原花青素單一活性成分B2對高糖作用下人內(nèi)皮祖細(xì)胞的保護(hù)作用

王麗萍， 李 莉， 姚計文， 李 博

［1北京師范大學(xué)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(醫(yī)院)，北京100875;2北京市公安醫(yī)院內(nèi)科，北京100121;3北京市和平里醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京100013］

原花青素單一活性成分B2對高糖作用下人內(nèi)皮祖細(xì)胞的保護(hù)作用

王麗萍1△， 李 莉2， 姚計文3， 李 博3

［1北京師范大學(xué)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心
(醫(yī)院)，北京100875;2北京市公安醫(yī)院內(nèi)科，北京100121;3北京市和平里醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京100013］

目的:研究原花青素單一活性成分B2(PC-B2)對高糖環(huán)境下人內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法:從健康人外周血中分離誘導(dǎo)培養(yǎng)人EPCs，并進(jìn)行鑒定。將EPCs分為control組(PBS處理)、高滲對照組(25 mmol/L甘露醇處理)、高濃度30 mmol/L葡萄糖作用組以及不同濃度(2、10和50 mg/L)PC-B2與30 mmol/L葡萄糖共處理組。使用CCK-8法檢測各組中EPCs活力的變化;同時檢測各組EPCs中乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和還原型谷胱甘肽(GSH)水平;ELISA方法檢測各組EPCs上清中一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)的含量變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測各組中EPCs活性氧簇(ROS)生成和凋亡率變化;Western blot檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)的表達(dá)情況。結(jié)果:與control組相比，高糖作用組中人EPCs的活力顯著下降(P ＜0.05);LDH漏出量以及MDA、ET-1、ICAM-1和VCAM-1含量均顯著升高(P＜0.05);而SOD和GSH活性以及NO含量顯著降低(P＜0.05);細(xì)胞中ROS含量和凋亡率顯著上升(P＜0.05);EPCs中VEGF和VEGFR-2表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。與高糖作用組相比，不同濃度PC-B2作用組EPCs活力均明顯回升(P＜0.05);LDH漏出量以及MDA、ET-1、ICAM-1和VCAM-1含量均逐漸下降(P＜0.05);SOD和GSH活性以及NO含量均顯著上升(P＜0.05);細(xì)胞中ROS生成和凋亡率逐漸下降(P＜0.05);而EPCs中VEGF和VEGFR-2表達(dá)量也隨之逐漸上升，并具有濃度依賴性(P＜0.05)。結(jié)論:PC-B2能夠提升高糖作用下人EPCs活力，減少高糖引起的氧化損傷，恢復(fù)EPCs正常功能，降低高糖誘導(dǎo)的炎癥因子和細(xì)胞凋亡，從而對人EPCs發(fā)揮保護(hù)作用，并可通過誘導(dǎo)VEGFR-2和VEGF表達(dá)發(fā)揮作用。

人內(nèi)皮祖細(xì)胞;高糖;原花青素B2;氧化應(yīng)激;細(xì)胞凋亡;血管內(nèi)皮生長因子

近年研究表明，80%的糖尿病患者都會出現(xiàn)全身小血管或血管病變，產(chǎn)生血管損傷并發(fā)癥，同時糖尿病患者心血管并發(fā)癥是導(dǎo)致其死亡和致殘的主要原因［1］。糖尿病患者容易產(chǎn)生血管并發(fā)癥，主要是由于其血管內(nèi)高血糖水平使血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)產(chǎn)生改變，生理功能喪失導(dǎo)致血管損傷［2］。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，能夠從骨髓動員到外周血對損傷血管進(jìn)行修復(fù)。研究表明糖尿病能夠?qū)е峦庵苎狤PCs數(shù)量的減少及功能障礙，其血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展與EPCs功能受損密切相關(guān)，但如何保護(hù)高糖環(huán)境中EPCs的研究尚少見［3］。原花青素(proanthocyanidins，PC)是一類廣泛存在于植物中的黃烷醇單體及其聚合物的天然多酚化合物，是花青素類物質(zhì)的聚合物［4］。PC廣泛存在于葡萄籽、銀杏、大黃、松樹和柏樹等天然植物的根莖葉果實(shí)中，因其具有水溶性，易于被機(jī)體吸收，而比番茄紅素、蝦青素等其它脂溶性強(qiáng)抗氧化劑受到更廣泛和有效的關(guān)注［5］。而原花青素B2(PC-B2)是PC中主要的活性成分，目前關(guān)注較少且其作為單一成分發(fā)揮作用及機(jī)制尚未見［6］。因此本研究利用高糖作用于人EPCs，觀察單一成分PC-B2對高糖作用下人EPCs的影響，并從抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等方面揭示其能否對EPCs發(fā)揮保護(hù)作用。

材料和方法

1 試劑和材料

M199細(xì)胞培養(yǎng)基和0.25%EDTA胰酶購自HyClone;胎牛血清、谷氨酰胺、谷丙酸鈉和Endogro細(xì)胞因子購自Gibco;原花青素單體活性成分B2(純度99.9%)、人淋巴細(xì)胞分離液、D-Hanks溶液和雙氫羅丹明123購自Sigma;葡萄糖和20%甘露醇購自西南藥業(yè)公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)測定試劑盒購自南京建成生物技術(shù)研究所;內(nèi)皮素-1(endothelin，ET-1)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子-1 (vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)的ELISA檢測試劑盒購自武漢華美生物公司;CCK-8檢測試劑盒和Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京鼎國生物技術(shù)公司;FITC標(biāo)記的單克隆鼠抗人CD133、CD34、CD31和FIK-1抗體購自BD;多克隆兔抗人血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管內(nèi)皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2)和 βactin I抗購自Abcam;HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG的II抗和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自北京中杉金橋公司。

2 主要方法

2.1 人EPCs的分離培養(yǎng)鑒定 取健康人捐獻(xiàn)外周，血用等體積人淋巴細(xì)胞分離液混勻后置于50 mL離心管中，密度梯度離心20 min，分離得到中間層人外周血單核細(xì)胞層。用D-Hanks溶液洗滌2次后，棄去上清，用含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和谷丙酸鈉、0.1%Endogro細(xì)胞因子的M199完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于膠原預(yù)先包被的細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)至24 h時，更換細(xì)胞培養(yǎng)基去掉未貼壁細(xì)胞。后每3 d更換培養(yǎng)基，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察人EPCs的生長狀態(tài)。將連續(xù)培養(yǎng)14 d的EPCs細(xì)胞接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后去除上清培養(yǎng)基，PBS洗滌 2遍后，先加入 100 μL的 DiI-Ac-LDL (1∶100)稀釋液，37℃孵育4 h后，PBS洗滌3次后次用4%多聚甲醛固定30 min，后加入100 μL的FITC-UEA-1(1∶500)在37℃孵育2 h。用PBS洗滌細(xì)胞后在熒光顯微鏡下觀察為UEA和LDL雙染色陽性細(xì)胞即為正在分化的人EPCs。同時收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的EPCs稀釋濃度為1×109/L，分別避光孵育FITC標(biāo)記的單克隆鼠抗人CD133、CD34、CD31和FIK-1抗體30 min后，PBS洗滌1次，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中CD133、CD34、CD31和FIK-1陽性表達(dá)率以鑒定人EPCs。

2.2 CCK-8方法檢測EPCs的活力 將分離誘導(dǎo)培養(yǎng)至14 d的人EPCs經(jīng)含0.25%EDTA的胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108/L，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6 h細(xì)胞貼壁后更換不同培養(yǎng)基，細(xì)胞分組為:加入與溶劑等量PBS的EPCs完全培養(yǎng)基為對照組(control組);加入含25 mmol/L甘露醇的EPCs完全培養(yǎng)基作為高滲對照組(hypertonic組);加入含高濃度30 mmol/L葡萄糖的EPCs完全培養(yǎng)基單獨(dú)培養(yǎng)組(高糖組);同時加入含不同濃度(2、10 和50 mg/L)PC-B2和30 mmol/L葡萄糖的EPCs完全培養(yǎng)基共培養(yǎng)組。在分別繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h后，分別在每孔中加入10 μL的CCk-8溶液，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀檢測每組細(xì)胞在450 nm波長時的吸光度(A)值。

2.3 細(xì)胞中LDH、MDA、SOD和GSH的檢測 將誘導(dǎo)培養(yǎng)至14 d的人EPCs以5×108/L按照上述同樣分組種植于6孔板中，經(jīng)不同培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集各組EPCs培養(yǎng)后上清液，按照試劑盒說明利用比色法測定各組經(jīng)不同處理后EPCs中LDH的漏出量，同時收集各組細(xì)胞，利用強(qiáng)RIPA細(xì)胞裂解液提取各組EPCs中總蛋白，按照試劑盒說明測定EPCs 中MDA含量以及SOD和GSH活性變化。

2.4 ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO、ET-1、ICAM-1和VCAM-1的含量 收集各組EPCs細(xì)胞經(jīng)不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)處理48 h后的上清液，在－20℃凍存?zhèn)溆?。利用酶?lián)免疫標(biāo)記法(ELISA)試劑盒說明書分別檢測各組EPCs分泌的功能相關(guān)因子NO、ET-1和炎癥相關(guān)因子ICAM-1、VCAM-1含量。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成和細(xì)胞凋亡 在各組EPCs經(jīng)不同處理48 h后，用0.25%的EDTA胰酶消化離心并收集細(xì)胞，并用PBS重懸濃度為1×109/L，每組取出250 μL的懸液，先用1 μmol/L的雙氫羅丹明123避光孵育30 min，PBS洗滌1次后用150 μL PBS重懸細(xì)胞，各組細(xì)胞中活性氧自由基能夠?qū)㈦p氫羅丹明123氧化成羅丹明123發(fā)出熒光，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞中ROS含量。另外，用FITC標(biāo)記的Annexin V和PI各5 μL與EPCs混勻后在室溫下避光孵育20 min，后用PBS洗滌1次，離心收集細(xì)胞并用150 μL PBS重懸，立即用流式細(xì)胞儀檢測各組EPCs經(jīng)不同處理后的凋亡情況。

2.6 Western blot檢測EPCs中VEGFR-2和VEGF的表達(dá) 收集各組經(jīng)處理并培養(yǎng)結(jié)束的EPCs，用PBS洗滌1次后，利用強(qiáng)RIPA細(xì)胞裂解液提取各組EPCs中總蛋白，BCA試劑盒測定各組細(xì)胞中總蛋白濃度。每組中取出30 μg總蛋白進(jìn)行12%SDSPAGE，電泳1.5 h后進(jìn)行半干法轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉30 min后分別孵育多克隆兔抗人VEGFR-2、VEGF和β-actin(均按照1∶1 000稀釋)于4℃下孵育過夜。后用TBST洗滌3次后，用辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG II抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h后，TBST洗滌3次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，用凝膠掃描系統(tǒng)顯影曝光并拍照，并用Quantity One軟件分析各組細(xì)胞中目的蛋白相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，用SNK-q進(jìn)行均數(shù)之間的兩兩比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 人EPCs的培養(yǎng)鑒定結(jié)果

從健康人外周血中分離誘導(dǎo)的EPCs，在培養(yǎng)14 d時生長狀態(tài)良好，細(xì)胞變大變圓，呈“鋪路石子”狀，見圖1。對貼壁生長的EPCs進(jìn)行DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1熒光標(biāo)記，以對EPCs進(jìn)行鑒定，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞為FITC-UEA-1陽性的人EPCs細(xì)胞;紅色熒光標(biāo)記細(xì)胞為經(jīng)DiI-ac-LDL處理的人EPCs;而呈黃色細(xì)胞為雙熒光陽性細(xì)胞，即為正在分化的人EPCs。同時利用流式細(xì)胞術(shù)對誘導(dǎo)培養(yǎng)的人EPCs細(xì)胞特異性標(biāo)記指標(biāo)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其中 14 d時細(xì)胞的 CD133陽性率達(dá)86.6%，CD34陽性率達(dá) 86.8%，F(xiàn)IK-1陽性率達(dá)93.2%，CD31陽性率僅14.7%，而培養(yǎng)21 d時細(xì)胞中CD31陽性率上升為80.9%，說明從健康人外周血中可分離誘導(dǎo)培養(yǎng)人EPCs并得以鑒定。

Figure 1.Culture and identification of human EPCs.A:human EPCs cultured for 14 d;B:FITC-UEA-1 positive cells;C:DiI-ac-LDL positive cells;D:double positive cells;E:the EPCs positive rate marked by CD133 at 14 d;F:the EPCs positive rate marked by CD34 at 14 d;G:the EPCs positive rate marked by FIK-1 at 14 d;H:the EPCs positive rate marked by CD31 at 14 d;I:the EPCs positive rate marked by CD31 at 21 d.圖1 人EPCs的細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定

2 PC-B2對高糖作用下人EPCs活力的影響

通過CCK-8實(shí)驗檢測發(fā)現(xiàn)，在單獨(dú)高糖作用下人EPCs的細(xì)胞活力明顯受抑制，而經(jīng)不同濃度PCB2同時處理培養(yǎng)能夠顯著提高人EPCs的細(xì)胞活力。由圖2可見，與control組相比，hypertonic組中人EPCs培養(yǎng)24 h和48 h的A值無明顯變化，而高糖作用組中人EPCs的A值均顯著下降(P＜0.05);而與高糖作用組相比，在24 h時各濃度PC-B2組中，除2 mg/L組EPCs的A值上升不明顯，10和50 mg/ L組中EPCs的A值均顯著上升(P＜0.05);在48 h時，各濃度PC-B2作用組中EPCs的A值均顯著上升(P＜0.05)。因此，選擇PC-B2作用于人EPCs 48 h進(jìn)行研究。

Figure 2.The effect of PC-B2 on the viability of human EPCs treated with high glucose detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs high glucose group.圖2 CCK-8方法檢測PC-B2對高糖作用下人EPCs活力的影響

3 PC-B2對高糖作用下人EPCs中LDH、MDA、SOD和GSH水平的影響

PC-B2能夠降低高糖作用下人EPCs中LDH漏出量和MDA含量，并提升SOD和GSH活性，結(jié)果見表1。與control組相比，hypertonic組中人EPCs細(xì)胞中LDH、MDA、SOD和GSH均無明顯變化，單獨(dú)高糖作用下人EPCs細(xì)胞中LDH漏出量和MDA含量均顯著增加(P＜0.05)，而SOD和GSH活性則顯著下降(P＜0.05);在不同濃度的PC-B2同時作用時，與高糖組相比，各PC-B2組EPCs的LDH漏出量和MDA含量均逐漸下降(P＜0.05);2 mg/L組EPCs 中SOD和GSH活性有所上升，但不顯著，而10和50 mg/L組EPCs中SOD和GSH活性則顯著回升，趨于正常水平(P＜0.05)。

表1 PC-B2對高糖作用下人EPCs中LDH、MDA、SOD和GSH水平的影響Table 1.The effect of PC-B2 on the levels of LDH，MDA，SOD and GSH in the human EPCs treated with high glucose(Mean±SD.

4 PC-B2對高糖作用下人EPCs培養(yǎng)上清中NO、ET-1、ICAM-1和VCAM-1含量的影響

檢測發(fā)現(xiàn)，PC-B2能夠顯著增加高糖作用下人EPCs培養(yǎng)上清中的NO含量，而減少ET-1、ICAM-1 和VCAM-1的含量，如表2所示。與control組相比，hypertonic組中人 EPCs培養(yǎng)上清中的 NO、ET-1、ICAM-1和VCAM-1含量均無明顯變化，但單獨(dú)高糖作用組EPCs培養(yǎng)上清中NO含量顯著下降(P＜0.05);而ET-1和炎性因子ICAM-1、VCAM-1的含量則顯著上升(P＜0.05)。與高糖組相比，不同濃度PC-B2作用組EPCs培養(yǎng)上清中的NO含量逐漸回升(P＜0.05);而ET-1、ICAM-1和VCAM-1的含量則逐漸下降(P＜0.05)。

表2 PC-B2對高糖作用下人EPCs培養(yǎng)上清中NO、ET-1、ICAM-1和VCAM-1含量的影響Table 2.The effect of PC-B2 on the production of NO，ET-1，ICAM-1 and VCAM-1 in the culture supernatant of human EPCs treated with high glucose(Mean±SD.n=9)

5 PC-B2對高糖作用下人EPCs中ROS含量的影響

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)高糖作用顯著誘導(dǎo)人EPCs中ROS的產(chǎn)生，而PC-B2能夠逐漸減少高糖誘導(dǎo)下人EPCs中ROS含量，見圖3。與control組相比，hypertonic組中人EPCs的ROS含量無明顯變化，但高糖單獨(dú)作用組EPCs中ROS陽性率顯著上升(P＜0.05);而與高糖組相比，不同濃度PCB2同時作用組EPCs中ROS陽性率逐漸下降，并具有濃度效應(yīng)(P＜0.05)。

6 PC-B2對高糖作用下人EPCs凋亡的影響

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)高糖作用顯著誘導(dǎo)人EPCs凋亡，而PC-B2能夠顯著減少高糖作用下人EPCs凋亡，見圖4。與control組相比，hypertonic組人EPCs凋亡率無明顯變化，高糖單獨(dú)作用組EPCs凋亡率顯著上升(P＜0.05);而與高糖組相比，不同濃度PC-B2同時作用組EPCs凋亡率逐漸下降，并具有濃度效應(yīng)(P＜0.05)。

7 PC-B2對高糖作用下人EPCs中VEGFR-2和VEGF表達(dá)的影響

通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，在高糖作用下人EPCs中VEGFR-2和VEGF表達(dá)均顯著下降;而PCB2作用能夠提升各組人EPCs中VEGFR-2和VEGF的表達(dá)，見圖5。與control組相比，高糖單獨(dú)作用組EPCs中VEGFR-2和VEGF表達(dá)均顯著降低(P＜0.05);而與高糖組相比，各不同濃度PC-B2同時作用組中VEGFR-2和VEGF表達(dá)均逐漸回升，并具有濃度依賴性(P＜0.05)。

Figure 3.The effect of PC-B2 on ROS production in human EPCs treated with high glucose detected by flow cytometry.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs high glucose group.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測PC-B2對高糖作用下人EPCs中ROS生成的影響

討論

原花青素是目前國際公認(rèn)的一種新型天然高效抗氧化劑，其自然資源豐富，來源廣泛，安全高效且無毒副作用，大量研究表明其具有很強(qiáng)的抗氧化和清除氧自由基能力，在防治癌癥、心血管疾病、抗輻射、調(diào)節(jié)免疫等各方面均具有顯著功效［7］。而單一活性成分B2是原花青素的主要成分，由2個單體(兒茶素或表兒茶素)鍵合而成，在原花青素的8種異構(gòu)體中PC-B2具有最強(qiáng)的活性［8］。目前的研究主要集中在原花青素的作用機(jī)制中，但關(guān)于其作用是否主要通過活性最強(qiáng)的成分PC-B2發(fā)揮尚未知。糖尿病作為嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，呈逐漸上升趨勢，由于其患者血管中血糖水平高，容易誘發(fā)各種心血管并發(fā)癥［9］。EPCs作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，能夠被CD34、CD133和FIK-1特異性標(biāo)記，而分化成內(nèi)皮細(xì)胞后被CD31標(biāo)記，其細(xì)胞功能的發(fā)揮對血管損傷修復(fù)和新生具有重要意義，同時與動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病治療和預(yù)后均相關(guān)［10］。而有研究表明高糖能夠抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移，進(jìn)而影響血管的損傷修復(fù)，推測糖尿病患者容易發(fā)生血管病變，也可能與EPCs受損相關(guān)［11］。因此，本研究利用高糖作用于人EPCs以模擬糖尿病人血管中動員的內(nèi)皮祖細(xì)胞所處環(huán)境狀態(tài)，以揭示高糖對人EPCs的損傷作用及PC-B2能否對高糖下人EPCs發(fā)揮保護(hù)作用。同時本研究中設(shè)置甘露醇高滲對照組，發(fā)現(xiàn)高滲因素對人EPCs細(xì)胞各項指標(biāo)無明顯影響，說明人EPCs細(xì)胞功能的變化主要由高糖因素引起，而與滲透壓的改變無關(guān)。通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，高糖能夠顯著降低人EPCs細(xì)胞活力，而PC-B2能夠逐漸提升高糖作用下EPCs的細(xì)胞活力，并具有濃度和時間效應(yīng)，表明PC-B2能夠降低高糖對人EPCs的損傷作用。

Figure 4.The effect of PC-B2 on the apoptosis of human EPCs treated with high glucose detected by flow cytometry.Mean±SD.n= 9.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs high glucose group.圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測PC-B2對高糖作用下人EPCs凋亡的影響

糖尿病患者心血管并發(fā)癥發(fā)生的病理原因，與其血管內(nèi)高糖環(huán)境下細(xì)胞極易受到氧化應(yīng)激損傷密不可分［12］。LDH在細(xì)胞糖代謝中起重要作用。其漏出量多少直接反映細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞受損傷程度，而MDA作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，常作為檢測機(jī)體抗氧化功能的代表指標(biāo)之一［13］。SOD和GSH都是機(jī)體內(nèi)重要活性氧自由基清除劑和抗氧化劑，可通過其活力高低反映機(jī)體抗氧化、清除氧自由基的能力［14］。本研究中高糖作用組中EPCs細(xì)胞LDH漏出量和MDA含量顯著上升，而SOD和GSH活性顯著下降，說明高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)人EPCs的細(xì)胞膜損傷和氧化損傷，而使細(xì)胞發(fā)生病理變化并降低其抗氧化能力。而當(dāng)PC-B2同時作用于人EPCs時，細(xì)胞中LDH漏出量和MDA含量逐漸下降，SOD和GSH活性逐漸回升，趨于正常水平，說明PC-B2能夠減少人EPCs細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)受高糖損傷，維持細(xì)胞完整性和抗氧化能力。NO作為血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的重要舒血管因子，可反映EPCs分化內(nèi)皮細(xì)胞的功能強(qiáng)弱;ET-1是機(jī)體內(nèi)強(qiáng)收縮血管物質(zhì)，在血管損傷時顯著上升［15］。研究表明糖尿病患者血管細(xì)胞 ET-1、NO分泌的失調(diào)，促進(jìn)糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生，成為動脈粥樣硬化的重要因素［16］。另有研究表明高糖對動脈血管的損傷機(jī)制中，炎癥相關(guān)因子ICAM-1和VCAM-1炎癥扮演著重要作用，高糖能夠通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞［17］。本研究中高糖組EPCs細(xì)胞的NO生成顯著下降而ET-1、ICAM-1和VCAM-1分泌量顯著上升，說明高糖能夠使人EPCs細(xì)胞正常分泌功能失調(diào)并誘發(fā)炎癥反應(yīng)，從而加速血管損傷和動脈粥樣硬化的產(chǎn)生。PC-B2與高糖同時作用于人EPCs時，NO含量逐漸上升而 ET-1、ICAM-1和VCAM-1的分泌含量逐漸下降，表明PCB2能夠調(diào)節(jié)高糖作用下人EPCs中NO和ET-1的分泌功能，并降低炎癥反應(yīng)以維持高糖作用下EPCs的正常生理功能。

Figure 5.The effect of PC-B2 on the expression of VEGFR-2 and VEGF in human EPCs treated with high glucose detected by Western blot.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs high glucose group.圖5 Western blot檢測PC-B2對高糖作用下人EPCs中VEGFR-2和VEGF表達(dá)的影響

研究表明，血管內(nèi)高糖水平誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［18］。糖尿病患者心血管并發(fā)癥和動脈粥樣硬化發(fā)生率顯著高于正常人也是因為其血管內(nèi)細(xì)胞在高糖環(huán)境中容易發(fā)生凋亡［19］。本研究中也發(fā)現(xiàn)高糖作用下人EPCs細(xì)胞的凋亡率顯著上升，直接驗證高糖環(huán)境對人EPCs的損傷作用;而不同濃度PC-B2同時作用組中EPCs的凋亡率則顯著下降，說明PCB2在高糖環(huán)境中能夠發(fā)揮保護(hù)人 EPCs的作用。VEGF是一種能夠促進(jìn)血管生成的血管內(nèi)皮細(xì)胞因子，常作為EPCs細(xì)胞培養(yǎng)的誘導(dǎo)因子。Guo等［20］研究已表明VEGF能夠直接促進(jìn)EPCs細(xì)胞增殖、遷移并促進(jìn)EPCs細(xì)胞發(fā)揮修復(fù)損傷血管的功能。而VEGFR-2是血管內(nèi)皮生長因子的受體之一，主要在生理或病理損傷時與VEGF結(jié)合發(fā)揮作用，研究表明EPCs細(xì)胞中表達(dá)的VEGFR-2被激活后，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖，并維持細(xì)胞正常生理功能［21］。本研究中高糖作用組人EPCs細(xì)胞中VEGF和VEGFR-2相對表達(dá)量顯著下降，說明高糖可能通過降低VEGF 和VEGFR-2的表達(dá)而對血管中EPCs造成損傷。當(dāng)不同濃度PC-B2與高糖同時作用于人EPCs時，細(xì)胞中VEGF和VEGFR-2表達(dá)量能夠逐漸上升，顯著高于高糖組，說明PC-B2能夠通過誘導(dǎo)VEGF和VEG-FR-2的表達(dá)，從而對人EPCs細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)單一活性成分PC-B2能夠提升高糖作用下人EPCs細(xì)胞增殖活力，降低高糖引起的氧化損傷，恢復(fù)EPCs正常分泌功能，降低高糖誘導(dǎo)的炎癥因子的分泌和細(xì)胞凋亡，從而對人EPCs發(fā)揮保護(hù)作用，并可通過誘導(dǎo) VEGFR-2和VEGF表達(dá)發(fā)揮作用。通過本研究對于臨床利用天然抗氧化劑PC-B2防治高血糖引起的心血管并發(fā)癥具有重要意義，可為糖尿病性血管損傷修復(fù)、動脈粥樣硬化治療等提供新的思路和理論依據(jù)。

［1］ 申虎威，李 燕，邢 莉，等.血糖波動與糖尿病大血管病變的相關(guān)研究［J］.中國病理生理雜志，2010，26 (7):1311-1315.

［2］ 劉江月.梓醇對糖尿病大鼠主動脈的保護(hù)作用與抗氧化機(jī)制研究［J］.中國病理生理雜志，2014，30(6): 1023-1028.

［3］ Rajasekar P，ONeill CL，Eeles L，et al.Epigenetic changes in endothelial progenitors as a possible cellular basis for glycemic memory in diabetic vascular complications ［J］.J Diabetes Res，2015，2015:436879.

［4］ Pons Z，Guerrero L，Margalef M，et al.Effect of low molecular grape seed proanthocyanidins on blood pressure and lipid homeostasis in cafeteria diet-fed rats［J］.J Physiol Biochem，2014，70(2):629-637.

［5］ 王 萌，馬藝萍，李亞偉，等.葡萄籽寡聚體原花青素對大鼠酒精性肝損傷及腦功能障礙的保護(hù)作用［J］.世界華人消化雜志，2013，21(16):1480-1486.

［6］ Muthenna P，Raghu G，Kumar PA，et al.Effect of cinnamon and its procyanidin-B2 enriched fraction on diabetic nephropathy in rats［J］.Chem Biol Interact，2014，222C: 68-76.

［7］ Derksen A，Hensel A，Hafezi W，et al.3-O-Galloylated procyanidins from Rumex acetosa L.inhibit the attachment of influenza A virus［J］.PLoS One，2014，9(10): e110089.

［8］ Shilpi A，Parbin S，Sengupta D，et al.Mechanisms of DNA methyltransferase-inhibitor interactions:procyanidin B2 shows new promise for therapeutic intervention of cancer［J］.Chem Biol Interact，2015，233:122-138.

［9］ Patel VB，Nirmal P，Oudit GY.Role of angiotensin-converting enzyme 2(ACE2)in diabetic cardiovascular complications［J］.Clin Sci，2014，126(7):471-482.

［10］Kim KA，Shin YJ，Kim JH，et al.Dysfunction of endothelial progenitor cells under diabetic conditions and its underlying mechanisms［J］.Arch Pharm Res，2012，35 (2):223-234.

［11］Jing L，Yao YY，Dai QM，et al.Erythropoietin attenuates cardiac dysfunction by increasing myocardial angiogenesis and inhibiting interstitial fibrosis in diabetic rats［J］.Cardiovasc Diabetol，2012，11:105.

［12］Shen GX.Oxidative stress and diabetic cardiovascular disorders:roles of mitochondria and NADPH oxidase［J］.Can J Physiol Pharmacol，2010，88(3):241-248.

［13］Shen GX.Mitochondrial dysfunction，oxidative stress and diabetic cardiovascular disorders［J］.Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets，2012，12(2):106-112.

［14］Blanc SL，Villarroel P，Candia V，et al.Type 2 diabetic patients and their offspring show altered parameters of iron status，oxidative stress and genes related to mitochondrial activity［J］.Biometals，2012，25(4):725-735.

［15］王詩才，陳太軍，黃美松，等.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞［J］.中國病理生理雜志，2015，31(8):1384-1394.

［16］葉 輝，修世國，劉艷麗.OSAHS并發(fā)2型糖尿病患者血漿ET-1和血清NO測定及其與血糖和睡眠呼吸暫停指數(shù)的相關(guān)性分析［J］.吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2010，36(6):1126-1129.

［17］Ki-Hyung K，Kyeong PJ，Young-Whan C，et al.Hexane extract of aged black garlic reduces cell proliferation and attenuates the expression of ICAM-1 and VCAM-1 in TNF-α-activated human endometrial stromal cells［J］.Int J Mol Med，2013，32(1):67-78.

［18］ Nauta A，Seidel C，Deveza L，et al.Adipose-derived stromal cells overexpressing vascular endothelial growth factor accelerate mouse excisional wound healing［J］.Mol The J Am Soc Gene Ther，2013，21(2):445-455.

［19］Mather KJ.The vascular endothelium in diabetes:a therapeutic target?［J］.Rev Endocrine Metab Disorders，2013，14(1):87-99.

［20］Guo S，Yang X，Cheng Y，et al.bFGF and PDGF-BB have a synergistic effect on the proliferation，migration and VEGF release of endothelial progenitor cells［J］.Cell Biol Int，2011，35(5):545-551.

［21］Advani A，Connelly KA，Advani SL，et al.Role of the eNOS-NO system in regulating the antiproteinuric effects of VEGF receptor 2 inhibition in diabetes［J］.Can J Diabetes，2013，2013:201475.

(責(zé)任編輯:盧 萍，羅 森)

Protective effect of procyanidin single active ingredient B2 on human endothelial progenitor cells under high glucose stimulation

WANG Li-ping1，LI Li2，YAO Ji-wen3，LI Bo3

［1Beijing Normal University Community Health Service Center
(Hospital)，Beijing 100875，China;2Department of Internal Medicine，Beijing Police Hospital，Beijing 100121，China;3Department of Cardiology，Beijing Hepingli Hospital，Beijing 100013，China.E-mail:keyanxiangmu1@163.com］

AIM:To study the protective effect of procyanidin single active ingredient B2(PC-B2)on human endothelial progenitor cells(EPCs)stimulated with high glucose.METHODS:The human EPCs were isolated from peripheral blood of healthy people and identified.The EPCs were divided into control group(PBS treatment)，hypertonic control group(25 mmol/L mannitol treatment)，high glucose(30 mmol/L)group，and different concentrations(2，10 and 50 mg/L)of PC-B2+30 mmol/L glucose groups.The viability of EPCs was detected by CCK-8 assay.The levels of LDH，MDA，SOD and GSH in the EPCs were detected.The changes of NO，ET-1，ICAM-1 and VCAM-1 in the EPCs cultured medium were measured by ELISA.The cell apoptotic rate and reactive oxygen species(ROS)in the EPCs were analyzed by flow cytometry.The expression of VEGF and VEGFR-2 in the EPCs were determined by Western blot.RESULTS:Compared with control group，the viability of human EPCs was decreased significantly in 30 mmol/L glucose group(P＜0.05).The LDH leakage，MDA content and the releases of ET-1，ICAM-1 and VCAM-1 were induced signifi-cantly(P＜0.05)，but SOD and GSH activity and NO production were decreased significantly(P＜0.05).The ROS and cell apoptotic rate were increased significantly(P＜0.05).The expression of VEGF and VEGFR-2 in the EPCs were decreased(P＜0.05).When human EPCs were treated with different concentrations of PC-B2 and 30 mmol/L glucose，the viability was obviously rebounded(P＜0.05)，the LDH leakage，MDA content and the releases of ET-1，ICAM-1 and VCAM-1 were decreased gradually(P＜0.05)，the SOD，GSH activity and NO production were increased significantly (P＜0.05)，the ROS and cell apoptotic rate were decreased significantly(P＜0.05)，and the expression of VEGF and VEGFR-2 in the EPCs was increased gradually(P＜0.05).CONCLUSION:PC-B2 enhances the viability of human EPCs under high glucose condition，reduces high glucose-induced oxidative damage，restores the EPCs normal function，and reduces the releases of inflammatory cytokines and apoptosis，thus playing a protective effect on human EPCs through inducing the expression of VEGF and VEGFR-2.

Human endothelial progenitor cells;High glucose;Procyanidin B2;Oxidative stress;Apoptosis; Vascular endothelial growth factor

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.005

1000-4718(2016)07-1180-09

2015-12-08

2016-01-21

△Tel:010-58805431;E-mail:keyanxiangmu1@163.com