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    抗-HCV ELISA單陽、雙陽獻(xiàn)血者補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)及跟蹤分析研究

    2016-08-22 07:23:21張艷梅王新梅郭喜彪贠世文姜燕娟孟毓王富強(qiáng)新鄉(xiāng)市中心血站河南新鄉(xiāng)453000
    關(guān)鍵詞:獻(xiàn)血者核酸試劑

    張艷梅,王新梅,郭喜彪,贠世文,姜燕娟,孟毓,王富強(qiáng)新鄉(xiāng)市中心血站,河南新鄉(xiāng)453000

    抗-HCV ELISA單陽、雙陽獻(xiàn)血者補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)及跟蹤分析研究

    張艷梅,王新梅,郭喜彪,贠世文,姜燕娟,孟毓,王富強(qiáng)
    新鄉(xiāng)市中心血站,河南新鄉(xiāng)453000

    目的對(duì)抗-HCV ELISA有反應(yīng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行追蹤檢測(cè),了解其真實(shí)的病毒感染情況。方法對(duì)抗-HCV ELISA有反應(yīng)性獻(xiàn)血者在獻(xiàn)血3個(gè)月、6個(gè)月時(shí)采集標(biāo)本,進(jìn)行ELISA試驗(yàn)、HCV PCR檢測(cè)及RIBA確證3種平衡檢測(cè)。結(jié)果36例單試劑陽性標(biāo)本中,1例跟蹤核酸檢測(cè)陽性,RIBA確證陽性。36例雙試劑陽性標(biāo)本中有20例確證陽性(55.6%),不確定11例(30.6%),陰性5例(13.9%),跟蹤結(jié)果無變化。結(jié)論應(yīng)盡快出臺(tái)并實(shí)施獻(xiàn)血者補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)的具體規(guī)定,確保血液安全,減少獻(xiàn)血者流失;在試劑的選擇上應(yīng)選擇特異性和靈敏度都高的試劑,無論選擇哪種檢測(cè)方式,建議ELISA方法應(yīng)選擇雙抗原夾心法,也希望盡快在獻(xiàn)血者中開展NAT和ELISA平行檢測(cè),以有效降低輸血傳播感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)。

    抗-HCV ELISA有反應(yīng)性;HCV-RNA檢測(cè);RIBA檢測(cè);補(bǔ)充實(shí)驗(yàn);跟蹤檢測(cè)

    [Abstract]Objective To know their true virus infection by tracking and detecting the blood donors reactive to anti-HCV and ELISA.M ethods The specimens of blood donors reactive to anti-HCV and ELISA were collected at 3-month and 6-month after donating blood,and were given three balanced detections including ELISA test,HCV PCR test and RIBA confirmation.Results In 36 cases of sero-concordant specimens,1 positive case was detected by tracking nucleic acids,and 1 positive case was confirmed by RIBA.In 36 cases of sero-discordant specimens,20 positive caseswere confirmed(55.6%),11 caseswere uncertain(30.6%),5 caseswere negative(13.9%),and the tracking results had no change.Conclusion We should make and implement specific regulations of complementary experiment of blood donors as soon as possible to ensure the blood safety and reduce the loss of blood donors,and choose the reagentwith higher specificity and sensitivity degree,the double antigen sandwich method in ELISA method is suggested to be selected whichever detection method we choose and we hope to carry out NAT and ELISA parallel detection for donors as soon as possible thus effectively reducing risks of transfusion-transmitted infection virus.

    [Key words]Reactive to anti-HCV and ELISA;HCV-RNA detection;RIBA detection;Complementary experiment;Trace detection

    據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球每年有三四百萬人感染丙肝病毒,有1.3億~1.7億人患丙型肝炎。在我國(guó),丙肝患者約有4000萬人,丙肝發(fā)病率在所有病毒性肝炎中僅次于乙肝[1]。為控制HCV經(jīng)血液傳播,我國(guó)規(guī)定采用兩家ELISA抗體診斷試劑篩選獻(xiàn)血者丙型肝炎抗體或采用1種ELISA試劑檢測(cè)HCV抗體,采用1種試劑檢測(cè)HCV核酸[2]。對(duì)有反應(yīng)性的血液及其制備的所有成分報(bào)廢,并將該獻(xiàn)血者實(shí)施獻(xiàn)血屏蔽和淘汰,為了解其真實(shí)的感染情況,我們對(duì)部分抗-HCV ELISA有反應(yīng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)和跟蹤檢測(cè),現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1一般資料

    2013年8月—2014年6月新鄉(xiāng)市無償獻(xiàn)血者進(jìn)行初篩實(shí)驗(yàn)有反應(yīng)性標(biāo)本44例,(初篩試劑為抗HCV ELISA間接法(上??迫A和廈門新創(chuàng))和雙抗原夾心法(北京萬泰));2014年6月—2014年10月無償獻(xiàn)血者進(jìn)行抗-HCV ELISA初篩試驗(yàn)有反應(yīng)性標(biāo)本28例(初篩試劑為抗HCV ELISA間接法(廈門新創(chuàng))和雙抗原夾心法(北京萬泰))。其中抗-HCV ELISA 2次檢測(cè)結(jié)果不一致的標(biāo)本(單試劑陽性)36例,雙試劑陽性36例,分別在其獻(xiàn)血間隔3月、6月后電話追蹤,預(yù)約靜脈采樣進(jìn)行檢測(cè)。獻(xiàn)血者年齡18~55歲,男性占61%(44/ 72),女性占39%(28/72)。

    1.2標(biāo)本采集

    電話預(yù)約在本站采血點(diǎn)采集靜脈血樣,留取核酸檢測(cè)標(biāo)本及血清學(xué)檢測(cè)標(biāo)本各5mL,及時(shí)分離血清/漿,并存放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3試劑與設(shè)備

    ①血液篩查ELISA診斷試劑:上??迫A、廈門新創(chuàng)、北京萬泰雙抗原夾心試劑。所有試劑均經(jīng)中國(guó)藥品生物制品檢定所批批檢合格,并在有效期內(nèi)使用。②確證試驗(yàn)試劑:抗-HCV重組免疫印跡試驗(yàn)(RIBA):北京萬泰公司產(chǎn)品(RC20140101)。③核酸檢測(cè)試劑:上??迫A生物工程股份有限公司(14042511)。④設(shè)備:RSP150全自動(dòng)加樣系統(tǒng)、EVO全自動(dòng)加樣系統(tǒng)(瑞士TECAN),F(xiàn)AME24/20全自動(dòng)酶免處理系統(tǒng)(瑞士Hamilton)BEP150全自動(dòng)酶免分析儀(德國(guó)貝林),HT3酶標(biāo)儀,340RT溫控酶標(biāo)儀(奧斯幫生物工程有限公司),全自動(dòng)蛋白印跡儀PROFIBLOT48(瑞士TECAN),美國(guó)ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀。

    1.4檢測(cè)方法

    為了解ELISA篩查有反應(yīng)性獻(xiàn)血者的真實(shí)感染情況,我們對(duì)抗-HCV ELISA初篩試驗(yàn)有反應(yīng)性標(biāo)本分為2次檢測(cè)結(jié)果不一致的標(biāo)本(單試劑陽性)和雙試劑陽性兩組,分別對(duì)其3個(gè)月、6個(gè)月的標(biāo)本采用了ELISA試驗(yàn)、HCV PCR檢測(cè)及RIBA確證3種平衡檢測(cè)方案。

    1.4.1ELISA檢測(cè),對(duì)隨訪到的獻(xiàn)血者均進(jìn)行ELISA檢測(cè)。選用不同生產(chǎn)廠商ELISA試劑檢測(cè)2次,雙試劑有反應(yīng)判定為陽性,單試劑有反應(yīng)再用相同試劑做雙孔復(fù)查,雙孔有反應(yīng)或單孔有反應(yīng)判定為陽性,反之判為陰性。

    1.4.2HCV-RNA檢測(cè)采用美國(guó)ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果≥103 IU/mL為陽性。1.4.3 RIBA確證試驗(yàn)抗-HCV RIBA確證采用重組免疫印跡實(shí)驗(yàn)(RIBA),未出現(xiàn)HCV抗體特異條帶強(qiáng)度1+及以上判為陰性,至少出現(xiàn)兩種HCV抗體特異條帶(Core、NS3、NS4和NS5)強(qiáng)度1+及以上判為陽性,僅出現(xiàn)一種HCV抗體特異條帶(Core、NS3、NS4和NS5)強(qiáng)度1+及以上判為不確定。

    2 結(jié)果

    44份標(biāo)本RIBA及抗-HCV ELISA結(jié)果見表1,抗-HCV ELISA單試劑陽性標(biāo)本的確證結(jié)果和NAT結(jié)果見表2,雙試劑陽性獻(xiàn)血者追蹤檢測(cè)結(jié)果見表3。

    表1 44份標(biāo)本RIBA及抗-HCV ELISA結(jié)果

    2014年6月—2014年10月ELISA有反應(yīng)性標(biāo)本28例,其中RIBA陽性10例,RIBA不確定7例,RIBA陰性11例。

    表2 36例抗-HCV ELISA單試劑陽性獻(xiàn)血者追蹤檢測(cè)結(jié)果

    表3 36例抗-HCV ELISA雙試劑陽性獻(xiàn)血者追蹤檢測(cè)結(jié)果

    2 結(jié)果說明

    ①36例雙試劑陽性標(biāo)本中有20例確證陽性(55.6%),不確定11例(30.6%),陰性5例(13.9%),跟蹤結(jié)果無變化。②36例單試劑陽性標(biāo)本中,有1例跟蹤核酸檢測(cè)陽性,RIBA確證陽性,有14例RIBA不確定,經(jīng)跟蹤不確定結(jié)果無變化。

    3 討論

    該研究跟蹤的ELISA篩查有反應(yīng)性獻(xiàn)血者,分別在3個(gè)月、6個(gè)月進(jìn)行相關(guān)抽樣檢測(cè),旨在確???HCV病毒檢出前的窗口期。2001年6月召開的血液制品咨詢委員會(huì)(Blood Products Advisory Committee,BPCA)會(huì)議上報(bào)告的數(shù)據(jù)證實(shí),6個(gè)月的等待期已足以涵蓋HCV感染血清陽轉(zhuǎn)前的窗口期[3,4]。目前,國(guó)內(nèi)大多數(shù)采供血機(jī)構(gòu)未實(shí)施HCV NAT檢測(cè),更未對(duì)抗-HCV ELISA有反應(yīng)性獻(xiàn)血者作RIBA確證試驗(yàn)。單單由ELISA篩查“抗-HCV有反應(yīng)性”屏蔽獻(xiàn)血者,特別是一些長(zhǎng)期獻(xiàn)血者。容易給獻(xiàn)血者帶來心理負(fù)擔(dān),造成對(duì)無償獻(xiàn)血工作的誤解,引起對(duì)血站的抱怨和投訴。根據(jù)表2可以看出,ELISA篩查單試劑有反應(yīng)性者中有58.3%(21/36)均為潛在的合格獻(xiàn)血者,略低于龐棟等報(bào)告的69.4%[5],高于劉天宇等在血液篩查抗-HCV假陽性獻(xiàn)血者回歸的調(diào)查分析報(bào)道的54.88%[6]。WHO發(fā)布的《篩查獻(xiàn)血者血液經(jīng)輸血傳播感染的建議書》要求血站實(shí)驗(yàn)室開展篩查和確證試驗(yàn),分別用于血液篩查和獻(xiàn)血者管理[7]。目前美國(guó)、英國(guó)、澳大利亞等國(guó)均對(duì)此類獻(xiàn)血者的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)及回招標(biāo)準(zhǔn)做了明確規(guī)定[3,4]。鑒于此,我們建議相關(guān)部門盡快出臺(tái)此類獻(xiàn)血者進(jìn)一步補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)的具體規(guī)定,明確時(shí)間間隔,規(guī)范檢測(cè)流程。國(guó)外研究表明,RIBA不確定者在隨訪過程中一般轉(zhuǎn)為陰性或者繼續(xù)保持不確定結(jié)果,即判為假陽性結(jié)果[8-10]。該研究中共有25例不確定標(biāo)本,在隨后的跟蹤檢測(cè)中仍然保持不確定結(jié)果,因此,判定為假陽性。

    目前多數(shù)采供血機(jī)構(gòu)使用第三代國(guó)產(chǎn)間接法檢測(cè)試劑,由于受到非特異性抗體的影響較大,易造成假陽性.隨著丙肝重組抗原技術(shù)的進(jìn)步,采用雙抗原夾心法檢測(cè)丙肝抗體的理念也得以實(shí)現(xiàn),由表1可知,科華、新創(chuàng)、萬泰3個(gè)廠家的抗-HCV有反應(yīng)性標(biāo)本經(jīng)RIBA實(shí)驗(yàn)確證后,假陽性率分別為31%(5/16)、63%(10/16)、13%(2/16),萬泰雙抗原夾心法明顯優(yōu)于其他兩種試劑。雙抗原夾心法抗-HCV ELISA是檢測(cè)抗-HCV總抗體,既縮短了“窗口期”,又可以降低間接法引起的假陽性。因此,在試劑的選擇上應(yīng)選擇特異性和靈敏度都高的試劑,無論采用兩家ELISA抗體診斷試劑篩選獻(xiàn)血者丙型肝炎抗體或采用1種ELISA試劑檢測(cè)HCV抗體,1種試劑檢測(cè)HCV核酸,建議ELISA方法應(yīng)選擇雙抗原夾心法。也希望在獻(xiàn)血者中開展NAT和ELISA平行檢測(cè),以有效降低輸血傳播感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)。

    在對(duì)36例抗-HCV ELISA雙試劑陽性獻(xiàn)血者追蹤檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)有RIBA陽性20例,NAT陽性12例。理論上,血清中即使存在1個(gè)病毒核酸分子,都能通過NAT方法檢測(cè)出來,但在實(shí)際工作中,往往由于血清中病毒核酸含量太少導(dǎo)致核酸提取失敗、PCR試劑的檢測(cè)靈敏度、樣本和擴(kuò)增體系中可能存在某些抑制病毒核酸擴(kuò)增的因素等均可能影響病毒核酸的檢出[11],但考慮到是無償獻(xiàn)血人群,更有可能與獻(xiàn)血者HCV病毒血癥消退等因素有關(guān),尚需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

    在對(duì)36例單試劑陽性者追蹤中發(fā)現(xiàn)有1例出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,證實(shí)獻(xiàn)血者當(dāng)時(shí)處于病原體感染的窗口期,因此,對(duì)ELISA篩查單試劑陽性獻(xiàn)血者血液實(shí)施報(bào)廢處置及獻(xiàn)血者實(shí)施6個(gè)月的屏蔽期是非常有必要的,值得引起重視。

    [1]《丙型肝炎感染者調(diào)查、關(guān)護(hù)和治療指南》.世界衛(wèi)生組織. 2014年4.

    [2]《血站技術(shù)操作規(guī)程》2012版.

    [3]郭永健,姚鳳蘭,林授,等.HIV-1和HCV核酸檢測(cè)血液處置和獻(xiàn)血者屏蔽與歸隊(duì)指引(上),中國(guó)輸血雜志,2011,24 (1):79-85.

    [4]葛紅衛(wèi),林授,汪德海,等.HIV-1和HCV核酸檢測(cè)血液處置和獻(xiàn)血者屏蔽與歸隊(duì)指引(下),中國(guó)輸血雜志,2011,24 (2):172-176.

    [5]龐棟,申衛(wèi)東,張翙,等.ELISA篩查單試劑反應(yīng)獻(xiàn)血者追蹤檢測(cè),中國(guó)輸血雜志,2014,27(4):381-383.

    [6]劉宇寧,蔡菊英,劉曉音.血液篩查HBsAg、抗-HCV假陽性獻(xiàn)血者歸隊(duì)的調(diào)查分析.中國(guó)輸血雜志,2012,25(3):260-262.

    [7]WHO.Screening donated blood for transfusin-transmissible infections(Recommen dations).Geneva,2009:50-52.

    [8]Centers for Disease Control and Prevention.Recommendations for pre-vention andcontrol of hepatitis C virus(HCV)infection and HCV-re-lated chronic disease.MMWR Recomm Rep,1998,47(RR-19):1-39.

    [9]Lemaire JM,Courouce AM,Defer C,etal.HCV RNA in blood donors with isolated reactivities by third-generation RIBA. Transfusion,2000,40(7):867-870.

    [10]Stefania CMartin L.Lndeterminate third-generation hepatitis C recombinant immunoblot assay and HCV RNA analysis:isolated reactivitiy againstwith HCV viraemia in clinical patients but not bloods.Scand J Infect Dis,2005,37(6-7): 488-492.

    [11]李文新.不同方法試劑檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體結(jié)果分析.中國(guó)輸血雜志,2014,27(6):622-624.

    Research on Com p lementary Experiment and Tracking Analysis of Anti-HCV and ELISA Sero-concordant and Sero-discordant Blood Donors

    ZHANG Yan-mei,WANG Xin-mei,GUO Xi-biao,YUAN Shi-wen,JIANG Yan-juan,MENG Yu,WANG Fu-qiang
    Xinxiang Central Blood Station,Xinxiang,Henan Province,453000 China

    R7

    A

    1672-5654(2016)06(a)-0043-03

    10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.16.043

    新鄉(xiāng)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):14SF13)。

    張艷梅(1972.2-),女,河南新鄉(xiāng)人,本科,副主任技師,主要從事血液檢驗(yàn)及質(zhì)量管理。

    2016-03-21)

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