以“科學(xué)思維邏輯”組織“噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)”的教學(xué)建議

黃建華

(江蘇省南通大學(xué)附屬中學(xué) 226019)

1 考證“噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)”的科學(xué)思維邏輯

1952年，赫爾希(A.D.Hershey)和蔡斯(M.Chase)所做“噬菌體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)”是在前人研究的基礎(chǔ)上完成的。

1.1 噬菌體的早期研究為同位素標(biāo)記噬菌體提供了依據(jù) 英國(guó)人Twort和法國(guó)人D′Herelle分別于1915年和1917年發(fā)現(xiàn)一種能使細(xì)菌裂解的過(guò)濾因子，命名為噬菌體。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體是一種病毒，感染細(xì)菌后合成子代噬菌體的原料全部來(lái)自宿主細(xì)胞。另外，已知硫元素只存在于蛋白中，磷元素幾乎都存在于核酸中，這為赫爾希和和蔡斯用35S和32P分別標(biāo)記噬菌體的蛋白質(zhì)和核酸提供了依據(jù)。

1.2 T2噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的研究為噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)的時(shí)間控制提供了理論依據(jù) 德國(guó)人M·Delbrück(噬菌體學(xué)派創(chuàng)始人)測(cè)定了烈性噬菌體T2侵染細(xì)菌和成熟噬菌體釋放的時(shí)間間隔，繪制出每個(gè)被侵染細(xì)胞釋放噬菌體的生長(zhǎng)曲線(稱為T2噬菌體一步生長(zhǎng)曲線)，并于1939年發(fā)表“噬菌體的生長(zhǎng)”一文。T2噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線表明：T2噬菌體侵染細(xì)菌的潛伏期為20 min(潛伏期是指噬菌體感染細(xì)菌至細(xì)菌釋放子代噬菌體的一段時(shí)間)。這為赫爾希和蔡斯在實(shí)驗(yàn)中將噬菌體感染細(xì)菌、攪拌、離心的實(shí)驗(yàn)時(shí)間控制在20 min之內(nèi)提供了理論依據(jù)。

1.3 靜止噬菌體化學(xué)形態(tài)的研究推測(cè)噬菌體的增殖首先要除去保護(hù)性的外殼 美國(guó)人Anderson于1949年發(fā)現(xiàn)用水快速稀釋懸浮T2噬菌體的高濃度氯化鈉溶液，利用滲透壓的驟變可使噬菌體失活，在電子顯微鏡下可見(jiàn)這種失活的噬菌體呈蝌蚪形的“空殼”。1951年Herriott研究發(fā)現(xiàn)滲透壓驟變能使噬菌體的DNA釋放到溶液中，而“空殼”仍可以吸附到細(xì)菌上。這些研究推測(cè)噬菌體的增殖首先要除去保護(hù)性的外殼。

1.4 噬菌體吸附細(xì)菌后DNA對(duì)DNA酶變敏感，推測(cè)噬菌體吸附后DNA從外殼中排出 Graham和他的同事于1951年發(fā)現(xiàn)噬菌體吸附到加熱殺死的細(xì)菌上后，其DNA對(duì)DNA酶變敏感了；Benzer Dulbecco于1952年也發(fā)現(xiàn)在不引起生長(zhǎng)的緩沖液中，噬菌體吸附到細(xì)菌上后，其DNA變得對(duì)DNA酶敏感了。據(jù)此推測(cè)噬菌體吸附到細(xì)菌上以后，其DNA就從其保護(hù)性外殼中排出，由于失去外殼的保護(hù)，故其DNA對(duì)DNA酶變敏感。

1.5 噬菌體吸附到細(xì)菌碎片上后，其DNA可從外殼中釋放出來(lái) 在前人實(shí)驗(yàn)和推測(cè)的基礎(chǔ)之上，為了更好地驗(yàn)證噬菌體吸附細(xì)菌后DNA從外殼中排出，赫爾希和蔡斯用35S和32P標(biāo)記的噬菌體吸附細(xì)菌碎片(選擇吸附細(xì)菌碎片能更好的觀察到DNA釋放的結(jié)果)，在37℃保溫30 min，離心15 min，然后對(duì)沉淀和上清液分別進(jìn)行分析，其結(jié)果如表1[1]所示(用同位素的百分比來(lái)表示)。

表1 赫爾希和蔡斯同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

從35S標(biāo)記的噬菌體吸附細(xì)菌碎片的結(jié)果可知：①有87%的噬菌體分布在沉降部分中，說(shuō)明噬菌體的蛋白尾部吸附在細(xì)菌碎片上(因沒(méi)有搗碎攪拌)，其中16%是存活的噬菌體(表明噬菌體吸附細(xì)菌后有少部分仍保持活性)；②有13%的噬菌體(分布在上清液中)沒(méi)有吸附到細(xì)菌碎片上，其中5%是存活的噬菌體。

從32P標(biāo)記的噬菌體吸附細(xì)菌碎片的結(jié)果可知：①有55%的總噬菌體DNA隨細(xì)菌碎片沉降到底部，其中22%是存活的噬菌體；29%對(duì)DNA酶敏感(能被DNA酶分解)，說(shuō)明這部分噬菌體吸附細(xì)菌后釋放出DNA并失活；酸溶性同位素占2%，說(shuō)明其未釋放DNA；②有45%的總噬菌體DNA分布在上清液中，其中5%存在于存活的噬菌體中；剩下的約40% DNA基本都對(duì)DNA酶敏感(39%能被DNA酶分解)。

上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明，噬菌體的蛋白尾部起吸附作用；噬菌體吸附細(xì)菌后，大部分釋放DNA并失活；小部分不失活；還有些失活，但不釋放DNA。

1.6 攪拌可從受侵染的細(xì)菌上去掉噬菌體外殼 1951年，Anderson通過(guò)電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)T2噬菌體是靠它的尾部吸附到細(xì)菌上去的。假定這種吸附不穩(wěn)定，攪拌應(yīng)該能將吸附在菌體上的噬菌體脫落下來(lái)。赫爾希和蔡斯用35S和32P標(biāo)記的噬菌體在吸附培養(yǎng)基中侵染細(xì)菌，離心除去未吸附的噬菌體，然后將菌體放在一定的溶液(MgSO41 mM；CaCl20.1 mM；明膠 0.1 g；水 1000 mL)中，在waring搗碎器中攪拌，每隔60 s取樣，用抗噬菌體血清進(jìn)行滴定，測(cè)出細(xì)菌產(chǎn)生的噬菌體數(shù)目，并離心測(cè)定同位素的比例及受侵染細(xì)菌的存活曲線[1](圖1)。

圖1 攪拌中測(cè)定的同位素比例及受侵染細(xì)菌的存活曲線

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：在不攪拌的情況下，就有部分35S和32P自發(fā)脫落下來(lái)；而攪拌可以把75%左右的35S剝落下來(lái)；在這些硫釋放的同時(shí)，只有35%左右的噬菌體32P釋放出來(lái)。赫爾希和蔡斯還做了高侵染倍數(shù)實(shí)驗(yàn)(增加噬菌體的感染量做重復(fù)實(shí)驗(yàn))，發(fā)現(xiàn)高侵染倍數(shù)對(duì)32P的自發(fā)釋放影響不大，卻大大提高35S的自發(fā)釋放。這表明，噬菌體在侵染細(xì)菌的過(guò)程中，其所含的硫(蛋白質(zhì))大部分留在細(xì)菌的表面；所含的磷(DNA)大部分在吸附細(xì)菌后很快進(jìn)入細(xì)胞。

1.7 硫和磷從親代噬菌體向子代噬菌體的傳遞說(shuō)明含硫蛋白質(zhì)在噬菌體增殖中不起作用，而DNA起作用 赫爾希和蔡斯用放射性35S標(biāo)記的噬菌體侵染細(xì)菌，產(chǎn)生的子代噬菌體中所含的放射性，還不到親本的1%(可能是吸附在細(xì)菌表面存活的親代噬菌體中標(biāo)記的硫)；用32P標(biāo)記的噬菌體侵染細(xì)菌，所產(chǎn)生的子代噬菌體所含的放射性達(dá)到親本的30%以上。1952年，Watson和Maalos研究發(fā)現(xiàn)：侵染性噬菌體DNA中的磷和腺嘌呤以相當(dāng)大的量而且同等程度傳遞給子代噬菌體。所以赫爾希和蔡斯推斷：含硫蛋白質(zhì)在噬菌體增殖中不起作用，起作用的是DNA。

1.8 赫爾希和蔡斯當(dāng)時(shí)留下的討論問(wèn)題 赫爾希和蔡斯在發(fā)表的論文“噬菌體生長(zhǎng)過(guò)程中蛋白質(zhì)和核酸各自的功能”中，討論部分明確提出未弄清楚的問(wèn)題：除了DNA之外，噬菌體還有沒(méi)有其他種類的非硫的物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞？假如有，那么它能傳遞給子代噬菌體嗎？磷傳給子代是直接的還是間接的？[2]

從上可知，赫爾希和蔡斯在前人研究的基礎(chǔ)之上，設(shè)計(jì)了“噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)”，逐步深入研究噬菌體生長(zhǎng)過(guò)程中蛋白質(zhì)和核酸各自的功能，其結(jié)論是蛋白質(zhì)擔(dān)負(fù)著使噬菌體吸附到細(xì)菌上并使DNA注入細(xì)胞的責(zé)任，對(duì)胞內(nèi)噬菌體的增殖沒(méi)有作用，而是DNA在起作用。

2 合理處理“噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)”的教學(xué)建議

2.1 完善教材中的實(shí)驗(yàn)步驟，尊重科學(xué)探究史實(shí) 高中生物學(xué)教材中介紹“噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)”的步驟為：標(biāo)記→侵染→攪拌→離心→檢測(cè)。建議根據(jù)科學(xué)史實(shí)將步驟完善為：標(biāo)記→侵染→離心→培養(yǎng)→攪拌→離心→檢測(cè)，侵染后離心的目的是去除未吸附的噬菌體，排除未吸附的噬菌體對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。完善實(shí)驗(yàn)步驟一方面尊重科學(xué)探究史實(shí)；另一方面利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確分析。

2.2 準(zhǔn)確分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，校正現(xiàn)行分析偏差35S標(biāo)記噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)中,離心后沉淀物中也有較弱放射性原因的分析，一些資料、試題認(rèn)為是攪拌不徹底，部分吸附的噬菌體外殼未脫落下來(lái)導(dǎo)致的。其實(shí)不是攪拌不徹底，而是在保證細(xì)菌結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的前提下，攪拌不可能將吸附在細(xì)菌表面的噬菌體全部剝落下來(lái)(大約剝落75%)，導(dǎo)致部分吸附在細(xì)菌表面的噬菌體外殼隨細(xì)菌沉降，使沉淀物中也有較弱的放射性。

32P標(biāo)記噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)中,離心后上清液中也有較弱放射性原因的分析，一些資料、試題認(rèn)為是培養(yǎng)時(shí)間控制不當(dāng)導(dǎo)致的，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致一些噬菌體還沒(méi)有吸附細(xì)菌，就離心到上清液中；或培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)菌裂解釋放的子代噬菌體處于上清液中，這樣的解釋是不科學(xué)的。赫爾希和蔡斯實(shí)驗(yàn)的實(shí)際步驟是：標(biāo)記→侵染→離心→培養(yǎng)→攪拌→離心→檢測(cè)。侵染后離心的目的就是去除未吸附的噬菌體，所以上清液中的放射性不是未吸附細(xì)菌的噬菌體攜帶的。在噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的基礎(chǔ)上，赫爾希和蔡斯嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)時(shí)間在20 min內(nèi)。離心前細(xì)菌處于潛伏期，尚未裂解。

所以，上清液中的放射性也不是細(xì)菌裂解后釋放的子代噬菌體攜帶的，而是吸附細(xì)菌后自發(fā)脫落的完整噬菌體(未注入DNA)所攜帶的。

2.3 牢牢抓住證據(jù)力點(diǎn)，理清實(shí)驗(yàn)遞進(jìn)關(guān)系 1944年艾弗里就已證明DNA是使R型細(xì)菌轉(zhuǎn)化為S菌的轉(zhuǎn)化因子，即DNA控制細(xì)菌莢膜的形成，證明了DNA能控制生物性狀，從而證明DNA是S菌的遺傳物質(zhì)?！笆删w侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)”證明親代DNA能傳給子代，在“格里菲斯體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)”的基礎(chǔ)上，證明了DNA在親子間的傳遞性，成為DNA是遺傳物質(zhì)的更有力證據(jù)。赫爾希和蔡斯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，細(xì)菌裂解釋放的子代噬菌體顯示，32P標(biāo)記的一組實(shí)驗(yàn)中可以檢測(cè)到32P標(biāo)記的DNA，35S標(biāo)記的一組實(shí)驗(yàn)中卻不能檢測(cè)到35S標(biāo)記的蛋白質(zhì)，正說(shuō)明噬菌體DNA在親子代間的可傳遞性，是證明DNA是遺傳物質(zhì)的更有力證據(jù)的力點(diǎn)，也是“噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)”和“格里菲斯體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)”呈遞進(jìn)關(guān)系的承接點(diǎn)，分析時(shí)一定要牢牢抓住。