唑來膦酸抑制U937細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡*

范蕊芳， 劉玲玲， 張 玲， 郭小燕， 王曉珍， 林東軍△

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液科，廣東廣州510630;2廣東省婦女兒童醫(yī)院兒科，廣東廣州510010)

唑來膦酸抑制U937細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡*

范蕊芳1， 劉玲玲1， 張 玲1， 郭小燕2， 王曉珍1， 林東軍1△

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液科，廣東廣州510630;2廣東省婦女兒童醫(yī)院兒科，廣東廣州510010)

目的:研究唑來膦酸(ZOL)對人類急性髓系白血病細(xì)胞U937的增殖抑制及促凋亡作用。方法: CCK-8法檢測不同時(shí)間ZOL對U937細(xì)胞的生長抑制率;流式細(xì)胞術(shù)檢測ZOL對U937細(xì)胞周期的影響;Annexin V-PI法及Hoechst 33342法檢測ZOL作用前后細(xì)胞凋亡情況變化，JC-1檢測ZOL對U937細(xì)胞線粒體膜電位變化的影響;克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測U937細(xì)胞克隆形成能力;Western blot法檢測ZOL對U937細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果:CCK-8結(jié)果顯示ZOL可以抑制U937細(xì)胞的活力，并呈時(shí)間-劑量依賴性;Annexin V-PI及Hoechst 33342結(jié)果顯示ZOL可以促進(jìn)U937細(xì)胞凋亡，且呈時(shí)間-劑量依賴性;JC-1結(jié)果顯示ZOL可以明顯降低U937細(xì)胞線粒體膜電位;PI法證實(shí)ZOL將U937細(xì)胞周期阻滯在S期，克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)0.2 mmol/L ZOL可以完全抑制U937細(xì)胞的克隆形成能力;Western blot結(jié)果顯示ZOL作用于U937細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21表達(dá)顯著增強(qiáng)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)增強(qiáng)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯減弱。結(jié)論:ZOL抑制U937細(xì)胞的增殖和克隆形成主要是由于抑制了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)，同時(shí)ZOL可以促進(jìn)U937細(xì)胞凋亡，這種作用主要是通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白來實(shí)現(xiàn)的。

唑來膦酸;U937細(xì)胞;細(xì)胞周期;細(xì)胞凋亡

急性髓系白血病是一組由造血干細(xì)胞惡變引起的惡性克隆性疾病，它是以骨髓中幼稚的腫瘤細(xì)胞增殖浸潤，進(jìn)而影響正常造血功能，臨床主要表現(xiàn)為貧血、出血、感染。目前臨床上對于白血病的原發(fā)病治療有化療、分子靶向治療和造血干細(xì)胞移植等手段。造血干細(xì)胞移植由于需要嚴(yán)格的配型、費(fèi)用大及移植物抗宿主病等缺點(diǎn)限制了其廣泛開展，傳統(tǒng)的化療方案雖然能使50%～75%患者獲得完全緩解，但只有20%～30%患者獲長期無病生存，大部分獲得完全緩解的患者2年內(nèi)復(fù)發(fā)、死亡，如何提高化療藥物的敏感性、降低耐藥率成為亟待解決的問題。分子靶向治療一直是近十年來白血病治療的研究熱點(diǎn)，分子靶向藥物與常規(guī)化療方案聯(lián)合以提高治療效果，減少耐藥，為復(fù)發(fā)難治性白血病患者提供新的治療策略。

唑來膦酸(zoledronic acid，ZOL)是第3代雙膦酸鹽類藥物，主要通過抑制破骨細(xì)胞活性和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡來抑制骨吸收，用于治療惡性高鈣血癥、多發(fā)性骨髓瘤及其它惡性腫瘤導(dǎo)致的骨質(zhì)破壞。近年來國內(nèi)外多項(xiàng)臨床前及臨床研究表明唑來膦酸具有一定的抗腫瘤效應(yīng)［1］，該效應(yīng)主要有抑制腫瘤細(xì)胞增殖［2-3］、阻滯腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)展［4］、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［5-6］、抑制腫瘤血管的形成［7-8］以及抑制腫瘤黏附遷移能力［5，9］等，在多種實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn)唑來膦酸可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長并促進(jìn)其凋亡。本課題主要研究第3代雙膦酸鹽藥物ZOL對人類髓系白血病細(xì)胞U937的增殖抑制、促凋亡作用及對細(xì)胞周期的影響，檢測ZOL對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期相關(guān)基因及蛋白的影響，探討唑來膦酸臨床可能的抗白血病作用機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑

唑來膦酸購自Sigma;胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco;CCK-8購自Dojindo;Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，各種 I抗及II抗購自Santa Cruz;JC-1探針購自碧云天;甲基纖維素為R＆D產(chǎn)品;其它生化試劑為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U937細(xì)胞株為中山大學(xué)血液病研究所保存，使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于5%CO2、37℃飽和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分組。

2.2 CCK-8法檢測藥物對U937細(xì)胞活力的影響

U937細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，分別給予不同濃度 (1 mmol/L、0.8 mmol/L、0.6 mmol/L、0.4 mmol/L、0.2 mmol/L、0.1 mmol/L、0.05 mmol/L和0.025 mmol/ L)的ZOL作用24 h、48 h和72 h，檢測前每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，于450 nm波長的酶標(biāo)儀測定吸光度。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 U937細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，0.2 mmol/L和0.4 mmol/L ZOL作用24 h、48 h和72 h后收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min， PBS洗滌2次，然后用70% 冰乙醇固定過夜，予碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色后流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期。

2.4 Annexin V-PI法檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞PBS洗滌2次，1 000 r/min離心5 min，再將細(xì)胞重懸于500 μL的binding buffer，先后加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，輕輕混勻，避光放置15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.5 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 收集細(xì)胞，PBS洗滌1次，加入Hoechst 33342(10 mg/L)染液500 μL，混勻后置于37℃水浴鍋中孵育15 min，然后PBS洗滌3次，在有紫外光的熒光顯微鏡下觀察，并隨機(jī)拍照，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞的數(shù)量。

2.6 JC-1熒光探針檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化

收集細(xì)胞重懸于0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，其中陽性對照組加入0.5 μL的CCCP，處理20 min。實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組細(xì)胞中各加入0.5 mL JC-1染色工作液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃ 孵育20 min。然后予JC-1染色緩沖液洗滌2次后重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測膜電位變化情況。

2.7 甲基纖維素克隆形成實(shí)驗(yàn) 將空白組及藥物處理后的U937細(xì)胞培養(yǎng)于甲基纖維素中，5%CO2、37℃ 飽和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周后觀察克隆形成情況

2.8 Western blot檢測細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液100 μL室溫下孵育15 min，4℃ 下12 000 r/min離心10 min，收集上清，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，等量蛋白上樣，10%SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，TBST洗滌1次，麗春紅染色后置于5%牛血清白蛋白封閉液中封閉1 h，加入I抗孵育4℃過夜，TBST洗滌3次后加入II抗孵育1 h，于暗室中曝光，β-actin作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較分析用t檢驗(yàn)或方差分析，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 ZOL對U937細(xì)胞活力的抑制作用

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，0.025 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1 mmol/L的ZOL對U937細(xì)胞活力在24 h即開始有抑制作用(P＜0.05)，隨著ZOL終濃度的升高和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞活力受抑制越明顯，ZOL對U937生長的抑制呈時(shí)間劑量依賴性(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.ZOL inhibited the viability of U937 cells determined by CCK-8 assay.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mmol/L.圖1 ZOL抑制U937細(xì)胞的活力

2 ZOL對U937細(xì)胞周期的影響

用PI法檢測ZOL對U937細(xì)胞周期的影響，如圖2所示，ZOL作用于U937 48 h后，與對照組相比，U937細(xì)胞在S期的細(xì)胞比例由38.82%±1.18% 增加至62.16%±1.34%，而G2-M期的比例相應(yīng)減少，提示ZOL可以將細(xì)胞周期阻滯在S期。

Figure 2.ZOL induced S phase arrest in the cell cycle of the U937 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 mmol/L.圖2 ZOL將U937細(xì)胞周期阻滯在S期

3 ZOL誘導(dǎo)U937細(xì)胞的凋亡

Annexin V-PI染色觀察結(jié)果顯示，與對照組相比，0.2 mmol/L和0.4 mmol/L的ZOL作用于U937細(xì)胞24 h的凋亡率分別4.88%±0.04% 和5.41% ±0.11%，72 h的凋亡率分別為20.12% ±0.91% 和28.56%±1.49%，由此顯示，ZOL作用于U937細(xì)胞24 h時(shí)對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用不明顯，當(dāng)作用時(shí)間達(dá)到48 h和72 h，與對照組相比，ZOL對U937細(xì)胞均起到明顯誘導(dǎo)凋亡的作用(P＜0.05)。Hoechst 33342染色結(jié)果顯示0.2 mmol/L和0.4 mmol/L的ZOL處理了48 h的U937細(xì)胞，可以在顯微鏡下觀察到部分細(xì)胞核碎裂，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，凋亡率分別為17.13% ±0.86% 和29.78±1.23%，進(jìn)一步證實(shí)ZOL可以誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡，見圖3。

4 ZOL對細(xì)胞線粒體膜電位的影響

0.2 mmol/L和0.4 mmol/L終濃度的ZOL作用于U937細(xì)胞48 h后經(jīng)JC-1熒光探針處理后，開始出現(xiàn)發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞群，之后隨著藥物作用時(shí)間的延長或藥物作用終濃度的升高，發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞群比例明顯增加，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)。提示唑來膦酸誘導(dǎo)U937細(xì)胞的線粒體去極化，降低線粒體膜電位，見圖4。

5 ZOL抑制U937細(xì)胞克隆形成

甲基纖維素克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過7 d培養(yǎng)，未加藥組細(xì)胞可見到克隆形成率為83.00%± 3.30%，經(jīng)0.2 mmol/L和0.4 mmol/L的ZOL處理過的細(xì)胞均未見到克隆形成，表明0.2 mmol/L的ZOL已經(jīng)完全抑制了U937細(xì)胞的克隆形成能力(P＜0.05)，見圖5。

6 ZOL對p21、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示0.2 mmol/L和0.4 mmol/L終濃度的ZOL作用于U937細(xì)胞48 h后，與對照組相比，p21和Bax蛋白的表達(dá)增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)下降，其中對p21的作用最明顯，且隨著藥物濃度增加而增強(qiáng)，見圖4。

討論

隨著分子靶向藥物的開發(fā)、化療方案的改革以及造血干細(xì)胞移植術(shù)的開展，急性髓系白血病的治療取得了巨大的進(jìn)展，許多患者經(jīng)過治療后可以達(dá)到長期無病生存，但仍有部分患者存在緩解后復(fù)發(fā)，對于疾病復(fù)發(fā)的患者，治療難度大，有效治療方法少，再次緩解率降低，是急性髓系白血病治療失敗的主要原因。近年來人們致力于新的分子靶向藥物的開發(fā)，希望能發(fā)現(xiàn)一類藥物與常規(guī)的化療藥物聯(lián)用，發(fā)揮更強(qiáng)的抗白血病效應(yīng)，克服復(fù)發(fā)和耐藥的難題。

Figure 3.ZOL induced apoptosis in the U937 cells.A:the U937 cells treated ZOL were stained with Annexin V-PI and subjected to flow cytometry analysis;B:the U937 cells treated with different concentrations of ZOL for 48 h were stained with Hoechst 333342 and examined under a fluorescence microscope(×400).Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mmol/L.圖3 ZOL誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡

Figure 4.ZOL reduced mitochondrial membrane potential.The U937 cells treated with ZOL were assessed by monitoring JC-1.JC-1 accumulated in mitochondrial to form red fluorescent aggregate at high membrane potential.When the membrane potential decreased，green fluorescence JC-1 monomer formed in the cytosol.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mmol/L.圖4 ZOL降低U937細(xì)胞線粒體膜電位

Figure 5.The effects of ZOL on the expression of apoptosis-related proteins and the colony formation capacity in the U937 cells.A: the protein expression was detected by Western blot;B:the U937 cells treated with ZOL at various concentrations were incubated in methylcellulose culture for 2 weeks and the colony formation capacity was completely suppressed.Mean±SD.n= 3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mmol/L.圖5 ZOL對U937細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及克隆形成能力的影響

在多種人類的腫瘤中，ras發(fā)生突變并持續(xù)激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性增殖和凋亡抑制，對該信號(hào)通路的研究有利于尋找相應(yīng)靶向治療藥物，2005年Yoshitoshi Ohtsuka在Blood上闡述了ZOL可以在體外抑制ras信號(hào)持續(xù)激活的幼年型慢性粒單核細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖和分化，ZOL被證實(shí)亦可以減少多發(fā)性骨髓瘤患者骨骼相關(guān)并發(fā)癥、減輕腫瘤負(fù)荷，延長多發(fā)性骨髓瘤患者的生存時(shí)間、降低死亡率［10］。在慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)中，Chuah等［11］證實(shí)ZOL可以無視甲磺酸伊馬替尼的耐藥機(jī)制，和伊馬替尼聯(lián)用協(xié)同抑制CML細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

p21是最早發(fā)現(xiàn)的cyclin依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制劑，幾乎可以抑制全部的cyclin/CDK復(fù)合體的活性，被認(rèn)為可以在細(xì)胞周期的多個(gè)環(huán)節(jié)起作用。本研究發(fā)現(xiàn)ZOL能明顯抑制U937細(xì)胞的活力，將細(xì)胞周期阻滯在S期，同時(shí)檢測到ZOL作用于U937后p21表達(dá)明顯增加，我們推測ZOL通過上調(diào)p21表達(dá)從而抑制cyclin/CDK復(fù)合體的活性將細(xì)胞周期阻滯在S期，與之前的報(bào)道一致。

涉及細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路包括線粒體介導(dǎo)的凋亡通路和死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路。在線粒體介導(dǎo)的凋亡通路中，外界刺激信號(hào)傳到線粒體上，通過凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族進(jìn)行調(diào)節(jié)，當(dāng)Bax/Bcl-2比例增加的時(shí)候可以觸發(fā)線粒體外膜的滲透性發(fā)生改變，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。在我們研究中，Annexin V-PI和Hoechst 33342檢測結(jié)果均表明ZOL可以誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡，這種作用在24 h時(shí)表現(xiàn)不明顯，隨著時(shí)間及劑量的增加，凋亡率逐漸增加，呈時(shí)間劑量依賴性，為了明確唑來膦酸的促凋亡作用機(jī)制，我們檢測了唑來膦酸作用于U937后的細(xì)胞膜電位變化情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜電位的消失與凋亡率呈正相關(guān)，Western blot結(jié)果提示Bcl-2隨著藥物濃度的增加逐漸減少，Bax隨著藥物濃度的增加逐漸增加，進(jìn)一步證實(shí)唑來膦酸通過改變Bax/Bcl-2比例進(jìn)而影響細(xì)胞線粒體膜電位水平促進(jìn)白血病細(xì)胞的凋亡。

本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)ZOL可以抑制U937細(xì)胞活力并誘導(dǎo)其凋亡，主要是通過上調(diào)促凋亡因子及下調(diào)凋亡抑制因子進(jìn)而影響線粒體膜電位水平來實(shí)現(xiàn)的。ZOL在臨床中用于治療多發(fā)性骨髓瘤或惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的骨破壞，與常規(guī)化療藥物相比毒副作用少，此外，由于ZOL具有親骨髓性，臨床常規(guī)劑量注射ZOL后，ZOL可以迅速積聚到破骨細(xì)胞中，隨后釋放到骨髓，我們猜想，ZOL可以與一些常規(guī)的化療藥物聯(lián)用，對骨髓中的白血病細(xì)胞甚至治療后殘存的白血病殘留病灶起到較為徹底的清除作用，同時(shí)減低化療藥物引起的毒副作用，為臨床提供新的治療策略。

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅 森)

Zoledronic acid inhibits proliferation and induces apoptosis in U937 cells

FAN Rui-fang1，LIU Ling-ling1，ZHANG Ling1，GUO Xiao-yan2，WANG Xiao-zhen1，LIN Dong-jun1

(1Department of Hematology，The Third Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China;2Department of Pediatrics，Guangdong Women and Children Hospital，Guangzhou 510010，China.E-mail:lindongjun0168 @163.com)

AIM:To study the antiproliferation and proapoptotic effects of zoledronic acid(ZOL)on human acute myeloid leukemia cell line U937.METHODS:The viability of U937 cells was detected by CCK-8 assay.The cell cycle of the U937 cells was analyzed by flow cytometry with PI staining.Apoptotic rate was assessed by flow cytometry with Annexin V-PI and Hoechst 33342 staining.Mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 assay.Methylcellulose was used to assess colony formation.The protein levels of p21，Bcl-2 and Bax were determined by Western blot.RESULTS:ZOL inhibited the viability of U937 cells.ZOL induced S-phase cell cycle arrest in the U937 cells.The results of flow cytometry analysis with Annexin V-PI and Hoechst 33342 staining showed that ZOL also induced apoptosis in a doseand time-dependent manner.Mitochondrial membrane potential assay was also used to verify the apoptosis.The apoptotic rate was consistent with the reduction of mitochondrial membrane potential.Colony formation assay showed that ZOL significantly inhibited the colony formation capacity of the U937 cells.This was achieved by the induction of S-phase cell cycle arrest，and up-regulation of Bax and p21，and down-regulation of Bcl-2.CONCLUSION:ZOL inhibits cell proliferation by regulating the expression of cell cycle-related protein，and induces apoptosis via the mitochondrial apoptotic pathway.

Zoledronic acid;U937 cells;Cell cycle;Apoptosis

733.7;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.011

1000-4718(2016)07-1221-06

2016-01-21

2016-04-06

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No.B2013134)

△Tel:020-85252227;E-mail:lindongjun0168@163.com