內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物上調(diào)4周運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌收縮功能和線粒體生物合成*

邱 霓， 方偉進(jìn)， 李 聰， 李曉媚， 熊 燕

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州蛇毒研究所，廣東廣州511436)

內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物上調(diào)4周運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌收縮功能和線粒體生物合成*

邱 霓， 方偉進(jìn)， 李 聰， 李曉媚， 熊 燕△

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州蛇毒研究所，廣東廣州511436)

目的:觀察內(nèi)源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)及其信號(hào)通路在4周運(yùn)動(dòng)大鼠NO水平及骨骼肌收縮功能與線粒體生物合成中的調(diào)節(jié)作用。方法:建立4周運(yùn)動(dòng)大鼠模型，檢測(cè)離體比目魚肌對(duì)電刺激的單次、強(qiáng)直和疲勞收縮的最大張力;并檢測(cè)骨骼肌中ATP和線粒體DNA含量以及過氧化物酶增殖體受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子(NRF)mRNA的表達(dá)以反映線粒體生物合成及功能;用高效液相色譜測(cè)定血清ADMA濃度;用Western blot法檢測(cè)骨骼肌中內(nèi)源性ADMA生成酶PRMT1和ADMA代謝酶DDAH 2種亞型以及NOS 3種亞型蛋白的表達(dá);用比色法測(cè)定NOS活性及一氧化氮(NO)含量等。結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組大鼠比目魚肌對(duì)電刺激誘導(dǎo)的各種收縮張力均明顯增強(qiáng)，比目魚肌ATP含量、線粒體DNA含量和PGC-1α、NRF mRNA增加顯著(P＜0.01)。運(yùn)動(dòng)組大鼠比目魚肌中構(gòu)成型NOS(cNOS)的蛋白表達(dá)及其NOS活性明顯上調(diào)(P＜0.01)，而NO含量?jī)H小幅增加(P＜0.05);同時(shí)，4周運(yùn)動(dòng)增加大鼠血清ADMA濃度，并伴有骨骼肌DDAH2表達(dá)下調(diào)。結(jié)論:短期耐力運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)比目魚肌單次收縮、強(qiáng)直收縮和抗疲勞收縮肌功能，其機(jī)制可能與過度增加的cNOS促使ADMA水平反饋性升高，從而維持骨骼肌NO低幅度增加，促進(jìn)線粒體生物合成有關(guān)。

耐力運(yùn)動(dòng);骨骼肌;收縮功能;一氧化氮;線粒體生物合成

一氧化氮(nitric oxide，NO)作為一種氣體分子，已被證實(shí)廣泛參與機(jī)體心血管、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)的生理、病理信號(hào)調(diào)節(jié)，如松弛血管平滑肌、增加血流量、阻礙血小板聚集黏附、參與機(jī)體抗感染、抗炎癥及增加認(rèn)知記憶等［1］。然而NO對(duì)骨骼肌功能的調(diào)控卻具有雙面性:一方面適量或“低濃度”的NO增加骨骼肌內(nèi)血流量，促進(jìn)骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取、利用，增加骨骼肌的收縮能力;另一方面過量或“高濃度”的NO則可與線粒體產(chǎn)生的超氧陰離子形成過氧硝酸根離子，導(dǎo)致骨骼肌內(nèi)線粒體呼吸受到抑制，肌肉收縮能力降低，產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性疲勞［2-3］。

在體內(nèi)NO是由其前體L-精氨酸(L-arginine，LArg)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化下轉(zhuǎn)化而來。NOS作為生成NO的重要限速酶，它的表達(dá)及活性都影響組織中NO的含量;已知NOS 有3種亞型，即神經(jīng)元型 NOS(neuronal NOS，nNOS)、內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)和誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS，iNOS)，前2種又合成為構(gòu)成型NOS(constitutive NOS，cNOS)。這3種亞型的NOS在骨骼肌中均表達(dá)但不盡相同，有研究報(bào)道，eNOS主要在骨骼肌的I型肌纖維高表達(dá)，而nNOS則主要表達(dá)于II型肌纖維［4］。機(jī)體存在一種調(diào)節(jié)NO合成的內(nèi)源性機(jī)制，即L-Arg的同系物——非對(duì)稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)可與L-Arg競(jìng)爭(zhēng)NOS，從而抑制NO的生成;因此，ADMA被確定為NOS主要的內(nèi)源性抑制物［5］。體內(nèi)ADMA主要由蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(protein arginine methyltransferase 1，PRMT1)催化含精氨酸殘基的蛋白質(zhì)甲基化生成含ADMA殘基的蛋白質(zhì)，再經(jīng)蛋白水解釋放出游離的ADMA;除了少部分經(jīng)腎臟排泄以外，內(nèi)源性ADMA主要經(jīng)二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)代謝消除［6-7］，已知DDAH現(xiàn)有2種亞型，即DDAH1和DDAH2，均在骨骼肌有表達(dá);由此可見，PRMT1和DDAH是決定內(nèi)源性ADMA濃度的關(guān)鍵因子。它們與ADMA構(gòu)成的PRMT1-ADMA-DDAH通路共同調(diào)節(jié)體內(nèi)NOS活性及NO的生成。

研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)或短時(shí)間中低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可增加骨骼肌NOS活性和NO含量，而長(zhǎng)期高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)或一次性力竭運(yùn)動(dòng)則顯降低骨骼肌NOS活性，減少NO含量［8-10］，但其調(diào)控機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，無論是在靜息狀態(tài)下還是在運(yùn)動(dòng)時(shí)，給予外源性NOS抑制物N-硝基-L-精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)均可抑制腓腸肌中NO含量［11］。因此，亟待證明內(nèi)源性 NOS抑制物ADMA及其信號(hào)通路PRMT1-ADMA-DDAH是否參與運(yùn)動(dòng)時(shí)骨骼肌組織NO生成的調(diào)節(jié)。本研究擬以耐力運(yùn)動(dòng)4周大鼠模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察短期耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠比目魚肌收縮功能以及骨骼肌組織NOS表達(dá)和NO含量的影響，再進(jìn)一步檢測(cè)骨骼肌組織線粒體生物合成與功能以及PRMT1-ADMA-DDAH通路的變化，為闡明內(nèi)源性NOS抑制物及其信號(hào)通路調(diào)控骨骼肌收縮功能與線粒體生物合成提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑

羊抗鼠DDAH1和DDAH2抗體購自Abcam;兔抗鼠PRMT1、nNOS、eNOS、iNOS和GAPDH抗體均購自 Santa Cruz;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)和ATP含量檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;NO含量和NOS活性檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物研究所;ECL發(fā)光試劑購自Cell Signaling Technology;過氧化物酶增殖體受體γ輔激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)、核呼吸因子(nuclear respiratory factor-1，NRF)、GAPDH、細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ(cytochrome oxidase subunitⅠ，COXⅠ)和β-actin引物由Invitrogen合成;RT-PCR試劑盒購于TaKa-Ra;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 動(dòng)物模型制備及分組

體重為180～200 g的SPF級(jí)健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［合格證號(hào)為SYXK(粵):2010-0104］。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為2組:正常對(duì)照(control)組常規(guī)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水;運(yùn)動(dòng)(running)組除與正常對(duì)照組一樣給予正常進(jìn)食及飲水外，還按文獻(xiàn)方法［12］制備跑步運(yùn)動(dòng)大鼠模型:第1周為跑步適應(yīng)期，先以10 m/min的速度跑10 min，然后以每天2 m/ min速度遞增，時(shí)間遞增10 min，直到速度為20 m/mim、時(shí)間60 min的強(qiáng)度;從第2周起，大鼠每天先以15 m/min的速度跑15 min，再以20 m/min的速度跑60 min，最后以15 m/min的速度跑15 min，每周跑5 d，共跑4周。確保正常對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組大鼠的初始體重?zé)o顯著性差別，并于每周對(duì)大鼠體重進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

3 主要方法

3.1 骨骼肌收縮功能的測(cè)定 用10%水合氯醛麻醉大鼠(30 mg/kg，腹腔注射)，先經(jīng)頸動(dòng)脈插管收集血標(biāo)本;再迅速分離骨骼肌，置于預(yù)冷及充氧(95% O2和5%CO2)的K-H緩沖液中;將肌條固定于充滿K-H緩沖液的浴槽中，連接PowerLab八道電生理記錄儀和Labchart7數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng);肌條的單刺激、強(qiáng)直刺激收縮張力和疲勞收縮張力參照本實(shí)驗(yàn)室已建立的測(cè)定方法［13］，具體參數(shù)如下:在37℃恒溫和充氧(95%O2和5%CO2)狀態(tài)下，調(diào)節(jié)肌條于最適長(zhǎng)度，平衡15 min后，給予10 V電壓、100 ms波寬的單個(gè)脈沖電刺激肌條，記錄肌條的單刺激收縮張力;換液并平衡15 min后，給予10 V電壓、0.5 ms波寬、60 Hz頻率的電刺激肌條2 s，記錄強(qiáng)直收縮張力;再換液平衡15 min后進(jìn)行疲勞測(cè)試，給予10 V電壓，0.5 ms波寬，60 Hz頻率的電刺激，每間隔1 s刺激1次，共持續(xù)100 s，每隔20 s記錄疲勞收縮張力。

3.2 骨骼肌ATP含量的測(cè)定 采用熒光素酶法，嚴(yán)格按照碧云天生物技術(shù)研究所提供的ATP檢測(cè)試劑盒說明書步驟測(cè)定骨骼肌中ATP含量，通過多功能酶標(biāo)儀讀取相對(duì)光單位值(relative light unit，RLU)，用標(biāo)準(zhǔn)品以相同方法做出標(biāo)準(zhǔn)曲線后，計(jì)算出各組大鼠骨骼肌中的ATP含量。

3.3 骨骼肌線粒體生物合成的測(cè)定 以線粒體DNA含量來反映線粒體生物合成情況，前者又可用線粒體基因COXⅠ與核基因β-actin的拷貝數(shù)比值來表示。提取骨骼肌的總DNA，取100 ng基因組DNA為模板以 COXⅠ和 β-actin引物(表1)進(jìn)行PCR反應(yīng);PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下拍照后進(jìn)行灰度掃描，以COXⅠ與β-actin mRNA的相對(duì)灰度值反映線粒體生物合成情況。

3.4 線粒體生物合成調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄水平變化

采用TRIzol提取骨骼肌中總RNA，通過RT-PCR檢測(cè)線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PGC-1α及其下游因子NRF轉(zhuǎn)錄情況;PGC-1α和NRF引物見表1。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下拍照后進(jìn)行灰度掃描，并以目的基因與GAPDH mRNA的灰度比值反映基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-PCR

3.5 骨骼肌NOS活性、NO水平及SOD活性、MDA含量的測(cè)定 骨骼肌中NOS活性及NO含量用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測(cè)定，其中NO含量測(cè)定采用硝酸還原酶法;骨骼肌中SOD活性和MDA含量按照碧云天生物有限公司試劑盒說明書進(jìn)行操作。

3.6 骨骼肌NOS蛋白和PRMT1/DDAH蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)骨骼肌中NOS和PRMT1/DDAH通路蛋白表達(dá)情況。取30 mg大鼠比目魚肌剪碎，加入RIPA裂解液制備10%組織勻漿液;在4℃下離心10 min(12 000 r/min)，定量后每個(gè)樣本取30 μg蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，I抗4℃搖晃過夜，加辣根過氧化酶標(biāo)記的II抗室溫孵育2 h，最后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，用凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDocTMXRS+System，Bio-Rad)掃描后進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析。

3.7 血清ADMA含量的測(cè)定 大鼠血清中ADMA含量采用高效液相色譜法測(cè)定。取1 mL血清加入20 mg 5-磺基水楊酸混勻，冰上靜置10 min，于4℃下離心10 min(2 000×g)，取10 μL上清與100 μL O-鄰苯二醛反應(yīng)液混勻，室溫放置3 min，進(jìn)樣進(jìn)行熒光檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為338 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為425 nm。通過比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的峰下面積計(jì)算出樣本ADMA含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 耐力運(yùn)動(dòng)4周對(duì)大鼠骨骼肌收縮功能的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)正常對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組大鼠體重?zé)o顯著差別;同時(shí)，從2組分離出來的比目魚肌的凈重以及最適初長(zhǎng)度也無顯著差異。但與正常對(duì)照組比較，耐力運(yùn)動(dòng)4周顯著提高大鼠比目魚肌的單次收縮和強(qiáng)直收縮張力;同時(shí)還在疲勞刺激的60 s、80 s和100 s各時(shí)點(diǎn)明顯增加比目魚肌的疲勞收縮張力，提示4周耐力運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)大鼠比目魚肌的收縮功能和耐疲勞能力，見圖1。

Figure 1.The effects of running on the contraction of rat skeletal muscles.A:the twitch tension and tetanic tension;B:the fatigue test of rat soleus muscle.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖1 運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌收縮功能的影響

2 耐力運(yùn)動(dòng)4周對(duì)大鼠骨骼肌內(nèi)線粒體功能和線粒體生物合成的影響

結(jié)果如圖2所示，運(yùn)動(dòng)組大鼠比目魚肌內(nèi)ATP含量均明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，同時(shí)運(yùn)動(dòng)4周明顯增加大鼠比目魚肌中線粒體基因COX I與核基因β-actin的拷貝數(shù)比值。

Figure 2.The effects of running on ATP content，mitochondrial biogenesis and its regulation in rat skeletal muscles.Mean±SD.n= 5.＊＊P＜0.01 vs control.圖2 運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌ATP含量、線粒體生物合成及線粒體功能調(diào)控的影響

調(diào)控線粒體生物合成和線粒體功能的重要轉(zhuǎn)錄輔助因子PGC-1α，可通過與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并募集NRF等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)線粒體生物合成;結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)組大鼠比目魚肌中PGC-1α和NRF轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于正常對(duì)照組。以上這些結(jié)果提示，運(yùn)動(dòng)4周增加正常大鼠比目魚肌的線粒體生物合成和線粒體功能。

3 耐力運(yùn)動(dòng)4周對(duì)大鼠骨骼肌NOS活性、蛋白表達(dá)及NO含量的影響

與正常對(duì)照組比較，4周耐力運(yùn)動(dòng)明顯增加大鼠比目魚肌中nNOS和eNOS蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，一定程度增加iNOS蛋白的表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;此外，4周耐力運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織NOS活性顯著增強(qiáng)(P＜0.01)。然而，骨骼肌組織NO水平的相對(duì)增加幅度較NOS的表達(dá)及活性小，見圖3。

4 耐力運(yùn)動(dòng)4周對(duì)大鼠血清ADMA水平和骨骼肌PRMT1、DDAH蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，耐力運(yùn)動(dòng)4周對(duì)大鼠比目魚肌中內(nèi)源性NOS抑制物ADMA的代謝酶DDAH2的蛋白表達(dá)降低，但另一亞型代謝酶DDAH1和內(nèi)源性ADMA生成酶PRMT1的蛋白表達(dá)變化不明顯，致使運(yùn)動(dòng)4周大鼠血清內(nèi)源性ADMA濃度比正常對(duì)照組有所升高，見圖4。

Figure 3.The effects of running on the expression and activity of NOS and NO content in rat skeletal muscles.A:the protein expression of NOS subunits;B:NOS activity;C:NO content in the rat soleus.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖3 運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌NOS活性和NO含量的影響

Figure 4.The effects of running on serum ADMA content and protein expressions of PRMT1，DDAH in rat skeletal muscles.A:the serum ADMA content;B:protein expression of PRMT1，DDAH1 and DDAH2 in rat soleus.Mean±SD.n=5.圖4 運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血清ADMA含量及骨骼肌PRMT1、DDAH蛋白的影響

5 耐力運(yùn)動(dòng)4周對(duì)大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激的影響

本研究通過檢測(cè)骨骼肌SOD活性及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量來反映氧化應(yīng)激狀態(tài)。結(jié)果如圖5所示，與正常對(duì)照組比較，運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌中SOD活性顯著升高，而MDA含量明顯降低，提示4周耐力運(yùn)動(dòng)可降低大鼠骨骼肌組織中的氧化應(yīng)激水平。

討論

適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)有助于增強(qiáng)骨骼肌的收縮能力，但過度的運(yùn)動(dòng)卻降低骨骼肌的收縮能力，引起骨骼肌損傷;線粒體作為細(xì)胞的主要供能場(chǎng)所，其功能與骨骼肌的收縮能力密切相關(guān)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，4周耐力運(yùn)動(dòng)明顯增加骨骼肌的收縮功能和抗疲勞能力，推測(cè)可能是由于短期的耐力運(yùn)動(dòng)增加了骨骼肌線粒體功能和線粒體生物合成所致。本研究進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織ATP含量和線粒體DNA含量增加;不僅如此，本研究還發(fā)現(xiàn)，4周耐力運(yùn)動(dòng)上調(diào)促進(jìn)線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PGC-1α及其下游NRF的基因轉(zhuǎn)錄。上述結(jié)果均提示短期耐力運(yùn)動(dòng)增加線粒體生物合成和線粒體功能，但短期耐力運(yùn)動(dòng)上調(diào)線粒體生物合成的機(jī)制并不完全清楚。

越來越多的研究表明，NO對(duì)骨骼肌細(xì)胞能量代謝和線粒體生物合成調(diào)節(jié)有著雙重調(diào)節(jié)作用［15］。Nisoli等［16］認(rèn)為NO對(duì)心肌線粒體的作用具有濃度依賴性，高濃度的NO可抑制線粒體呼吸，而低濃度NO有利于提高線粒體呼吸功能和氧化代謝能力。最近本實(shí)驗(yàn)室研究還發(fā)現(xiàn)，限食8周可低幅度增加NO水平，明顯增加正常大鼠骨骼肌的收縮功能和線粒體生物合成［17］。一方面，NO可通過sGC-cGMP依賴途徑，激活線粒體生物合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α，增加線粒體生物合成;另一方面，NO又可與超氧陰離子反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)大的超氧亞硝酸陰離子(ONOO-)，氧化抑制呼吸鏈的酶活性，誘發(fā)或加重氧化應(yīng)激［18-19］。研究表明，劇烈運(yùn)動(dòng)迅速升高NO水平，導(dǎo)致骨骼肌大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生;相反，慢性適度運(yùn)動(dòng)緩慢增加NO水平，且維持在低濃度水平，低水平的NO減少與超陽陰離子的反應(yīng)，抗氧化酶活性增強(qiáng)，ROS增加不明顯［20］。本研究結(jié)果表明，4周耐力運(yùn)動(dòng)低幅度增加NO水平，增加ATP含量和線粒體生物合成及其調(diào)節(jié)因子PGC-1α和NRF的轉(zhuǎn)錄，使骨骼肌收縮功能和耐疲勞能力增強(qiáng);同時(shí)，4周耐力運(yùn)動(dòng)明顯增加骨骼肌抗氧化酶SOD的活性，并降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量，提示短期耐力運(yùn)動(dòng)降低骨骼肌組織氧化應(yīng)激。

Figure 5.The effects of running on SOD activity(A)and MDA content(B)in rat skeletal muscles.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖5 運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌SOD活性和MDA含量的影響

短期耐力運(yùn)動(dòng)增加大鼠骨骼肌組織NO含量，主要是由于上調(diào)NOS的表達(dá)及活性，增加NO的生成;本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了有力的證據(jù)，4周耐力運(yùn)動(dòng)明顯增加大鼠比目魚肌中nNOS和eNOS的蛋白表達(dá)。大多認(rèn)為運(yùn)動(dòng)增加NOS活性和蛋白表達(dá)的主要機(jī)制可能與切應(yīng)力的調(diào)節(jié)有關(guān);有文獻(xiàn)報(bào)道，運(yùn)動(dòng)增加心輸出量，導(dǎo)致血流在各器官重新分配，骨骼肌內(nèi)血流量增加，導(dǎo)致肌肉內(nèi)血管剪切力增大，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞NOS mRNA的表達(dá)，使NOS活性增強(qiáng)，進(jìn)而增加NO的生成，提高運(yùn)動(dòng)能力［21］。然而4周耐力運(yùn)動(dòng)僅增加eNOS和nNOS的蛋白表達(dá)，可能與NOS同工酶的分布有一定關(guān)系;有研究表明，人和嚙齒類動(dòng)物骨骼肌主要表達(dá)nNOS和eNOS，其中nNOS分布在肌纖維膜上，而eNOS分布在線粒體附近;由于eNOS分布的特殊性，eNOS-/-突變小鼠骨骼肌中線粒體酶的活力和氧化磷酸化水平降低，PCG-1α基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)，線粒體密度和DNA水平下降［22］。

機(jī)體還存在一種調(diào)節(jié)NO生成的內(nèi)源性機(jī)制，ADMA作為NOS的內(nèi)源性抑制物，可減少NO的生成;我室和國(guó)內(nèi)外學(xué)者大量研究表明，內(nèi)源性ADMA升高是心血管疾病和糖尿病心血管并發(fā)癥的共同危險(xiǎn)因子。內(nèi)源性ADMA的濃度主要是被PRMT1和DDAH共同調(diào)節(jié)的［6-7］;因此，本研究檢測(cè)了大鼠血清ADMA濃度和骨骼肌中 PRMT1、DDAH1和DDAH2的蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)4周大鼠血清ADMA濃度比對(duì)照組大鼠略有升高;而運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌組織DDAH2蛋白表達(dá)的明顯下調(diào)。這些結(jié)果雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性，但結(jié)合NOS蛋白和活性大幅度增加，而NO水平增加幅度相對(duì)較小，暗示4周耐力運(yùn)動(dòng)大鼠的骨骼肌已開始啟動(dòng)對(duì)NO水平增加的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，ADMA作為內(nèi)源性NOS抑制物可能在防止骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷中起重要作用。然而，長(zhǎng)期高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)或一次性力竭運(yùn)動(dòng)明顯降低骨骼肌內(nèi)NOS活性、減少 NO含量，是否與 PRMT1-ADMDDAH通路的相應(yīng)變化有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究證明。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)4周耐力運(yùn)動(dòng)提高骨骼肌NO水平，促進(jìn)線粒體生物合成，增強(qiáng)正常大鼠比目魚肌的單次收縮、強(qiáng)直收縮以及疲勞收縮肌張力;而維持骨骼肌內(nèi)NO水平的穩(wěn)定有賴于NOS和ADMA之間的平衡調(diào)控。這些結(jié)果將為闡明短期耐力運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)正常大鼠比目魚肌收縮功能提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

［1］ Hirst DG，Robson T.Nitric oxide physiology and patholo-gy［J］.Methods Mol Biol，2011，704:1-13.

［2］ Eghbalzadeh K，Brixius K，Bloch W，et al.Skeletal muscle nitric oxide(NO)synthases and NO-signaling in"diabesity"——what about the relevance of exercise training interventions?［J］.Nitric Oxide，2014，37:28-40.

［3］ Tengan CH，Rodrigues GS，Godinho RO.Nitric oxide in skeletal muscle:role on mitochondrial biogenesis and function［J］.Int J Mol Sci，2012，13(12):17160-17184.

［4］ Stamler JS，Meissner G.Physiology of nitric oxide in skeletal muscle［J］.Physiol Rev，2001，81(1):209-237.

［5］ Vallance P，Leone A，Calver A，et al.Endogenous dimethylarginine as an inhibitor of nitric oxide synthesis［J］.J Cardiovasc Pharmacol，1992，20(Suppl 12):S60-S62.

［6］ Boisvert FM，Cote J，Boulanger MC，et al.A proteomic analysis of arginine methylated protein complexes［J］.Mol Cell Proteomics，2003，2(12):1319-1330.

［7］ MacAllister RJ，Parry H，Kimoto M，et al.Regulation of nitric oxide synthesis by dimethylarginine dimethylaminohydrolase［J］.Br J Pharmacol，1996，119(8):1533-1540.

［8］ McConell GK，Bradley SJ，Stephens TJ，et al.Skeletal muscle nNOS mu protein content is increased by exercise training in humans［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，93(2):R821-R828.

［9］ Cocks M，Shaw CS，Shepherd SO，et al.Sprint interval and endurance training are equally effective in increasing muscle microvascular density and eNOS content in sedentary males［J］.J Physiol，2013，591(Pt 3):641-656.

［10］ Song W，Kwak HB，Kim JH，et al.Exercise training modulates the nitric oxide synthase profile in skeletal muscle from old rats［J］.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2009，64(5):540-549.

［11］車力龍，歐陽馳，肖德生.長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腓腸肌的損傷及一氧化氮的調(diào)節(jié)作用［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12(42):8294-8298.

［12］Dolinsky VW，Jones KE，Sidhu RS，et al.Improvements in skeletal muscle strength and cardiac function induced by resveratrol during exercise training contribute to enhanced exercise performance in rats［J］.J Physiol，2012，590 (Pt 11):2783-2799.

［13］El-Khoury R，Bradford A，O'Halloran KD.Chronic hypobaric hypoxia increases isolated rat fast-twitch and slowtwitch limb muscle force and fatigue［J］.Physiol Res，2012，61(2):195-201.

［14］Yan Z，Lira VA，Greene NP.Exercise training-induced regulation of mitochondrial quality［J］.Exerc Sport Sci Rev，2012，40(3):159-164.

［15］Tengan CH，Rodrigues GS，Godinho RO.Nitric oxide in skeletal muscle:role on mitochondrial biogenesis and function［J］.Int J Mol Sci，2012，13(12):17160-17184.

［16］Nisoli E，Cozzi V，Carruba MO.Amino acids and mitochondrial biogenesis［J］.Am J Cardiol，2008，101(11A): 22E-25E.

［17］邱 霓，李 聰，方偉進(jìn)，等.限食8周對(duì)大鼠不同類型骨骼肌收縮功能及線粒體生物合成的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2015，31(2):193-200.

［18］Lira VA，Brown DL，Lira AK，et al.Nitric oxide and AMPK cooperatively regulate PGC-1 in skeletal muscle cells［J］.J Physiol，2010，588(Pt 18):3551-3566.

［19］Powers SK，Talbert EE，Adhihetty PJ.Reactive oxygen and nitrogen species as intracellular signals in skeletal muscle［J］.J Physiol，2011，589(Pt9):2129-2138.

［20］Sahlin K，Shabalina IG，Mattsson CM，et al.Ultraendurance exercise increases the production of reactive oxygen species in isolated mitochondria from human skeletal muscle［J］.J Appl Physiol，2010，108(4):780-787.

［21］Whyte JJ，Laughlin MH.The effects of acute and chronic exercise on the vasculature［J］.Acta Physiol(Oxf)，2010，99(4):441-450.

［22］Momken I，F(xiàn)ortin D，Serrurier B，et al.Endothelial nitric oxide synthase(NOS)deficiency affects energy metabolism pattern in murine oxidative skeletal muscle［J］.Biochem J，2002，368(Pt 1):341-347.

(責(zé)任編輯:陳妙玲，余小慧)

Endogenous nitric oxide synthase inhibitor increase skeletal muscle contractility and mitochondria biosynthesis in 4-week running rats

QIU Ni，F(xiàn)ANG Wei-jin，LI Cong，LI Xiao-mei，XIONG Yan

(Guangzhou Institute of Snake Venom Research，School of Pharmaceutical Sciences，Guangzhou Medical University，Guangzhou 511436，China.E-mail:xiongyan2001@yahoo.com)

AIM:To observe the effect of endogenous nitric oxide synthase(NOS)inhibitor asymmetric dimethylarginine(ADMA)and its signaling pathways on NO levels and skeletal muscle contractility in 4-week running rats.METHODS:The 4 weeks running rat model was established.The twitch tension，tetanic tension and the fatigue test of soleus muscle induced by electrical stimulation ex vivo were detected.The ATP content，mitochondrial DNA levels and the mRNA expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α(PGC-1α)，nuclear respiratory factor(NRF) were measured to reflect the mitochondrial function and biosynthesis in the skeletal muscle.Serum ADMA concentration was detected by high performance liquid chromatography.The endogenous ADMA enzymes PRMT1 and 2 subtypes of ADMA metabolism enzyme DDAH，3 subtypes of NOS protein expression in the skeletal muscle were determined by Western blot.NOS activity and nitric oxide(NO)content were analyzed by colorimetric method.RESULTS:Compared with normal control group，the twitch tension，tetanic tension and the anti-fatigue capability of soleus muscle in running group were significantly enhanced，ATP content，mitochondrial DNA content and the mRNA expression of PGC-1α and NRF were significantly increased(P＜0.01).In addition，the protein expression of constitute type NOS(cNOS)and NOS activity were significantly increased(P＜0.01)，but the increase in NO content was relatively smaller in soleus muscle in exercise group(P＜0.05).Moreover，serum ADMA concentration in running group was increased，while the DDAH2 expression in skeletal muscle was decreased.CONCLUSION:Short-term endurance exercise enhances the twitch tension，tetanic tension and fatigue resist-ance of soleus muscle.The mechanism may be that increased cNOS expression feedbacks to increase ADMA concentration，thus maintaining the increase in NO synthesis at a relatively low level，and resulting in promoting skeletal muscle mitochondria biosynthesis and mitochondrial function.

Endurance exercise;Skeletal muscle;Contractile function;Nitric oxide;Mitochondria biogenesis

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.017

1000-4718(2016)07-1259-07

2015-12-18

2016-05-11

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81170778);廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.20138021800098);廣州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2014J4100067)

△Tel:020-37103273;E-mail:xiongyan2001@yahoo.com