酶的提取及活性酶液制備參照Lohani等[6]和Deng等[7]的方法并略加改進(jìn)。取果肉1.0g，樣品放于冷凍過的研缽內(nèi)，加入10mLTris-HCl溶液(50mmol/L，pH7.0)，冰浴上研磨勻漿，4℃離心，取上清液用于酶提取液以測定酶活性。

果膠甲酯酶(PME)活性測定采用NaOH滴定法[8]、多聚半乳糖醛酸酶(PG)和纖維素酶(Cx)活性測定采用DNS比色法[6]、β-半乳糖苷酶(β-Gal)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Af)活性測定采用比色法[10-11]。以上各種細(xì)胞壁酶活性的測定均重復(fù)3 次，取其平均值。

1.2.5 酶基因表達(dá)的實(shí)時熒光定量PCR檢測采用Trizol法提取總RNA，使用AMVFirstStrandcDNASynthesisKit試劑盒(購自上海生工公司)合成cDNA第一鏈。采用Primer5軟件進(jìn)行qRT-PCR引物設(shè)計，看家基因18S用作目的基因熒光定量PCR內(nèi)參。

引物PG上游5′-GAACCTTAGGGTGGTCAACAG-3′; 下游5′-GACTTCAACACGAGATGC-3′。PME上游5′-CAGAACCGACCCTAACCAGAG-3′; 下游5′-AAGGAACGTCTTAACGGAGCT-3′。Cx上游5′-TATCTTAGTCGGAGCCATCGTC-3′; 下游5′-TATACGTAGCCGGTTCTGAGTGA-3′。β-Gal上游5′-GTTATGTGCAAACAAGACGACG-3′; 下游5′-GCCGGTCTAGTAGGAACAGCA-3′。α-L-Af上游5′-CGGTTTTTCAGATTTCCAGGT-3′; 下游5′-TCACCAAAGTGTCCAGGTCTC-3′。18S上游5′-GTAGTCCATGCCGTAAACGAT-3′; 下游5′-CGAATTAAACCACATGCTCCA-3′。

采用ABI7500熒光定量PCR儀和ABISybrGreenPCRMasterMix(2X)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測。20μL反應(yīng)體系包括: 1μL模板(cDNA)、2μL特異引物、10μLSybrGreenPCRMasterMix，ddH2O補(bǔ)齊20μL，反應(yīng)程序?yàn)?5℃反應(yīng)2min，然后95℃ 10s，60℃ 40s，40個循環(huán)。qRT-PCR的數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT方法，每個處理樣品設(shè)置3次重復(fù)。

1.3數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析(P < 0.05)、相關(guān)性分析，用SigmaPlot軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄柚果實(shí)采后失重率、硬度的變化

圖1A顯示，鈣處理對葡萄柚果實(shí)失重率的調(diào)控表現(xiàn)出明顯抑制作用，貯藏結(jié)束時，采前、采后鈣處理果實(shí)失重率明顯低于對照。由圖1B可知，貯藏過程中葡萄柚果肉硬度持續(xù)下降，貯藏前期(第15天)，2種鈣處理果實(shí)硬度都略高于對照，但與對照差異不顯著。貯藏結(jié)束時，采后浸鈣處理果實(shí)硬度顯著高于其他處理。貯藏期間，采后浸鈣處理對硬度、失重率的調(diào)控優(yōu)于采前鈣處理。

圖1　不同鈣處理葡萄柚果實(shí)失重率、硬度變化Fig.1　Fruit weight loss and firmness of grapefruit under different calcium treatments

2.2葡萄柚果實(shí)采后細(xì)胞壁物質(zhì)含量的變化

2.2.1 果實(shí)乙醇不溶物含量變化果實(shí)乙醇不溶物含量可間接衡量果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)降解程度。乙醇不溶物含量越少，說明細(xì)胞壁物質(zhì)降解越多，果實(shí)軟化越快。鈣處理明顯抑制了乙醇不溶物含量的下降(圖2A)，貯藏后期采后鈣處理果實(shí)乙醇不溶物含量仍保持較高水平。

2.2.2 果實(shí)水溶性果膠(WSP)含量變化從圖2B看出，貯藏過程中葡萄柚果實(shí)WSP含量呈明顯持續(xù)上升趨勢，與果實(shí)硬度變化呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.900**)。鈣處理明顯抑制果實(shí)WSP含量上升。其中，采后鈣處理抑制貯藏后期WSP含量增加，其含量與硬度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.839**),而采前鈣處理果實(shí)WSP含量變化趨勢與對照相似，但其含量極顯著低于其它2種處理, 與硬度變化呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.836**)。

2.2.3 果實(shí)離子型果膠(ESP)含量變化果實(shí)ESP含量變化趨勢與WSP含量變化趨勢相似，隨果實(shí)硬度下降呈上升趨勢(圖2C)。采后果實(shí)ESP含量急劇增加，其含量與硬度呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.780**)，而鈣處理顯著地抑制了果實(shí)ESP含量增加，第30天后與對照差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)，兩種鈣處理ESP含量變化與果實(shí)硬度的下降呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.812**， r=-0.774**)。

圖2　不同鈣處理葡萄柚果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)變化Fig.2　Variation of cell wall components in grapefruit fruit under different calcium treatments

2.2.4 果實(shí)共價結(jié)合型果膠(SCSP)含量變化圖2D顯示，貯藏期間葡萄柚果實(shí)SCSP變化情況與WSP、ESP相反，隨果實(shí)軟化總體呈降低趨勢，與硬度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.785**)。采前鈣處理果實(shí)SCSP含量變化與對照變化趨勢相同，雖抑制SCSP含量降低，但與對照差異不顯著，其含量與硬度的相關(guān)性為極顯著正相關(guān)(r=0.851**)，而采后鈣處理使果實(shí)SCSP含量在整個貯藏期間維持在較高水平，與硬度變化顯著相關(guān)(r=0.566*)，極顯著(P<0.01)高于其他2組處理。

2.2.5 果實(shí)半纖維素(4KSF、24KSF)含量變化由圖2E可知，葡萄柚果實(shí)貯藏期間4KSF含量呈持續(xù)緩慢上升趨勢，與硬度下降呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.948**)。采前鈣處理果實(shí)4KSF含量變化趨勢與對照相似，略低于對照，與硬度也呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.798**); 采后鈣處理4KSF含量在貯藏過程中相對穩(wěn)定，極顯著(P<0.01)低于其他2組處理，與硬度的相關(guān)系數(shù)為-0.163。從圖2F可以看出，果實(shí)細(xì)胞壁組分24KSF含量在貯藏過程中持續(xù)減少,與硬度呈顯著正相關(guān)(r=0.777*)。采前鈣處理果實(shí)24KSF含量與對照變化趨勢相同，其含量略高于對照但差異不顯著; 采后鈣處理24KSF含量極顯著(P<0.01)高于其他2組處理。采前、采后鈣處理果實(shí)24KSF含量與硬度呈顯著正相關(guān)(r=0.608*和r=0.537*)2.3葡萄柚果實(shí)采后細(xì)胞壁降解酶活性變化及其基因表達(dá)

圖3　不同鈣處理葡萄柚果實(shí)PG酶活性變化及其基因表達(dá)Fig.3　Grapefruit fruit PG activity and its gene expression under different calcium treatments

2.3.2PME酶活性變化及其基因表達(dá)圖4A表明，采后葡萄柚果實(shí)PME活性維持在較高水平，隨貯藏時間延長呈下降趨勢，與硬度變化呈顯著正相關(guān)(r=0.586*)。采前鈣處理抑制了PME活性的升高，但與對照差異較小。采后鈣處理極顯著抑制貯藏初期PME活性，貯藏期間保持相對平穩(wěn)水平，與硬度的相關(guān)性不顯著(r=0.321)。PME基因表達(dá)量也保持較高水平(圖4B)，其含量變化波動不大。采前、采后鈣處理分別明顯抑制了貯藏后期、前期果實(shí)PME基因的表達(dá)水平。

2.3.3Cx酶活性變化及其基因表達(dá)圖5A顯示，葡萄柚果實(shí)Cx酶隨果實(shí)軟化其活性不斷上升，與硬度變化呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.813**)。采前鈣處理極顯著抑制貯藏后期酶活性，采后鈣處理酶活性始終維持在較低水平，兩種處理Cx分別與硬度的相關(guān)性不顯著(r=-0.384,r=-0.292)。貯藏期間，Cx基因的表達(dá)量持續(xù)增加(圖5B)，與其酶活性變化趨勢相一致。2種鈣處理均有效抑制了貯藏期間Cx基因的表達(dá)，其中采后鈣處理控制效果優(yōu)于采前鈣處理。

圖4　不同鈣處理對葡萄柚果實(shí)PME酶活性變化及其基因表達(dá)Fig.4　Grapefruit fruit PME activity and its gene expression under different calcium treatments

圖5　不同鈣處理葡萄柚果實(shí)Cx酶活性變化及其基因表達(dá)Fig.5　Grapefruit fruit Cx activity and its gene expression under different calcium treatments

圖6　不同鈣處理葡萄柚果實(shí)α-L-Af酶活性變化及其基因表達(dá)Fig.6　α-L-Af activity and its gene expression in grapefruit fruit under different calcium treatments

2.3.5β-Gal酶活性變化及其基因表達(dá)從圖7A看出，果實(shí)β-Gal酶與α-L-Af酶活性呈相似的變化規(guī)律，隨貯藏時間延長逐漸增強(qiáng)，與果實(shí)硬度呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.741**)。采前鈣處理顯著降低β-Gal活性，但未改變其變化趨勢。采后鈣處理極顯著抑制了貯藏末期β-Gal活性，其與硬度的相關(guān)性不顯著(r=-0.246)。相應(yīng)地，采后隨著果實(shí)后熟軟化β-Gal基因的表達(dá)量不斷增加(圖7B)，貯藏中期急劇增加。采前鈣處理對β-Gal調(diào)控作用不明顯。采后鈣處理幾乎完全抑制β-Gal基因表達(dá)量的增加。

圖7　不同鈣處理葡萄柚果實(shí)β-Gal酶活性變化及其基因表達(dá)Fig.7　Grapefruit fruit β-Gal activity and its gene expression under different calcium treatments

3　討論

果實(shí)成熟軟化衰老過程中，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)會發(fā)生很大的變化，使果實(shí)質(zhì)地發(fā)生改變。Knee和Bartele指出，果實(shí)細(xì)胞壁分子骨架是由纖維素的原纖維和半纖維素一起構(gòu)成，分散的果膠物質(zhì)通過多聚半乳糖醛酸、阿拉伯聚糖和半乳糖連接到纖維素-半纖維素復(fù)合體上，并與之交叉聯(lián)接，從而構(gòu)成果膠-纖維素-半纖維素(P-C-H)總體結(jié)構(gòu)[12]。細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)物質(zhì)果膠、半纖維素和纖維素等大分子多糖的解聚，均會對果實(shí)的質(zhì)地產(chǎn)生顯著的影響。本研究結(jié)果表明，葡萄柚果實(shí)采收時質(zhì)地較硬，細(xì)胞壁乙醇不溶物含量較高，果膠物質(zhì)以難溶的共價結(jié)合態(tài)果膠(SCSP)為主，貯藏期間隨后熟軟化，果實(shí)硬度下降，乙醇不溶物含量降低，共價結(jié)合態(tài)果膠解聚為易溶的水溶性果膠(WSP)和離子型果膠(ESP); 同時，果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)中高含量的難溶態(tài)半纖維素(24KSF)也解聚為易溶態(tài)半纖維素(4KSF)。細(xì)胞壁組分與硬度相關(guān)性分析結(jié)果表明，細(xì)胞壁物質(zhì)中WSP、ESP和4KSF與硬度達(dá)極顯著負(fù)相關(guān)，SCSP和24KSF分別與硬度呈極顯著、顯著正相關(guān)。這個結(jié)果與Brummell等[11]研究結(jié)論相一致，在果實(shí)成熟軟化過程中，硬度下降一般伴隨著果實(shí)難溶性果膠、半纖維素物質(zhì)含量的降低，易溶性果膠含量增加。

鈣是構(gòu)成細(xì)胞壁的重要元素，外源鈣處理能維持采后果實(shí)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，不同的鈣處理方法對細(xì)胞壁降解的抑制效果有一定影響[13]。本研究結(jié)果表明，鈣處理能減少AIR的損失，抑制WSP、ESP和4KSF含量上升，并使SCSP、24KSF含量保持在較高水平，表明鈣處理能明顯抑制貯藏過程中細(xì)胞壁物質(zhì)解聚。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)采后鈣處理的緊密結(jié)合型多糖(SCSP、24KSF)含量高于采前鈣處理含量，表明采后鈣處理對細(xì)胞壁物質(zhì)解聚的調(diào)控效果優(yōu)于采前鈣處理。目前關(guān)于Ca2+對果實(shí)細(xì)胞壁影響的解釋普遍認(rèn)為，Ca2+與細(xì)胞壁中果膠相結(jié)合形成Ca-果膠交聯(lián)聚合物，這種廣泛的交聯(lián)有利于果膠聚合物的集聚，形成細(xì)胞壁網(wǎng)絡(luò)，增加機(jī)械強(qiáng)度，同時減小細(xì)胞壁透性，限制了果實(shí)內(nèi)引起果肉軟化的酶或真菌病原體產(chǎn)生的導(dǎo)致果肉腐爛的酶通過，抑制中層膠物質(zhì)降解，保持較完整的微纖絲結(jié)構(gòu)，從而能有效地維持果實(shí)質(zhì)地品質(zhì)[14]。

大多數(shù)研究認(rèn)為，果實(shí)質(zhì)地軟化伴隨膳食纖維含量降低的主要原因是由細(xì)胞壁降解酶促進(jìn)細(xì)胞壁物質(zhì)的解聚，導(dǎo)致細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)的破壞，改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整穩(wěn)定性，從而影響果實(shí)硬度[15]。因此，細(xì)胞代謝過程中細(xì)胞壁降解酶起著非常重要的作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，貯藏期葡萄柚果實(shí)細(xì)胞壁降解酶PG、PME、Cx、α-L-Af和β-Gal活性均不同程度地增加，相關(guān)基因表達(dá)水平也呈現(xiàn)出不同程度的上升趨勢。PME活性在采收后表現(xiàn)出較高含量，而PG活性在貯藏前期急劇增加，其基因的表達(dá)量與酶活性變化趨勢基本一致。Cx、α-L-Af和β-Gal活性則呈增加趨勢，貯藏中、后期上升較快，相關(guān)酶基因的表達(dá)量亦明顯增加，但與酶活性變化趨勢并不一致。由此認(rèn)為，PME可能是啟動葡萄柚果實(shí)衰老軟化的重要酶，PG在葡萄柚軟化初期起明顯促進(jìn)作用，糖苷酶(α-L-Af、β-Gal)實(shí)質(zhì)性地參與了葡萄柚果實(shí)軟化進(jìn)程，并在果實(shí)軟化中、后期具有重要促進(jìn)作用。本研究中，PME、α-L-Af酶活性變化與其基因表達(dá)量變化不完全一致，Amnuaysin、Wei等對香蕉、蘋果的研究中也發(fā)現(xiàn)PME、α-L-Af基因的表達(dá)量變化與酶的活性變化并不完全一致[16，10]，可能是酶的活性既取決于基因的表達(dá)量，還取決于基因翻譯后的修飾調(diào)控[17]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，鈣處理顯著地降低果實(shí)細(xì)胞壁降解酶活性和基因表達(dá)水平，其中采后鈣處理對α-L-Af和β-Gal活性和基因表達(dá)在貯藏中、后期的調(diào)控作用較顯著，酶活性和基因表達(dá)均維持在較低水平。大量研究表明，外源鈣處理能顯著降低細(xì)胞壁降解酶活性，生長期鈣處理的白鳳桃貯藏階段果實(shí)PE、Cx活性維持在較低水平[13]，Ortiz對蘋果進(jìn)行采前、采后浸鈣處理試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鈣處理能夠抑制α-L-Af和β-Gal的活性，降低果膠溶解，保持中膠層結(jié)構(gòu)完整性，進(jìn)而有效保持果實(shí)硬度[18-19]。Siddiqui和Bangerth研究表明，細(xì)胞壁降解酶活性下降可能是通過鈣影響細(xì)胞內(nèi)pH值從而間接影響酶活性或提高果膠聚合度(鈣起交聯(lián)作用)，也可能是阻止外界水解酶的進(jìn)入，減少酶與底物的接觸，從而防止中膠層解體，增加細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度，維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整、穩(wěn)定性[20]。

4　結(jié)論

細(xì)胞壁降解酶參與葡萄柚果實(shí)衰老軟化進(jìn)程，PME可能是啟動葡萄柚果實(shí)衰老軟化的重要酶，PG和糖苷酶(α-L-Af、β-Gal)分別在果實(shí)軟化初期和中后期可能起著更為重要的促進(jìn)作用。采后鈣處理顯著抑制細(xì)胞壁物質(zhì)解聚，并且對糖苷酶(α-L-Af、β-Gal)活性及其基因表達(dá)具有更顯著的調(diào)控作用。

鈣處理抑制了細(xì)胞壁降解酶基因表達(dá)水平，降低了細(xì)胞壁降解酶活性，減緩了果膠、半纖維素的解聚，維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性, 因而外源鈣處理較好地維持了貯藏期間果實(shí)硬度。

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Effectsofcalciumtreatmentsoncellwallmaterialmetabolismandrelatedenzymeactivitiesandgeneexpressioningrapefruit(CitrusparadisiMacf.)

DENGJia1，SHIZheng-jun1*,WANGLian-chun2，WUHai-bo2,LIUHui-min1

(1 Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China, Ministry of Education, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2 College of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

【Objectives】StudyontheeffectofCatreatmentonthecellwallcomponents,thevariationsofcellwalldegradingenzymeactivitiesandtheexpressionofrelevantgeneswillhelptounderstandtherelationshipbetweentheCaandmetabolismofcellwallmaterials,explorethemechanismsofCatofruitsoftening,andprovidebasefortheimprovementoffruitbenchingtime. 【Methods】AfieldexperimentwascarriedoutingrapefruitorchardinYuxiCity,YunnanProvincein2012.Grapefruitcultivar‘Riored’wasusedastestedcrop.Therootstockofthecultivarwasgraftedin2005onalocalcultivarindensityof3m×3m.TheCatreatmentswerecomposedoftwoparts:duringfruitgrowingandafterharvest.Growingtreatmentwasfoliarspraying2%CaCl2solutionatveryyoungfruit,endofyoungfruit,earlyfruitexpansion,endoffruitexpansionandcolordevelopingstage.Afterharvesttreatment:theharvestedfruitsweresoakedin2%CaCl2solutionfor5min,thenstoredatroomtemperature.Fruitsamplesweretakenevery15daysandeachtimewith10fruitsduringthestorageforthemeasurementofrelativeitems.【Results】Thetightlyboundpectins(covalentboundpectin)weredissembledintolooselyboundpectins(watersolublepectin,ionboundpectin)withgrapefruitfruitripening.Thecontentsoftightlyboundhemicelluloses(24%KOH-solublefraction)decreasedwhilelooselyboundhemicelluloses(4%KOH-solublefraction)increased.Theactivityandtheexpressionofcellwallenzymesgenesincreasedasfruitsoftened.PMEexpressedhighlevelsafterharvest.ThelevelofPGactivityincreasedintheearlystageofstoragewhilePGexpressionchangedsimilartoenzymetendency.TheactivitiesofCx,α-L-Afandβ-Galacceleratedinthemiddleandlaterstageofstoragerespectively，andtheirexpressionwereobviouslyenhancedduringstorage.Calciumtreatmenthadsignificantlyinhibitedcellwallenzymeactivitiesandgeneexpression.Calciumtreatmentdramaticallyregulatedtheactivityofα-L-Af,β-Galactivityinmiddlestageofstorageandlaterstage,respectively.Theenzymeactivities,geneexpressionsofα-L-Afandβ-Galhadnoticeablylowerlevelsincalciumtreatments. 【Conclusions】Calciumtreatmentscouldreducetheactivitiesofwall-degradingenzymes,theexpressionofrelevantgenes,andinhibitthedissemblingofwallmaterials.Therefore,calciumtreatmentiseffectiveinmaintainingfruittexturequalityandprolongingthebenchingperiod.

grapefruit;calcium;cellwallmaterial;cellwalldegradingenzyme;geneexpression

2014-07-17接受日期: 2015-03-16網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-05-20

教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研基金項目(KLESWFU-1405); 國家林業(yè)局項目([2010]47); 高校引進(jìn)人才科研基金啟動項目(111406)資助。作者簡介: 鄧佳(1983—)，女，云南昆明人，博士，講師，主要從事果樹栽培與利用研究。E-mail:dengjia1983@163.com

E-mail:shizhengjun1979@163.com

S666.3;S606+.2

A

1008-505X(2016)02-0450-09