模擬生物膜上識(shí)別食品中鋁離子毒性機(jī)理的研究

廖天錄，廖天江（甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工學(xué)院 甘肅天水 741025）

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模擬生物膜上識(shí)別食品中鋁離子毒性機(jī)理的研究

廖天錄，廖天江（甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工學(xué)院 甘肅天水 741025）

以玻碳電極支撐的磷脂雙層膜（s-BLM） 作為生物膜的模型，F(xiàn)e（CN）63-/4-為探針?lè)肿樱?利用循環(huán)伏安法和交流阻抗技術(shù)研究了鋁離子與s-BLM 的相互作用，結(jié)果表明， 鋁離子與s- BLM之間可以發(fā)生比較強(qiáng)烈的相互作用， 誘發(fā)s-BLM 上形成離子通道， 并且作用后的s-BLM 在10mmol/L 的檸檬酸三鈉（Sodium citrate）溶液中能夠自我修復(fù)， 這表明采用強(qiáng)的鰲合劑從機(jī)體組織中將鋁奪取，撤走鋁離子則通道關(guān)閉。

鋁離子；循環(huán)伏安；交流阻抗；離子通道；支撐磷脂雙層膜

0、引言

對(duì)哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)， 鋁是一種非必需元素，由于鋁制品在醫(yī)藥、食品加工及日常生活中的廣泛應(yīng)用，人體中的鋁的含量有逐漸增高的趨勢(shì)，其與人體健康的關(guān)系倍受關(guān)注。近年來(lái)，有關(guān)鋁對(duì)人類(lèi)健康作用的研究表明，鋁對(duì)人的毒性表現(xiàn)為引起神經(jīng)失調(diào)，在Parkinson’s 病和Alzheimer’s 病患者的大腦中發(fā)現(xiàn)有鋁的積累；一些長(zhǎng)期透析治療腎功能障礙的病人出現(xiàn)神經(jīng)癥狀， 稱(chēng)為“透析腦病”，從死于這種疾病的人腦灰質(zhì)里發(fā)現(xiàn)有高濃度的鋁。鋁毒性分子學(xué)機(jī)理研究表明，鋁的有毒形態(tài)是自由態(tài)Al3+，如果能夠與自由態(tài)Al3+形成穩(wěn)定的配合物的配體即可降低自由態(tài)在人體內(nèi)的濃度，從而降低或解除鋁對(duì)人體的毒性；Akeson等人近來(lái)的研究結(jié)果表明Al3+強(qiáng)烈地結(jié)合在PC 脂質(zhì)體的表面，且改變了其膜電位；Martin報(bào)告Al3+在膜上的結(jié)合位點(diǎn)是磷酸酯或碳酸酯基團(tuán)， 鋁離子引起脂質(zhì)體膜脂結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。

生物膜上離子行為的研究已經(jīng)引起人們?cè)絹?lái)越大的興趣， 20世紀(jì)60年代后， 平板雙層類(lèi)脂膜（BLM） 被普遍認(rèn)為是所有生物膜的基本結(jié)構(gòu)。但由于平板雙層類(lèi)脂膜壽命較短（通常只有幾小時(shí)），這大大限制性了其在各領(lǐng)域的應(yīng)用。直到近年來(lái)出現(xiàn)了具有較長(zhǎng)壽命的固體支撐的雙層類(lèi)脂膜（s-BLM），才解決了傳統(tǒng)BLM 生物傳感器壽命短、穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，支撐磷脂雙層膜（s-BLM）制備簡(jiǎn)單，有良好的穩(wěn)定性，用電化學(xué)方法研究支撐磷脂雙層膜與物質(zhì)的相互作用重現(xiàn)性較為理想， 在作用機(jī)理的推斷方面有其獨(dú)到之處，在生物傳感器等方面也有著廣泛的應(yīng)用前景。利用循環(huán)伏安（CV）和交流阻抗（EIS）來(lái)研究s-BLM與生物分子［1］，藥物分子［2］及離子［3，4］的作用已有相關(guān)報(bào)道。我們以玻碳電極支撐的卵磷脂雙層膜（s-BLM）作為生物膜的模型，為探針?lè)肿?，利用電化學(xué)方法研究了Al3+對(duì)卵磷脂雙層膜電化學(xué)行為的影響，發(fā)現(xiàn)Al3+能誘導(dǎo)磷脂雙層膜產(chǎn)生離子通道。并且發(fā)現(xiàn)作用后的s-BLM 在10mmol/L的檸檬酸三鈉（Sodium citrate）溶液中能夠自我修復(fù)，這表明采用強(qiáng)的鰲合劑從機(jī)體組織中將鋁奪取，撤走鋁離子則通道關(guān)閉。因此，采用強(qiáng)的鰲合劑從機(jī)體組織中將鋁奪取，然后經(jīng)代謝排出，有利于健康。對(duì)于進(jìn)一步研制減輕人體內(nèi)鋁負(fù)荷的藥物提供理論基礎(chǔ)。

1、實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑及儀器

卵磷脂（PC）購(gòu)于上海生物藥業(yè)集團(tuán)有限公司，氯化鋁（AlCl3）購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑公司，檸檬酸三鈉（Sodium citrate）購(gòu)于北京化工廠；其他試劑都為分析純，水為二次蒸餾水。

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用三電極體系，其三電極系統(tǒng)是用裸玻碳電極或卵磷脂修飾玻碳電極作為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl（飽和KCl）為參比電極；循環(huán)伏安測(cè)定在CHI832電化學(xué)工作站（美國(guó)）上進(jìn)行，交流阻抗測(cè)定在VMP2電化學(xué)工作站（美國(guó)）上完成，Branson200超聲清洗儀（美國(guó)）；石英管加熱式自動(dòng)雙重純水蒸餾器（1810B，上海亞太技術(shù)玻璃公司）。

1.2玻碳電極支撐磷脂雙層膜的制備

玻碳電極支撐磷脂雙層膜的制備方法，將卵磷脂溶于氯仿中配制成20μg/μL的卵磷脂成膜貯備液，并在-4℃下保存，在磷脂雙層膜制備之前，首先將玻碳電極分別用0.1，0.3和0.05μm的Al2O3拋光粉拋光至鏡面，分別放入二次水和丙酮中超聲清洗5分鐘。然后，將預(yù)處理的玻碳電極浸入0.1mol/L KOH溶液并在1.5V的電壓下極化3分鐘，極化之后，玻碳電極表面用N2吹干。隨后，將極化之后的電極浸入成膜液中30秒，取出立即浸入0.1mol/L KCl溶液，磷脂雙層在玻碳電極表面形成，即可得到玻碳電極支撐磷脂雙層膜。

1.3實(shí)驗(yàn)過(guò)程

循環(huán)伏安和交流阻抗實(shí)驗(yàn)在 1.0mmol/L的K3Fe（CN）6溶液中（0.1mol/L KCl為支持電解質(zhì)）進(jìn)行。工作電極分別為裸玻碳電極，PC修飾電極，與氯化鈣作用后的PC修飾電極。交流阻抗實(shí)驗(yàn)在施加交流信號(hào)振幅為10mv，K3Fe（CN）6氧化還原電對(duì)的式電勢(shì)（+0.225）下進(jìn)行，頻率范圍200KHz-0.1Hz。

2、結(jié)果與討論

2.1裸玻碳電極以及修飾了磷脂膜的玻碳電極的循環(huán)伏安響應(yīng)

我們通過(guò)循環(huán)伏安方法來(lái)判斷支撐磷脂雙層膜的質(zhì)量。圖（1-a）顯示了裸玻碳電極在含有0.1mol/L KCl的1.0mmol/L的Fe（CN）63-/4-溶液中的電化學(xué)響應(yīng)。圖（1-b）則為表面修飾了磷脂膜的玻碳電極在該溶液中的循環(huán)伏安響應(yīng)。比較圖（1-a）與圖（1-b）可以發(fā)現(xiàn)，圖（1-b）中所示的電極的循環(huán)伏安響應(yīng)中，的峰電流幾乎消失，說(shuō)明到達(dá)電極表面發(fā)生反應(yīng)的過(guò)程在一定程度上受阻，這證明在玻碳電極表面成功地制備出了支撐磷脂膜。

圖1　玻碳電極在1 mmol/L Fe（CN）63-/4- + 0.1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖； （a）裸玻碳電極， （b） 支撐磷脂雙層膜的玻碳電極。掃描速度：50mV/s。

2.2修飾了磷脂膜的玻碳電極的交流阻抗響應(yīng)

磷脂雙層膜的形成可通過(guò)測(cè)定電極電容來(lái)確定，交流阻抗是研究修飾電極表面性質(zhì)的一種有效的方法。圖2是裸玻碳電極和PC修飾玻碳電極的阻抗圖譜（Nyquist曲線）?？梢钥吹铰悴Ｌ茧姌O的阻抗譜幾乎表現(xiàn)為一條直線圖（2-a）， 這說(shuō)明探針?lè)肿臃浅Ｈ菀椎竭_(dá)電極表面發(fā)生反應(yīng)，電極上不存在阻擋電子傳遞的物質(zhì)，在裸GC電極上的反應(yīng)是受擴(kuò)散控制的，電化學(xué)反應(yīng)較快。由圖（2-b） 可以看出，當(dāng)支撐磷脂膜存在時(shí)，其復(fù)平面阻抗圖變?yōu)橛呻姾蓚鬟f過(guò)程控制的一個(gè)半徑較大的半圓，這表明形成磷脂膜后電荷傳遞電阻顯著增大，膜內(nèi)部不存在缺陷，探針?lè)肿硬荒芡ㄟ^(guò)電極表面的修飾膜，該過(guò)程幾乎完全受動(dòng)力學(xué)控制。由此證明，在玻碳電極表面成功地制備了支撐磷雙層脂膜。

圖2　玻碳電極在1 mmol/L Fe（CN）63-/4- + 0.1 mol/L KCl溶液中的阻抗圖；（a）裸玻碳電極，（b）支撐磷脂雙層膜的玻碳電極。

為了進(jìn)一步研究修飾磷脂膜的玻碳電極所表現(xiàn)出來(lái)的阻抗信息， 我們選擇加以改進(jìn)的Randles等效電路［4］（如圖2中插圖）對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行擬合， 阻抗測(cè)量的結(jié)果由以下幾個(gè)參數(shù)來(lái)決定：支持電解質(zhì)電阻Rs、磷脂膜的電容Cm、磷脂膜的電阻Rm、雙層電容Cdl、電荷傳輸電阻Rct 和Warburg元件ZW。通過(guò)擬合計(jì)算， 可得出磷脂膜的電容Cm ， 再根據(jù)磷脂的相對(duì)介電常數(shù)κ=2.05［6］， 真空介電常數(shù)ε0 =8.85×10-14F/cm， 由Eq.1的方程可得到磷脂膜的厚度d 。

從Eq.1中得出d的大小約為4.53nm， 這說(shuō)明電極表面的磷脂膜的厚度為4.53nm。因?yàn)榱字p層膜的厚度約為4-10nm［6］， 這進(jìn)一步證明電極表面構(gòu)筑的是磷脂雙層膜。

2.3鋁離子與支撐磷脂雙層膜的相互作用

將修飾磷脂雙層膜的玻碳電極浸入4mmol/L的氯化鋁溶液中，分別放置不同時(shí)間后， 再將其放入1 mmol/L+0.1mol/L KCl溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試，其電化學(xué)響應(yīng)如圖3所示。

圖3　修飾有 BLM 的玻碳電極與2mmol/L的氯化鋁溶液作用不同時(shí)間后在1mmol/L Fe（CN）63-/4- + 0.1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖；作用時(shí)間： （a） 0； （b）5； （c） 10； （d） 15； （e）25； （f） 35； （g） 40min； （h）45min； 掃速：50mV/s。

我們可以看到隨著磷脂雙層膜與氯化鋁溶液的作用時(shí)間的增加， 循環(huán)伏安圖中的氧化還原峰電流也不斷增加， 這說(shuō)明越來(lái)越容易到達(dá)玻碳電極表面， 并在玻碳電極表面發(fā)生了電子的傳遞， 由此推斷鋁離子可能與卵磷脂酸性頭基之間相互作用，使卵磷脂分子自組裝方位發(fā)生改變，有序排列程度降低，進(jìn)而在s-BLM的表面產(chǎn)生一些微孔，探針?lè)肿油ㄟ^(guò)通道到達(dá)電極表面，產(chǎn)生了伏安響應(yīng)。

隨后，又考察了修飾磷脂雙層膜的玻碳電極與不同濃度的桑色素溶液作用10min后， 在1mmol/L+0.1mol/LKCl溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描， 如圖4所示。

圖4　修飾有 BLM 的玻碳電極與不同濃度的氯化鋁作用10min 后在1mmol/L Fe（CN）63-/4- +0.1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖；（a） 0；（b） 1.0； （c） 2.0； （d） 3.0 ；（e） 4.0 mmol/L；掃度： 50mVs-1.

由圖4可以看到， 隨著與磷脂雙層膜作用的氯化鋁溶液濃度的增加， 循環(huán)伏安圖中的氧化還原峰電流也不斷增加， 這說(shuō)明與磷脂雙層膜作用的氯化鋁溶液濃度越大， 就有越多的探針?lè)肿幽軌虻竭_(dá)玻碳電極的表面， 發(fā)生氧化還原反應(yīng)， 在相同的時(shí)間內(nèi)能夠到達(dá)電極表面的探針?lè)肿訑?shù)目越多， 磷脂雙層膜產(chǎn)生的缺陷或孔洞越多。

2.4磷脂膜與鋁離子作用后的自我修復(fù)

我們將與2mmol/L鋁離子作用45min后的表面覆蓋磷脂膜的玻碳電極放回到10mmol/L檸檬酸鈉溶液中，每隔一段時(shí)間，將該電極取出再放到1mmolLK3Fe（CN）6溶液中掃描時(shí)，探針的氧化還原峰明顯降低（如圖5所示），隨著與檸檬酸鈉作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其伏安響應(yīng)隨時(shí)間的增加峰電流逐漸降低，最后膜幾乎可以恢復(fù)到未與鋁離子作用前的水平。這說(shuō)明磷脂雙層膜與鋁離子作用產(chǎn)生離子通道在檸檬酸鈉溶液中是可以自我修復(fù)，重新自組裝的；由于A13+與檸檬酸鹽的相互作用，能形成穩(wěn)定的螯合物，使與磷脂頭部作用的鋁離子脫離后，磷脂分子重新自組裝排列，膜恢復(fù)到作用前的狀態(tài)，從而使探針不能到達(dá)電極表面產(chǎn)生伏安響應(yīng)。

3 、結(jié)論

在玻碳電極表面構(gòu)筑磷脂雙層膜， 利用循環(huán)伏安（CV）和交流阻抗（EIS）技術(shù)判斷磷脂雙層膜的成膜情況，測(cè)試了磷脂雙層膜與鋁離子相互作用的研究，發(fā)現(xiàn)在刺激離子（Al3+） 存在時(shí)，該雙層膜的通道打開(kāi)，并隨刺激離子濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，探針Fe（CN）63-/4-的伏安響應(yīng)增大。并且作用后的磷脂雙層膜在檸檬酸鈉溶液中是可以自我修復(fù)，說(shuō)明鋁離子與磷脂雙層膜之間的作用是可逆的，即沒(méi)有刺激離子時(shí)，膜通道關(guān)閉，再現(xiàn)了生物膜的離子通道行為。

圖5　修飾有BLM的玻碳電極在1mmol/L Fe（CN）63-/4 - + 0.1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖；（a）覆蓋有磷脂膜的玻碳電極； （b）磷脂膜與2mmol/L鋁離子作用45min 后； （c）與鋁離子作后放入10mmol/L檸檬酸鈉溶液中10min；（d） 30min；（e） 60min；掃速：50mV/s。

［1］趙靜，廖天錄，趙強(qiáng).槲皮素在磷脂澆鑄膜修飾玻碳電極上的電化學(xué)行為研究［J］.牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，75（2）：39-42.

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2014年天水市市級(jí)科學(xué)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（第一批）階段性研究成果