法舒地爾對百草枯致大鼠肺纖維化的干預作用

周挺，夏菁，李增攀，徐麗艷，韓文文，方建江（寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院，浙江 寧波315000）

法舒地爾對百草枯致大鼠肺纖維化的干預作用

周挺，夏菁，李增攀，徐麗艷，韓文文，方建江*
（寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院，浙江 寧波315000）

目的觀察急性百草枯（PQ）中毒大鼠肺組織轉化生長因子-β1（TGF-β1）的表達水平及法舒地爾對其的干預作用。方法將72只SPF級SD大鼠隨機分為正常對照組、法舒地爾對照組、PQ中毒組、法舒地爾干預組各18例，分別于灌胃后7、14、28天活殺大鼠留取標本。觀察大鼠行為學改變，HE和Masson染色觀察大鼠肺組織病理改變，實時熒光定量PCR及免疫組化法檢測TGF-β1的表達水平。結果光鏡下，PQ中毒組大鼠急性肺損傷及纖維化明顯，法舒地爾干預組大鼠肺組織損傷程度較PQ中毒組減輕。與正常對照組比較，PQ中毒組大鼠肺組織7、14、28天TGF-β1 mRNA及蛋白的表達量顯著增高，于28天達峰值，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；與同一時間PQ中毒組比較，法舒地爾干預組小鼠肺組織TGF-β1mRNA及蛋白表達量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論法舒地爾可以抑制百草枯中毒大鼠肺組織TGF-β1的表達，從而減輕大鼠肺纖維化程度。

百草枯；肺纖維化；轉化生長因子-β1；法舒地爾

百草枯（paraquat，PQ）是目前全球使用最廣泛的除草劑之一，口服中毒者短期內可出現多臟器功能障礙，數天內致死，度過急性期的患者最終多數死于肺纖維化［1］。轉化生長因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）是眾多纖維化疾病發(fā)生發(fā)展的重要因子［2］，日益引起大家重視。近年來發(fā)現法舒地爾作為一種高效的血管擴張藥，可以干預多種器官纖維化進程。本研究通過PQ灌胃染毒建立大鼠肺纖維化模型，檢測TGF-β1的動態(tài)變化，探討法舒地爾對百草枯致大鼠肺纖維化的干預作用。

1　材料與方法

1.1材料動物:SPF級健康雄性SD大鼠72只，200～230g，10周齡左右，由浙江省實驗動物中心提供，動物合格證號為:SCXK（浙）2014-0001，實驗大鼠由寧波大學動物實驗中心飼養(yǎng)，維持室溫22～25℃，濕度45%～55%，喂食顆粒飼料，實驗前8小時禁食，4小時禁水。試劑:注射用法舒地爾（批號: h20040356，天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產），20%百草枯溶液 （山東濟南天海科技有限公司，批號:4685-14-7）；TGF-β1抗體、免疫組化試劑盒（上海士鋒生物科技有限公司）。

1.2方法72只SPF級SD大鼠隨機分為4組，即正常對照組、法舒地爾對照組、PQ中毒組及法舒地爾干預組。各組再按隨機原則分為7、14、28天三個亞組，每個亞組6只大鼠。具體分組及方法見表1。各組大鼠于灌胃后第7、14、28天分批處死。開胸完整取出肺組織并觀察整體肺的變化情況，左上肺置于4%甲醛中固定，制備石蠟切片供組織學檢查、HE染色、Masson染色及免疫組化，其余肺組織入-70℃低溫冰箱保存，待測時制備肺組織勻漿。觀察各組大鼠行為學改變、肺組織病理學改變、TGF-β1mRNA的表達以及TGF-β1蛋白的表達。

表1　各組的實驗方法

1.3檢測指標

1.3.1病理學大鼠肺組織經4%甲醛固定后，脫水、包埋、連續(xù)切片，進行HE、Masson染色，光學鏡下觀察肺組織病理學改變；參照 Szapie等［3］方法，用Masson染色評定肺組織纖維化程度。

1.3.2TGF-β1mRNA的表達 嚴格按照 Realtime PCR操作流程操作，提取大鼠肺組織RNA進行檢測。引物由上?；瞪镉邢薰竞铣?。TGF-β1（長度95bp，上游5'-AGTCCCTGATGA CATTCCTTCTT-3'下游5'-CAAG TTTG AG A GGTGGTGTAAGC-3'）。

1.3.3TGF-β1蛋白的表達采用鏈霉親和素-過氧化物酶法（SABC）檢測，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。TGF-β1免疫組化結果以胞質出現棕色或棕黃色為陽性，每張切片在400倍視野下隨機取5個視野，用高清晰圖像分析系統(tǒng)半定量分析陽性表達部位TGF-β1蛋白的表達水平，計算其平均吸光度值（MOD）作為表達水平的半定量參數。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量數據以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊則進行秩和檢驗。

2　結果

2.1大鼠行為學改變PQ中毒組染毒后大鼠出現呼吸急促、精神萎靡、反應遲鈍、攻擊性降低、鼠毛蓬松粗糙、色澤黯淡等表現，同時間段法舒地爾干預組大鼠其呼吸急促、精神萎靡、反應遲鈍、毛發(fā)蓬松等表現相對較輕。

2.2肺組織病理學改變PQ中毒組光鏡下可見明顯肺泡炎，肺泡間隔水腫，間質內可觀察到炎性細胞聚集充血，肺泡結構破壞，隨時間延長，肺泡間隔增寬，成纖維細胞集聚（圖1C）；法舒地爾干預組肺泡炎較PQ中毒組減輕，滲出及充血減少，肺組織結構破壞減輕，肺泡間隔增寬不明顯（圖1D）。PQ中毒組大鼠肺組織藍染部分明顯，色暗質硬，部分區(qū)域表面凹凸不平，切片時韌度增加（圖2C）；法舒地爾干預組損傷程度較輕、范圍較小，韌度較輕（圖2D）。

圖1　大鼠肺組織HE染色后的病理學改變（×400）（1A:正常對照組；1B:法舒地爾對照組；1C:PQ中毒組；1D:法舒地爾干預組）

圖2　大鼠肺組織Masson染色后的病理學改變（×400）（2A:正常對照組；2B:法舒地爾對照組；2C:PQ中毒組；2D:法舒地爾干預組）

2.3TGF-β1mRNA的表達 正常對照組與法舒地爾對照組大鼠肺組織TGF-β1mRNA呈低表達，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與正常對照組比較，PQ中毒組大鼠肺組織 7、14、28天 TGF-β1mRNA表達量顯著增高，于28天達峰值，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；同一時間段法舒地爾干預組大鼠肺組織TGF-β1mRNA表達量較PQ中毒組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。詳見表2。

表1 各組大鼠肺組織TGF-β1mRNA的表達（±s，×103）

表1 各組大鼠肺組織TGF-β1mRNA的表達（±s，×103）

與正常對照組比較**P＜0.01，與PQ中毒組比較△△P＜0.01

?

2.4TGF-β1蛋白的表達正常對照組與法舒地爾對照組大鼠肺組織TGF-β1蛋白呈低表達，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；與正常對照組比較，PQ中毒組大鼠肺組織7、14、28天TGF-β1蛋白的表達量顯著增高，于28天達峰值，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；同一時間法舒地爾干預組小鼠肺組織TGF-β1蛋白表達量較PQ中毒組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。詳見表3。

表3　各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白的相對表達（±s）

表3　各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白的相對表達（±s）

與正常對照組比較**P＜0.01，與PQ中毒組比較△△P＜0.01

?

3　討論

百草枯是一種非選擇性接觸型除草劑，目前尚無特效解毒藥，已成為農藥中毒致死事件的常見病因。百草枯中毒可引起多臟器的損傷，尤以肺臟最為突出，早期主要以急性肺泡炎為主，細胞水腫，肺泡塌陷，肺毛細血管通透性增加，血細胞、體液大量進入肺泡腔內，影響通氣功能［4］。隨著百草枯誘導的急性肺泡炎進一步發(fā)展，成纖維細胞增生趨化，膠原蛋白沉積，最終導致肺纖維化［5］，其致纖維化機制復雜，目前尚未完全闡明。TGF-β1是目前所知最強的致纖維化因子，是纖維化形成與發(fā)展的啟動樞紐，能引起成纖維細胞趨化，促進膠原蛋白合成，改變細胞外基質成分［6］。有研究表明，PQ中毒時在氧代謝產物等作用下，大量釋放各種TGF-β因子，啟動肺組織的炎癥和纖維化過程［7-8］，促進肺成纖維細胞趨化和上調I、III型前膠原基因表達［9］。因而通過檢測TGF-β1的表達可以間接反映肺組織纖維化的程度。法舒地爾是ROCK選擇性阻斷劑，是目前唯一應用于臨床的抑制Rho/ROCK信號通路的藥物，近年法舒地爾在抗纖維化方面的作用日益引起重視。王玉珍等［10］研究發(fā)現法舒地爾可以減緩肝臟纖維化的進程，在腎間質纖維化［11］及心臟纖維化［12］等方面也有干預作用。目前，法舒地爾對肺纖維化治療方面的研究尚少，更無干預百草枯中毒致肺纖維化的研究報道。

本實驗成功復制了百草枯中毒致肺纖維化的大鼠模型，光鏡下可見PQ中毒組大鼠肺泡塌陷，肺間質水腫以及炎細胞浸潤 （圖1C），Masson染色顯示藍染部分明顯，色暗質硬，部分區(qū)域表面凹凸不平，纖維蛋白沉積增加，同時肺組織TGF-β1mRNA和蛋白的表達增加（圖2C），與正常對照組比較差異顯著，而經法舒地爾干預后，大鼠肺組織TGF-β1mRNA和蛋白的表達與較PQ中毒組明顯降低。上述結果表明，法舒地爾可以降低百草枯中毒大鼠肺組織TGF-β1的表達水平，改善百草枯致大鼠肺纖維化的嚴重程度，同時也提示Rho/Rho激酶信號通路可能參與了PQ致肺纖維化過程，但更為詳細的機制還有待于進一步研究。

［1］YamashitaM.Along-termfollow-upoflungfunctioninsurvivors of araquat poisoning.Hum Exp Toxicol，2000，19（2）:99

［2］ Varga J，Pasche B．Antitransforming growth factor-beta in fibrosis:recent progress and implications for systemic sclerosis．Curr Opin Rheumatol，2008，20（6）:720

［3］ Szapiel SV，Elson NA，Fulmer JD，et al．Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse．Am Rev RespDis，1979，120（4）:893

［4］Dinis-Oliveira RJ，Duate JA，Bastos ML，et al.Paraquat poisonings:Mechanisms of lung toxicity，clinical features，and treatment.Critical Review s in Toxicology，2008，38（1）:13

［5］Nakamura T，U shiyama C，Shimada N，et al.Changes in concent rations of type IV collagen and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in patients with paraquat poisoning.Appl To xicol，2001，21（6）:445

［6］Ihn H.Pathogenesis of fibrosis:role of TGF-beta and CTGF. Curr Opin Rheumatol，2002，14（6）:681

［7］Nathan N，Thouvenin G，Fauroux B，et a1．Interstitial lung disease:physiopathology in the context of lung growth. Paediatr Respir Rev，2011，12（4）:216

［8］黃敏，齊小娟，張平，等.結締組織生長因在百草枯致大鼠子及α-平滑肌肌動蛋白肺纖維化中的作用.中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2010，28（1）:728

［9］蔡后榮，戴令娟，鄭培德，等.肺纖維化大鼠肺組織轉化生長因子-β1和前膠原基因的表達.中華醫(yī)學雜志，2001，81 （4）:247

［10］王玉珍，姜慧卿，扈彩霞，等.法舒地爾通過Rho/ROCK信號通路抑制肝星狀細胞黏附、遷移和增殖.中華肝臟病雜志，2006，14（11）:821

［11］Nishikimi T，Koshikawa S，Ishikawa Y，et al.Inhibition of Rho-kinase attenuates nephrosclerosis and improves survival in salt-loaded spontaneously hypertensive stroke-prone rats.J Hypertens，2007，25（5）:1053

［12］Kagiyama S，Matsumura K，Goto K，et al.Role of Rho kinase and oxidative stress in cardiac fibrosis induced by aldosterone and salt in angiotensin type 1 a receptor knockoutmice. RegulPept，2010，160（1/3）:133

，E-mail：fangjjiang@sina.com

寧波市醫(yī)學科技計劃項目（2013A03）
*為