人外周血基因組DNA提取的影響因素及方案選擇

張 振，楊文濤，陳 炯，馮 巍

·綜述·

人外周血基因組DNA提取的影響因素及方案選擇

張 振1，楊文濤2，陳 炯1，馮 巍1

目的 人外周血是基因組DNA樣品的主要來源之一，了解外周血基因組DNA提取的研究進(jìn)展，有助于法醫(yī)檢案中選擇并優(yōu)化DNA提取方案。方法 回顧外周血基因組DNA提取的主要環(huán)節(jié)和影響因素，綜述文獻(xiàn)進(jìn)行比較研究。結(jié)果 白細(xì)胞裂解是決定DNA提取產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，去污劑是各種白細(xì)胞裂解液的核心組分。裂解后DNA分離純化是影響DNA提取的另一重要環(huán)節(jié)，目前固相介質(zhì)分離純化法應(yīng)用較廣。實(shí)驗(yàn)室手工方案在一般實(shí)驗(yàn)室處理小批量樣品時(shí)仍具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，試劑盒方案目前應(yīng)用較為廣泛，自動(dòng)化提取系統(tǒng)尤其適用于大批量樣品處理。然而，任何方案均不能同時(shí)滿足DNA產(chǎn)量與質(zhì)量、操作時(shí)間、安全性、費(fèi)用等指標(biāo)的同時(shí)最優(yōu)化的要求。結(jié)論 人外周血基因組DNA提取方案眾多，需綜合考慮DNA提取效能、操作時(shí)間、安全性、費(fèi)用、設(shè)備和試劑易得性等多種因素，選擇適宜的DNA提取方案。

外周血；基因組DNA；DNA提取

從臨床診斷到生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，外周血樣品(以下簡(jiǎn)稱“血樣”)一直是最常用的生物檢材之一[1]，能否從中提取高產(chǎn)量、高質(zhì)量基因組脫氧核糖核酸(genomic deoxyribonucleic acid，gDNA)是限制后續(xù)DNA分子操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。血樣gDNA提取方案眾多，其機(jī)制不一，簡(jiǎn)繁各異，耗費(fèi)不等，安危有別，因而迄今尚無公認(rèn)的普適性方案[2-4]。因此，有必要把握血樣gDNA提取的主要環(huán)節(jié)及其操作原理，并了解各種方案的提取效果，才能針對(duì)自身實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)際條件，選擇并優(yōu)化方案。本研究綜述相關(guān)提取方案，以期為選擇并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案提供參考。

1 血樣基因組DNA提取的主要環(huán)節(jié)及影響因素

一般而言，血樣gDNA提取包含如下操作環(huán)節(jié)：白細(xì)胞分離，白細(xì)胞裂解，DNA分離純化?，F(xiàn)有血樣gDNA提取方法，均源自于上述操作的增刪或者改良，見圖1。

1.1 白細(xì)胞分離

人類外周血中，每微升僅包含有核白細(xì)胞約4 000～10 000個(gè)，血清、紅細(xì)胞、血小板等其他組分中包含大量蛋白質(zhì)、脂類、多糖、無機(jī)鹽及小分子物質(zhì)，可不同程度地抑制擴(kuò)增酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶等多種生物酶活性[5]。因而，白細(xì)胞成分洗滌分離，成為許多血樣gDNA提取方案的起始步驟。

對(duì)于新鮮或冷藏抗凝血樣，靜置或離心后，富集的白細(xì)胞層可直接轉(zhuǎn)移至新管，加入等滲的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)或生理鹽水，反復(fù)洗滌，即可獲得較為純凈的白細(xì)胞成分。這種白細(xì)胞直接分離操作，通常用于較多量的血樣(5 mL以上)。實(shí)際上低滲液洗滌法更為常用，該法又稱為全血裂解法。利用細(xì)胞滲透脆性差異，血樣中加入低滲洗滌液而后離心，可除去非白細(xì)胞成分。有多種低滲洗滌液可供選擇，最簡(jiǎn)單的就是去離子水[6]，應(yīng)用最為廣泛的則是紅細(xì)胞裂解液(20 mmol·L-1Tris-Cl,pH7.6)，還有文獻(xiàn)在10 mmol·L-1Tris-Cl(pH7.5～8.0)緩沖液的基礎(chǔ)上，添加蔗糖、MgCl2、Triton X100、KCl、EDTA 、NP-40、NH4Cl等[7-10]。 凍融過程對(duì)血細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞顯著，因此，通常使用等滲PBS洗滌凍藏抗凝血[11]。也有文獻(xiàn)報(bào)道，-20 ℃保存15～30 a的凍藏血樣，使用低滲TE緩沖液洗滌，也可以有效分離白細(xì)胞成分[9]。

實(shí)際工作中，具體選擇哪種或哪幾種白細(xì)胞分離方法，其操作原則：既要盡可能徹底去除紅細(xì)胞、血清等無核成分，同時(shí)要盡可能保護(hù)白細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，以免DNA過多損失。

1.2 白細(xì)胞裂解

血樣gDNA提取方案眾多，甚至依據(jù)DNA分離純化措施予以命名及分類，但是方案的核心環(huán)節(jié)均是白細(xì)胞裂解，這是決定DNA提取產(chǎn)量及質(zhì)量的最關(guān)鍵步驟。

1.2.1 固相裂解 將外周血涂布于醫(yī)用紗布、棉簽、濾紙或FTA卡等固相載體上，干燥脫水，即可裂解血細(xì)胞并抑制核酸酶活性。在干燥、避光的室溫環(huán)境中，干燥血樣可長(zhǎng)期保存[1]。

1.2.2 液相裂解 純水就是一種最簡(jiǎn)單的細(xì)胞裂解液，而經(jīng)典的細(xì)胞裂解液幾乎都包含蛋白酶、去污劑和鹽類。

1.2.2.1 去污劑 去污劑是細(xì)胞裂解液的核心組分，是由疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)構(gòu)成的有機(jī)化合物。在特定的溫度、濃度條件下，去污劑分子在水溶液中形成膠束，后者的疏水中心會(huì)結(jié)合到蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的疏水區(qū)域，破壞蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)—脂質(zhì)、脂質(zhì)—脂質(zhì)之間的非共價(jià)連接[12]，從而使DNA游離于裂解體系中。去污劑可分為離子型、兩性離子型和非離子型3類，常見的十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecyl sulfate, SDS)、Triton家族、Tween家族、CHAPS、NP-40等[12]。最常應(yīng)用的去污劑是SDS，其優(yōu)點(diǎn)主要包括：①SDS活性強(qiáng)，幾乎可以破壞所有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)的非共價(jià)鍵，從而使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破裂、蛋白質(zhì)變性[12]。②SDS可增強(qiáng)蛋白酶K消化效果[13]。③各種類型的蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合后，都帶有相同密度的負(fù)電荷，且復(fù)合物呈短軸相同的長(zhǎng)橢圓棒狀[14]，同時(shí)，SDS在溫度較低時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀[15]，因而易于鹽析、離心去除。④SDS可溶于70%乙醇溶液，而DNA則溶解度極低，有助于進(jìn)一步純化DNA樣品。

1.2.2.2 蛋白酶K 蛋白酶K(protease K, PK)是一種廣譜、高效的絲氨酸蛋白酶，能夠快速消化膜蛋白、組蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白，促進(jìn)DNA游離；能夠快速滅活核酸酶，有助于保護(hù)游離DNA結(jié)構(gòu)完整性[13,16-17]。與去污劑、尿素、EDTA等共存時(shí)，由于底物蛋白質(zhì)變性、肽鏈伸展疏松，可極大促進(jìn)PK消化活性[13]。在寬泛的pH范圍內(nèi)(pH4.0～12.5)，PK均可保持穩(wěn)定的生物活性[13,16,18]。因此，PK是很多細(xì)胞裂解方案的優(yōu)選要素，尤其適用于超高分子量gDNA提取。

1.2.2.3 鹽類 細(xì)胞裂解液中鹽類的作用，主要有調(diào)節(jié)酸堿度(Tris-Cl)、抑制內(nèi)源性核酸酶(EDTA)、穩(wěn)定核酸結(jié)構(gòu)(Tris-Cl、NaCl)、促進(jìn)去污劑膠束形成(NaCl)等。經(jīng)典的細(xì)胞裂解液一般包含PK、SDS、Tris-Cl 、EDTA 、NaCl等。要提取高分子量的、較純凈的gDNA，通常首選含蛋白酶K和去污劑的細(xì)胞裂解液，這也是多數(shù)商品化試劑盒的優(yōu)選方案[19-20]。PK消化通常是DNA提取的限速環(huán)節(jié)，為了縮短操作時(shí)間，也可以不用PK，使用含Tris飽和酚[9]、鹽酸胍[21]、SDS[8,10,22-23]或洗衣粉[7]的細(xì)胞裂解液，甚至直接加熱溫育[24]，也能實(shí)現(xiàn)白細(xì)胞裂解并游離DNA的目的。此外，根據(jù)鹽離子濃度，細(xì)胞裂解液也可分為中鹽[7,9,11,23]、高鹽[8-10,25-26]緩沖液。

一般而言，白細(xì)胞裂解液的使用原則是：確保破壞白細(xì)胞結(jié)構(gòu)，充分游離并保護(hù)DNA，且應(yīng)保持DNA濃度適中，以便于后續(xù)DNA分離純化。然而，各種白細(xì)胞裂解液的組分及比例差異顯著，血樣與裂解液的體積比、孵育溫度及時(shí)間等因素也各不相同。同時(shí)，白細(xì)胞裂解液組成還受到上游白細(xì)胞分離、下游DNA分離純化環(huán)節(jié)的多因素影響。因此，如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬?yōu)化白細(xì)胞裂解液配方及操作條件，依然是一個(gè)有待深入研究的重要問題。

1.3 DNA分離純化 如何盡可能去除蛋白質(zhì)、脂類、多糖及其他小分子物質(zhì)，同時(shí)保證DNA產(chǎn)量及結(jié)構(gòu)完整性，是DNA分離純化階段的核心問題。此外，DNA提取方法尚無公認(rèn)的命名及分類標(biāo)準(zhǔn)，大多依據(jù)DNA分離純化措施予以確定。

1.3.1 有機(jī)試劑法

1.3.1.1 酚—氯仿 酚—氯仿抽提是最經(jīng)典的DNA分離純化方法[1]。這種方法能夠充分除去蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、色素等混雜物質(zhì)[9]，得到高純度DNA[27]，且不需要特殊設(shè)備。但是，苯酚具有強(qiáng)烈腐蝕性，而氯仿具有肝毒性和致癌性，因此，可以使用特殊離心管進(jìn)行酚—氯仿抽提DNA，利用硅質(zhì)凝膠(silica gel polymer)封閉下層有機(jī)相，以避免有機(jī)試劑危害[28]。此外，使用低毒性苯甲醇(benzyl alcohol)，替代苯酚、氯仿，也能有效分離gDNA[29]。

1.3.1.2 甲酰胺 甲酰胺(formamide)是一種離子化有機(jī)溶劑，能解離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并使蛋白質(zhì)變性游離。在細(xì)胞裂解混合物中，加入1.25倍體積的高濃度甲酰胺變性緩沖液，而后反復(fù)透析操作，即可得到長(zhǎng)達(dá)7 200 kb的gDNA。但是，這種方法操作時(shí)間長(zhǎng)，DNA損失嚴(yán)重[21]。

1.3.2 鹽析法 利用溶解度差異分離蛋白質(zhì)與DNA，即是鹽析法分離純化DNA的理論基礎(chǔ)。鹽析通常使用終濃度1.2～1.8 mol·L-1的NaCl[8, 25, 30]或者0.75 mol·L-1的KAc[23]。鹽析法幾乎避免了有機(jī)試劑法的所有缺點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便，因而可用于批量血樣處理。缺點(diǎn)則是DNA純度(蛋白質(zhì)殘留)不夠穩(wěn)定，但通常A260/A280也能達(dá)到1.8左右[2]。

1.3.3 固體介質(zhì)法 固體介質(zhì)種類繁多，一般基于分子篩效應(yīng)(size exclusion chromatography，SEC)、離子交換(ion-exchange chromatography，IEC)或親和作用(affinity chromatography，AC)，實(shí)現(xiàn)核酸的分離純化[1]。與純液相操作方法相比，利用固體介質(zhì)分離純化DNA，受人為因素干擾小，操作穩(wěn)定性高，且非常適用于大批量核酸提取，因而被絕大多數(shù)商品化試劑盒所采用[1,4,31]。不過，此類方法通常費(fèi)用較高[2]。

1.3.3.1 硅質(zhì)介質(zhì)(silica matices) 在高離序鹽環(huán)境中(胍鹽、高氯酸鹽、碘鹽和醇等)，DNA 能被硅質(zhì)介質(zhì)特異性地吸附，經(jīng)一系列快速漂洗操作，去除非特異性吸附的雜質(zhì)，而后使用低鹽溶液或去離子水洗脫[31-33]。此類商品化試劑盒很多，如NucleoSpin?、UltraClean?、BloodSpin?、QIAamp?、Wizard?、EconoSpin?、GenElute?等，通常40～60 min，即可得到較高純度的gDNA[31]。

1.3.3.2 離子交換樹脂(ion exchange resins) Chelex-100由苯乙烯、苯二乙烯共聚體構(gòu)成，對(duì)多價(jià)金屬離子有強(qiáng)烈的螯合效應(yīng)，從而抑制DNA降解，是法醫(yī)遺傳學(xué)提取血樣gDNA的最常用方法[34-35]。血樣經(jīng)簡(jiǎn)單洗滌后，加入Chelex-100，直接加熱孵育，DNA即可釋放、游離于上清液中。該法操作簡(jiǎn)單快捷，可用于微量血樣處理，但所提取DNA樣品雜質(zhì)較多，長(zhǎng)期保存易于降解，且DNA呈單鏈形式的較短片段，通常僅用于PCR，而不適用于限制性酶切、克隆等分子操作[31,34-35]。二乙氨基乙基纖維素(diethylaminoethyl cellulose，DEAE-C)是一種弱堿性陰離子交換樹脂，在特定pH和鹽濃度下，可特異性結(jié)合DNA，而后快速漂洗，去除RNA、多糖等非特異性結(jié)合物，從而得到純凈的gDNA樣品[4,36]。

1.3.3.3 磁珠(magnetic beads) 利用磁珠法提取gDNA，通常采用硅質(zhì)膜包被的生物磁珠。在Chaotropic鹽體系[33]或Kosmotropic鹽體系[37]中，硅質(zhì)膜磁珠特異性吸附核酸，形成核酸—磁珠復(fù)合體。該復(fù)合體可通過磁場(chǎng)分離而無需離心，經(jīng)快速洗滌和溶解，即可得到理想的DNA[38-39]。該方法可處理微量血樣(30 μL)，DNA產(chǎn)量高、質(zhì)量好，尤其是不需離心，操作簡(jiǎn)單、快速而高效，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，便于大批量血樣處理，因而也是當(dāng)前試劑盒的重點(diǎn)研發(fā)方法[1,3,6,39-40]。

2 gDNA提取方案的比較

理想的DNA提取方案應(yīng)滿足以下要求：DNA產(chǎn)量與質(zhì)量滿足研究要求，結(jié)果穩(wěn)定，樣品污染風(fēng)險(xiǎn)低，操作簡(jiǎn)便，快速，安全，費(fèi)用低廉，不需特殊設(shè)備等[22,31]。盡管血樣gDNA提取方案(包括試劑盒)多達(dá)數(shù)十種，但任何一種方案都很難同時(shí)滿足上述要求[31]。Lahiri等[22]采集5份EDTA抗凝血，比較研究了11種DNA提取方案，這些方案均為手工操作，不涉及試劑盒試劑或固體介質(zhì)。結(jié)果Lahiri-A法產(chǎn)量最高，5 mL全血可得(210±28)μg的DNA；Promega法產(chǎn)量最低，僅(55±2)μg。11種方案的A260/A280比值為1.70～1.94之間，而是否使用苯酚、氯仿，對(duì)DNA純度影響不甚明顯。所得DNA片段長(zhǎng)度均大于23 kb，僅Kunkel法出現(xiàn)相對(duì)明顯的DNA降解現(xiàn)象，全部DNA樣品均能滿足RE酶切、Southern blot。在操作時(shí)間方面，Lahiri-A法、Lahiri-B法僅需1 h，速度最快，見表1。

商品試劑盒使用固定的緩沖液和固體分離介質(zhì)，極大改善了DNA提取效率和穩(wěn)定性。Chacon-Cortes等[2]搜集了11份長(zhǎng)期凍藏血樣(-80 ℃，8 a以上)，選擇了一種傳統(tǒng)鹽析提取、改良硅珠鹽析提取和試劑盒硅質(zhì)膜純化柱，比較三者DNA產(chǎn)量、純度、每樣品費(fèi)用和操作時(shí)間等，見表2。

表1 11種gDNA手工提取方案的比較

注：文獻(xiàn)來源：J Biochem Biophys Methods,1992,25(4):193-205。

表2 gDNA手工與試劑盒提取方案比較

注：O/N：過夜。文獻(xiàn)來源：Mol Biol Rep,2012,39(5):5961-5966。

Lee等[41]比較研究了3種自動(dòng)化DNA提取系統(tǒng)，全血提取gDNA，并計(jì)算了每微升全血DNA校正產(chǎn)量。3種系統(tǒng)的操作時(shí)間、提取效率沒有顯著差異，都能得到高質(zhì)量gDNA，見表3。

表3 3種自動(dòng)化DNA提取系統(tǒng)比較

注：結(jié)果為每μL血樣的DNA產(chǎn)量。文獻(xiàn)來源：Yonsei Med J,2010,51(1):104-110。

3 血樣基因組DNA提取方案選擇

血樣gDNA提取方案可粗略劃分為3類：實(shí)驗(yàn)室手工方案、半自動(dòng)化試劑盒方案和全自動(dòng)化提取系統(tǒng)。

3.1 實(shí)驗(yàn)室手工方案 實(shí)驗(yàn)室手工方案中，綜合考慮DNA產(chǎn)量與質(zhì)量、安全性、操作時(shí)間、費(fèi)用等因素，最優(yōu)方案應(yīng)該是“白細(xì)胞洗滌分離+SDS細(xì)胞裂解+NaCl鹽析+醇沉淀純化DNA”。該方案無需特殊場(chǎng)地和設(shè)備，試劑及耗材低廉，安全無毒害，操作簡(jiǎn)單，所有步驟都能靈活調(diào)整，適用于一般實(shí)驗(yàn)室小批量提取血樣gDNA。但是，此類方案的試劑配制步驟繁瑣，操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，結(jié)果不夠穩(wěn)定。因此，尋求一種快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)的手工提取方案，仍然具有重要的研究及應(yīng)用價(jià)值。

3.2 試劑盒方案 試劑盒方案基本克服了傳統(tǒng)手工操作方案的缺點(diǎn)，尤其是硅質(zhì)膜純化柱法、磁珠法，已經(jīng)成為血樣gDNA提取的主流策略，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各領(lǐng)域。然而，樣品量過大時(shí)，超過固體介質(zhì)吸附能力，可能導(dǎo)致DNA損失或雜質(zhì)殘留，仍然是試劑盒方案的弱點(diǎn)。此外，特殊設(shè)備(如磁力架)和費(fèi)用仍然遠(yuǎn)大于手工方案。

3.3 自動(dòng)化提取系統(tǒng) 試劑盒聯(lián)用自動(dòng)化工作站系統(tǒng)，能完全擺脫手工操作，可最大限度地減少人為誤差的干擾，結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，非常適用于臨床診斷、疾病控制中心等場(chǎng)所，進(jìn)行大批量血樣處理。但是，需要特殊場(chǎng)地、設(shè)備，而且試劑及耗材昂貴。

綜上所述，白細(xì)胞裂解是決定DNA提取產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，去污劑是各種白細(xì)胞裂解液的核心組分。裂解后DNA分離純化是影響DNA提取的另一重要環(huán)節(jié)，目前固相介質(zhì)分離純化法應(yīng)用較廣。實(shí)驗(yàn)室手工方案在一般實(shí)驗(yàn)室處理小批量樣品時(shí)仍具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，試劑盒方案目前應(yīng)用較為廣泛，自動(dòng)化提取系統(tǒng)尤其適用于大批量樣品處理。因此，人外周血基因組DNA提取方案眾多，需綜合考慮DNA提取效能、操作時(shí)間、安全性、費(fèi)用、設(shè)備和試劑易得性等多種因素，選擇適宜的DNA提取方案。

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Influential Factor and Protocols Selection for Genomic DNA Extraction from Human Peripheral Blood Samples

ZHANG Zhen1, YANG Wen-tao2, CHEN Jiong1, FENG Wei1

(1.School of Forensic Medicine, Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Neixiang County Public Security Bureau,Neixiang 474350, China )

ObjectiveHuman peripheral blood samples were one of the main sources used to obtain genomic deoxyribonucleic acid (gDNA). In order to select the optimal DNA extraction protocol on forensic identification, it would be helpful to investigate the research progress of DNA extraction.MethodsThere reviewed the common procedures adopted by most DNA extraction protocols, and highlighted the principles of its operation and impact factors by searching the representative studies from database.ResultsThe lysis of white blood cell (WBC) was a key step to determine the yield and quality of extracted DNA. Detergents were usually the core component of a variety of WBC lysis solution. Another key step was the separation and purification of free DNA which usually involved some solid media. The manual protocols had still common alternatives for DNA extraction from peripheral blood samples, especially when a few samples were processed in small laboratories. A variety of DNA extraction kits had been widely used at present. Several automated systems for gDNA extraction were very suitable for treating the large quantities of blood samples. However, there was not enough scientific evidence to support one particular DNA extraction method from whole blood samples in terms of DNA yield and quality, time consumption, safety, and cost.ConclusionThe optimal choice for gDNA extraction had still based on comprehensive consideration of multiple items, such as DNA extraction efficiency, time consumption, safety, cost, and availability of equipment and reagents from variety protocols.

peripheral blood；genomic DNA；DNA extraction

1672-688X(2016)04-0310-06

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.022

國(guó)家自然科學(xué)基金(81501634) 河南科技大學(xué)高級(jí)別項(xiàng)目培育基金(012ZCX021)

2016-07-25

1.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽471003 2.內(nèi)鄉(xiāng)縣公安局，河南內(nèi)鄉(xiāng)474350

張振(1973-)，男，河南淮陽人，博士，講師，從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究工作。

D919.2

B