α7煙堿型乙酰膽堿受體基因敲除對(duì)非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝臟炎癥的影響研究

李富強(qiáng)，吳小翠，徐麗娜，陳小梅，唐翠蘭

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·論著·

α7煙堿型乙酰膽堿受體基因敲除對(duì)非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝臟炎癥的影響研究

李富強(qiáng)，吳小翠，徐麗娜，陳小梅，唐翠蘭

目的探討α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)基因敲除對(duì)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠肝臟炎癥的影響。方法2014年6月—2015年5月，選取40只SPF級(jí)雄性6周齡C57BL/6J小鼠和40只SPF級(jí)雄性6周齡α7nAChR基因敲除小鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為C57普通飼料組、C57高脂高糖組、基因敲除普通飼料組、基因敲除高脂高糖組，每組20只。C57普通飼料組、基因敲除普通飼料組小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)飲用20%果糖飲用水，喂養(yǎng)24周,建立NASH小鼠模型；小鼠飼養(yǎng)期間定期稱量體質(zhì)量，并且尾靜脈取血檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)水平。21周時(shí) C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠給予400 μg/kg煙堿腹腔注射；C57普通飼料組、基因敲除普通飼料組小鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射,均1次/d，共3周。24周后處死小鼠，眼球取血，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)血清炎性細(xì)胞因子白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平，觀察小鼠肝臟外觀變化及肝臟濕重，肝臟病理切片染色觀察炎癥程度和脂肪變性情況。結(jié)果第12、15、18、21、24周時(shí)，C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠體質(zhì)量較C57普通飼料組、基因敲除普通飼料組升高(P<0.05)；第12、15、18、21、24周時(shí)，基因敲除高脂高糖組小鼠體質(zhì)量較C57高脂高糖組升高(P<0.05)。C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠第8、16、24周時(shí)血清ALT、AST、TG、TC水平，第24周時(shí)血清IL-6、TNF-α水平、肝臟濕重較C57普通飼料組、基因敲除普通飼料組升高(P<0.05)；基因敲除高脂高糖組小鼠第8、16、24周時(shí)血清ALT、AST水平，第16、24周時(shí)血清TG、TC水平，第24周時(shí)血清IL-6、TNF-α水平、肝臟濕重較C57高脂高糖組升高(P<0.05)。病理切片蘇木素-伊紅(HE)、油紅染色結(jié)果顯示：C57普通飼料組、基因敲除普通飼料組小鼠炎癥程度和脂肪變性均不明顯，C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠在第8周開始出現(xiàn)輕微炎癥和脂肪變性，以小脂滴為主，到第16、24周，炎癥和脂肪變性逐漸加重，脂肪變性以中、大滴為主，基因敲除高脂高糖組小鼠肝臟組織炎癥程度和脂肪變性均明顯重于C57高脂高糖組小鼠。結(jié)論α7nAChR基因敲除能夠明顯加重NASH小鼠的肝臟炎癥。

非酒精性脂肪性肝炎；基因敲除技術(shù)；α7煙堿型乙酰膽堿受體；細(xì)胞因子類；炎癥

李富強(qiáng)，吳小翠，徐麗娜，等.α7煙堿型乙酰膽堿受體基因敲除對(duì)非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝臟炎癥的影響研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(23)：2802-2809.[www.chinagp.net]

LI F Q，WU X C，XU L N，et al.Effect of α7nAChR gene knockout on the liver inflammation of non-alcoholic steatohepatitis mice[J].Chinese General Practice，2016，19(23)：2802-2809.

非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的一種類型，表現(xiàn)為肝脂肪變性與肝損傷、炎癥共存。NASH是NAFLD發(fā)展的關(guān)鍵點(diǎn)，因?yàn)镹ASH不但發(fā)生肝硬化、甚至肝癌的風(fēng)險(xiǎn)高，而且伴有較高的心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)[1]。NASH發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前還沒有任何一種藥物推薦專用于治療NASH[2]，因而NASH的有效治療顯得尤為重要。近年來研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎性反應(yīng)在NASH的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[3]。多種炎性細(xì)胞因子參與NASH的炎性反應(yīng)，如果能找到一種新的治療靶位可以同時(shí)抑制多種炎性細(xì)胞因子，將會(huì)對(duì)NASH的治療起非常重要的作用。膽堿能抗炎通路是近10年來研究較為熱點(diǎn)的神經(jīng)抗炎通路[4]，被認(rèn)為是體內(nèi)有效且無不良反應(yīng)的神經(jīng)抗炎通路[5],可以抑制多重炎性細(xì)胞因子如白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產(chǎn)生。本課題組前期的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)外活化膽堿能抗炎通路可以抑制NASH肝臟的炎癥[6]，為了進(jìn)一步明確α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)基因?qū)ASH的抑制作用，本研究通過模擬NASH患者高脂肪、高果糖飲料的飲食習(xí)慣建立C57BL/6J小鼠NASH模型[7]和α7nAChR基因敲除小鼠NASH模型，系統(tǒng)研究α7nAChR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路失活對(duì)NASH小鼠肝臟炎癥的作用及其分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物2014年6月—2015年5月，選取SPF級(jí)雄性4周齡C57BL/6J小鼠40只(購于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所)，SPF級(jí)雄性4周齡α7nAChR基因敲除小鼠40只(親代鼠購于美國Jackson實(shí)驗(yàn)室，其余小鼠為親代小鼠繁育而得)，室內(nèi)飼養(yǎng)，室溫22～25 ℃，自由攝水和食物。

1.2材料與試劑普通飼料購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，高脂飼料(普通飼料78.0%，豬油10.0%，奶粉5.0%，蛋黃粉5.0%，膽固醇1.5%，膽酸鈉0.5%)購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，果糖購于美國Amerisco公司，煙堿購于美國sigma公司，小鼠IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購于深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，蘇木素-伊紅(HE)染色、油紅染色試劑盒購自武漢百浩天生物科技有限公司。

1.3造模小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)至6周齡后，C57BL/6J小鼠和α7nAChR基因敲除小鼠分別采用隨機(jī)數(shù)字表法分為C57普通飼料組、C57高脂高糖組、基因敲除普通飼料組、基因敲除高脂高糖組，每組20只。C57普通飼料組、基因敲除普通飼料組小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)飲用20%果糖飲用水(3次/周更換凈水)。第6、9、12、15、18、21、24周觀察各組小鼠的飲食變化并且稱量體質(zhì)量。21周時(shí)C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠給予400 μg/kg煙堿腹腔注射，C57普通飼料組、基因敲除普通飼料組小鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射,1次/d，共3周。

1.4血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)第8、16、24周，每組采用隨機(jī)數(shù)字表法取5只小鼠，放于固定器中，尾巴向下露出，浸入40～45 ℃水浴鍋中30 s，剪掉少許尾巴取靜脈血0.5 ml于離心管中，室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min(離心半徑6 cm)，取上清液，使用日立7180生化分析儀檢測(cè)小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)水平。第24周時(shí)處死小鼠，眼球取血1 ml，使用ELISA試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平。

1.5組織學(xué)檢測(cè)第8、16、24周，每組5只小鼠禁食16 h后處死，統(tǒng)一取肝左葉，石蠟切片進(jìn)行HE染色，冷凍切片進(jìn)行油紅染色，觀察各組小鼠肝組織炎癥活動(dòng)度及脂肪變性的程度。24周處死小鼠時(shí)觀察小鼠肝臟的外觀變化及肝臟濕重。

2　結(jié)果

2.14組小鼠不同時(shí)間體質(zhì)量比較第6、9周時(shí)，4組小鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第12、15、18、21、24周時(shí)，4組小鼠體質(zhì)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，第12、15、18、21、24周時(shí)，C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠體質(zhì)量較C57普通飼料組、基因敲除普通飼料組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第12、15、18、21、24周時(shí)，基因敲除高脂高糖組小鼠體質(zhì)量較C57高脂高糖組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第12、15、18、21、24周時(shí)，C57普通飼料組與基因敲除普通飼料組小鼠體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.24組小鼠不同時(shí)間血清ALT、AST水平比較第8、16、24周時(shí)，4組小鼠血清ALT、AST水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠血清ALT、AST水平較C57普通飼料組、基因敲除普通飼料組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；基因敲除高脂高糖組小鼠血清ALT、AST水平較C57高脂高糖組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C57普通飼料組與基因敲除普通飼料組小鼠血清ALT、AST水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.34組小鼠不同時(shí)間血清TG、TC水平比較第8、16、24周時(shí)，4組小鼠血清TG、TC水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，第8、16、24周時(shí)，C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠血清TG、TC水平較C57普通飼料組、基因敲除普通飼料組升高，

本文研究背景：

隨著對(duì)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的深入研究，發(fā)現(xiàn)NASH是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的一種較嚴(yán)重的病理類型，不同于一般類型的脂肪肝，NASH是一種可以進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等終末期肝病的疾病，因而已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注。目前還沒有任何一種藥物推薦專用于治療NASH。另外NASH發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，因此深入了解其發(fā)病機(jī)制，尋找NASH新的治療靶位具有重要意義。慢性炎性反應(yīng)在NASH的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，目前的研究多集中于免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)中的作用，即使有少數(shù)抗炎治療的實(shí)驗(yàn)研究，也主要集中于阻斷單個(gè)細(xì)胞因子，比如腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體，但NASH的炎性反應(yīng)是由多種細(xì)胞因子參與的，所以針對(duì)單個(gè)細(xì)胞因子抗體的治療效果不理想，目前迫切需要找到一個(gè)能同時(shí)抑制多種炎性細(xì)胞因子的治療靶位。膽堿能抗炎通路是機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)控最重要的抗炎機(jī)制之一，α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)是膽堿能神經(jīng)與免疫系統(tǒng)之間吻合的分子之一。傳出迷走神經(jīng)釋放乙酰膽堿(Ach)與肝、心、脾和胃腸道中巨噬細(xì)胞煙堿型乙酰膽堿(nACh)的α7亞基相互作用，抑制TNF-α、白介素1(IL-1)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)等炎性細(xì)胞因子的大量釋放，這一生理學(xué)抗炎機(jī)制可以作為膽堿能通路拮抗肝臟炎癥作用的靶位。膽堿能抗炎通路主要通過活化巨噬細(xì)胞表面的α7nAChR發(fā)揮作用，其可以同時(shí)抑制多種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，比靶向單一炎性細(xì)胞因子的治療措施更具優(yōu)勢(shì)，因其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的療效顯著，甚至已經(jīng)提出把α7nAChR作為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的靶分子。但該通路在慢性炎性疾病NASH中是否發(fā)揮抗炎作用及其作用機(jī)制，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道?；谏鲜鲅芯勘尘?，本研究推測(cè)活化α7nAChR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路能減輕NASH的炎性反應(yīng)。

差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第16、24周時(shí)，基因敲除高脂高糖組小鼠血清TG、TC水平較C57高脂高糖組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第8、16、24周時(shí)，C57普通飼料組與基因敲除普通飼料組小鼠血清TG、TC水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第8周時(shí)，C57高脂高糖組與基因敲除高脂高糖組小鼠血清TG、TC水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

表1　4組小鼠不同時(shí)間體質(zhì)量比較±s，g)

注：與C57普通飼料組比較，aP<0.05；與C57高脂高糖組比較，bP<0.05；與基因敲除普通飼料組比較，cP<0.05

表2　4組小鼠不同時(shí)間血清ALT、AST水平比較

注：ALT=丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST=天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；與C57普通飼料組比較，aP<0.05；與C57高脂高糖組比較，bP<0.05；與基因敲除普通飼料組比較，cP<0.05

表3　4組小鼠不同時(shí)間血清TG、TC水平比較

注：TG=三酰甘油，TC=總膽固醇；與C57普通飼料組比較，aP<0.05；與C57高脂高糖組比較，bP<0.05；與基因敲除普通飼料組比較，cP<0.05

2.44組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較第24周時(shí)，4組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠血清IL-6、TNF-α水平較C57普通飼料組和基因敲除普通飼料組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；基因敲除高脂高糖組小鼠血清IL-6、TNF-α水平較C57高脂高糖組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C57普通飼料組與基因敲除普通飼料組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表4)。

Table 4Comparison of serum IL-6 and TNF-α levels among the four groups in week 24

組別只數(shù)IL-6TNF-αC57普通飼料組516.0±1.722.8±1.5C57高脂高糖組531.1±1.8a50.1±3.5a基因敲除普通飼料組516.9±1.9b24.1±1.6b基因敲除高脂高糖組537.0±3.0abc58.1±6.7abcF值93.1784.34P值<0.001<0.001

注：IL-6=白介素6，TNF-α=腫瘤壞死因子α；與C57普通飼料組比較，aP<0.05；與C57高脂高糖組比較，bP<0.05；與基因敲除普通飼料組比較，cP<0.05

2.54組小鼠肝臟外觀變化和肝臟濕重比較第24周時(shí)，C57普通飼料組和基因敲除普通飼料組小鼠肝臟顏色均為暗紅色，C57高脂高糖組和基因敲除高脂高糖組小鼠肝臟顏色均變黃，基因敲除高脂高糖組小鼠肝臟顏色變化更明顯(見圖1，本文圖1～3彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。4組小鼠肝臟濕重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠肝臟濕重較C57普通飼料組和基因敲除普通飼料組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；基因敲除高脂高糖組小鼠肝臟濕重較C57高脂高糖組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C57普通飼料組與基因敲除普通飼料組小鼠肝臟濕重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表5)。

表5　4組小鼠24周時(shí)肝臟濕重比較±s，g)

注：與C57普通飼料組比較，aP<0.05；與C57高脂高糖組比較，bP<0.05；與基因敲除普通飼料組比較，cP<0.05

圖14組小鼠24周時(shí)肝臟顏色

Figure 1Mice liver color of the four groups in week 24

2.64組小鼠肝臟組織病理檢查結(jié)果病理切片HE、油紅染色結(jié)果顯示：C57普通飼料組、基因敲除普通飼料組小鼠炎癥程度和脂肪變性均不明顯，C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠在第8周開始出現(xiàn)輕微炎癥和脂肪變性，以小脂滴為主，到第16、24周，炎癥和脂肪變性逐漸加重，脂肪變性以中、大滴為主，基因敲除高脂高糖組小鼠肝臟組織炎癥程度和脂肪變性均明顯重于C57高脂高糖組小鼠(見圖2、3)。

圖24組小鼠不同時(shí)間肝臟組織病理(HE染色，×20)

Figure 2HE staining of mice liver tissue of the four groups at different time points

圖3　4組小鼠不同時(shí)間肝臟組織病理(油紅染色，×20)

3　討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，免疫功能紊亂在NASH的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，來源于肝臟巨噬細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子對(duì)NASH的發(fā)生、發(fā)展起重要作用[8]。巨噬細(xì)胞是參與膽堿能抗炎通路的主要靶細(xì)胞，巨噬細(xì)胞表面的α7nAChR是膽堿能抗炎通路發(fā)揮抗炎作用的效應(yīng)器。Kupffer細(xì)胞在NASH的慢性炎性反應(yīng)中起重要作用，巨噬細(xì)胞失活后可以阻斷NASH大鼠肝脂肪變性和炎癥的發(fā)展[9]。

目前已有的嚙齒類動(dòng)物模型大致可以分為兩類：第一類為飲食或藥物控制模型，第二類為轉(zhuǎn)基因模型。常用的是飲食或藥物控制模型，主要是增加遞送到肝臟的脂肪酸的高脂飲食模型。高脂飲食后，大量乳糜微粒輸送入肝，在溶酶體分解產(chǎn)生大量游離脂肪酸，這些飲食來源的大量脂肪酸導(dǎo)致脂肪變性、糖尿病和肥胖[10]。有研究對(duì)C57BL/6J小鼠長期給予高脂飲食，這些小鼠出現(xiàn)了肥胖、高胰島素血癥、高血糖、高血壓[11]，并且出現(xiàn)糖耐量受損和脂肪性肝炎[12]。TETRI等[13]將果糖和高脂飲食結(jié)合喂養(yǎng)小鼠，出現(xiàn)了嚴(yán)重肥胖、糖耐量異常、高胰島素血癥以及大量的肝細(xì)胞脂肪變性和壞死性炎癥。這種模型的優(yōu)勢(shì)在于產(chǎn)生類似的NASH特性的過程均為生理過程，但其纖維化少見甚至不出現(xiàn)肝細(xì)胞癌。通過總結(jié)各種動(dòng)物模型的優(yōu)勢(shì)和不足及本實(shí)驗(yàn)的特定需求，本研究選擇高脂飼料(普通飼料78.0%，豬油10.0%，奶粉5.0%，蛋黃粉5.0%，膽固醇1.5%，膽酸鈉0.5%)加高果糖飲水(20%果糖飲用水)誘導(dǎo)的NASH小鼠模型。實(shí)驗(yàn)中定期監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量，觀察到隨時(shí)間的推移，C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠體質(zhì)量增加明顯；并對(duì)小鼠進(jìn)行血清生化分析、血脂、肝臟組織病理檢查，觀察到C57高脂高糖組、基因敲除高脂高糖組小鼠血清AST、ALT、TG、TC水平升高，肝臟組織從單純脂肪變性逐漸發(fā)展到脂肪性肝炎，較為完整的呈現(xiàn)了人類NASH的發(fā)生、發(fā)展過程，與李陽等[14]研究結(jié)果基本符合。因此，通過高脂飼料果糖飲用水誘導(dǎo)的NASH動(dòng)物模型為進(jìn)一步研究人類 NASH發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制有十分重要的價(jià)值。

膽堿能抗炎通路是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的一種神經(jīng)生理機(jī)制，主要通過乙酰膽堿與巨噬細(xì)胞及其他分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞上的α7nAChR相互作用，抑制促炎細(xì)胞因子的合成與釋放，防止組織損傷。有實(shí)驗(yàn)證明，膽堿能激動(dòng)劑對(duì)α7nAChR基因敲除小鼠來源的巨噬細(xì)胞的抗炎作用被取消[15]，并且α7nAChR基因敲除小鼠內(nèi)毒素血癥易患性更高[16]，相當(dāng)于外科的迷走神經(jīng)切斷術(shù)，也就說明這種由激活迷走神經(jīng)引起的生理性抗炎機(jī)制與α7nAChR密切有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，通過基因敲除技術(shù)定向敲除α7nAChR基因，可導(dǎo)致小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎病情惡化[17]。給予心肌缺血再灌注模型大鼠α7nAChR短發(fā)夾 RNA(shRNA)[18]處理，給予內(nèi)毒素脂多糖(LPS)敗血癥模型小鼠α-銀環(huán)蛇毒素(α7nAChR拮抗劑)處理或行迷走神經(jīng)切斷術(shù)[19]，均能抑制迷走神經(jīng)刺激誘發(fā)的膽堿能抗炎通路作用。野生型小鼠迷走神經(jīng)興奮的抗炎效應(yīng)正常，而α7nAChR基因缺失小鼠則不能正常工作。體外研究中發(fā)現(xiàn)，煙堿受體激動(dòng)劑抑制野生型小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α的表達(dá)，而不抑制α7nAChR基因敲除小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α的表達(dá)[20-21]?；谂R床敗血癥患者的初步研究結(jié)果提示，外周血單核細(xì)胞α7nAChR mRNA表達(dá)水平是敗血癥患者膽堿能抗炎通路激活的臨床相關(guān)性標(biāo)志，α7nAChR mRNA表達(dá)水平越高，患者的炎癥控制和預(yù)后越好[22]。

上述相關(guān)研究提到α7nAChR基因敲除能夠加重炎性反應(yīng)程度，本課題組前期研究證實(shí)，小鼠肝臟巨噬細(xì)胞上存在α7nAChR，給予煙堿活化α7nAChR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路，小鼠肝組織炎癥程度下降，血清中TNF-α水平下降[23]。因此本研究采用C57BL/6J小鼠和α7nAChR基因敲除小鼠構(gòu)建NASH模型，給予煙堿腹腔注射活化膽堿能抗炎通路，觀察α7nAChR基因敲除對(duì)NASH小鼠肝臟炎癥的影響。

本研究結(jié)果顯示，基因敲除高脂高糖組小鼠肝臟炎癥程度和脂肪變性較C57高脂高糖組嚴(yán)重，基因敲除高脂高糖組小鼠血清肝功能指標(biāo)ALT、AST水平、血脂TG、TC水平、炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α水平均高于C57高脂高糖組，基因敲除高脂高糖組小鼠體質(zhì)量以及肝臟濕重也較C57高脂高糖組有所增加，提示α7nAChR基因敲除NASH小鼠肝臟炎癥程度加重。給予煙堿腹腔注射后，C57高脂高糖組小鼠肝臟巨噬細(xì)胞表面α7nAChR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路被激活，有效地抑制了NASH小鼠的肝臟炎癥。然而，基因敲除高脂高糖組小鼠的α7nAChR基因無法被活化，膽堿能抗炎通路無法發(fā)揮其抗炎作用，小鼠肝臟的炎癥程度加重。這與上述α7nAChRA基因敲除加重炎性反應(yīng)的研究結(jié)果基本一致[10-22]，也為進(jìn)一步在細(xì)胞分子水平研究α7nAChR基因?qū)ASH炎性反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)和理論依據(jù)，對(duì)NASH的發(fā)病以及治療具有重要意義。α7nAChR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路抑制NASH小鼠肝臟炎癥，其具體的機(jī)制可能為膽堿能抗炎通路被激活后，刺激迷走神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿(ACh)，與巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞上表達(dá)的α7nAChR結(jié)合，作用于下游JAK2/信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核因子(NF)-кB等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制TNF-α、白介素1(IL-1)、IL-6等炎性細(xì)胞因子，從而發(fā)揮抗炎作用[24-25]。α7nAChR與Toll樣受體4(TLR-4)均表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面，α7nAChR介導(dǎo)的抗炎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與TLR-4 介導(dǎo)的致炎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均通過NF-κB和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，TLR-4介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化在NAFLD的炎性反應(yīng)中起重要作用，而α7nAChR體內(nèi)外活化膽堿能抗炎通路競(jìng)爭(zhēng)性抑制TLR-4介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化從而抑制NASH小鼠肝臟炎癥。

膽堿能抗炎通路還與改善心肌缺血后血管功能障礙[20]、過敏性哮喘[26]、慢性膀胱炎[27]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[28]、腦缺血再灌注損傷[29]、休克[30]、肥胖[31]、敗血癥[32]等諸多疾病的進(jìn)展密切相關(guān)。目前，關(guān)于這方面的研究還在繼續(xù)，但仍存在一些疑問。本研究中，小鼠造模完成后眼球取血時(shí)偶爾會(huì)出現(xiàn)溶血，對(duì)血清炎性細(xì)胞因子水平略有影響，需要采用更為便捷的小鼠眼眶靜脈取血。另外小鼠給予煙堿腹腔注射時(shí)死亡1只，尸檢發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔被穿破留有血跡，需進(jìn)一步提高穿刺技術(shù)。

本研究結(jié)果證實(shí)活化α7nAChR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路對(duì)NASH動(dòng)物模型肝臟炎癥起抑制作用，基因敲除后能夠加重肝臟炎癥程度，但是在細(xì)胞分子層面沒有更深入的研究，下一步計(jì)劃制備α7nAChR基因沉默細(xì)胞或者分離培養(yǎng)α7nAChR基因敲除小鼠原代肝臟巨噬細(xì)胞，采用LPS、煙堿處理上述細(xì)胞，通過炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化/阻斷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確α7nAChR抑制NASH炎性反應(yīng)的分子機(jī)制。另外本研究還未證實(shí)膽堿能抗炎通路是否對(duì)人類革蘭陽性菌所致的炎性反應(yīng)也能發(fā)揮抗炎效應(yīng)，下一步計(jì)劃進(jìn)一步闡明膽堿能抗炎機(jī)制，為臨床患者帶來更多的益處。煙堿是α7nAChR激動(dòng)劑，可以降低炎癥，但是對(duì)血壓、呼吸、心率有一定的抑制作用[33]，有待于開發(fā)特異性更高的激動(dòng)劑。

作者貢獻(xiàn)：李富強(qiáng)、陳小梅負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、論文撰寫、細(xì)胞因子檢測(cè)；吳小翠、徐麗娜負(fù)責(zé)小鼠造模、取血、血生化檢測(cè)、病理切片染色；唐翠蘭負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Effect of α7nAChR Gene Knockout on the Liver Inflammation of Non-alcoholic Steatohepatitis Mice

LIFu-qiang，WUXiao-cui，XULi-na，CHENXiao-mei,TANGCui-lan.

DepartmentofInfectiousDisease，theSecondHospitalAffiliatedtoZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310005，China

TANGCui-lan,DepartmentofInfectiousDisease，theSecondHospitalAffiliatedtoZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310005，China；E-mail:953806044@qq.com

ObjectiveTo investigate the effect of α7nAChR gene knockout on the liver inflammation of non-alcoholic steatohepatitis(NASH) mice.MethodsFrom June 2014 to May 2015，40 SPF male 6-week-old C57BL/6J mice and 40 SPF male 6-week-old α7nAChR gene knockout mice were selected.The mice were divided into C57 mice normal diet group(group 1)，C57 mice high fat and fructose diet group(group 2)，gene knockout mice normal diet group(group 3)，gene knockout mice high fat and fructose diet group(group 4)，with 20 rats in each group.Group 1 and group 3 were fed up with either normal feed，group 2 and group 4 were fed up with high-fat feed plus 20% fructose drinking water，24 weeks to generate an NASH model.The body weight of the mice during the feeding period was measured on a regular basis，and blood was sampled from the caudal vein to detect the levels of ALT，AST，TG and TC.In week 21，group 2 and group 4 were given 400 μg/kg nicotine by intraperitoneal injection，and group 1 and group 3 were given the same volume of 0.9% sodium chloride solution by intraperitoneal injection for one time per day for 3 weeks.24 weeks later，the mice were killed.Blood was sampled from eyeball to detect the levels of IL-6 and TNF-α by ELISA method，the changes of color and liver wet weight were recorded,and liver pathological section staining was conducted to observe inflammation degree and fatty degeneration.ResultsIn week 12，15，18，21 and 24，group 2 and group 4 were higher than group 1 and group 3 in body weight(P<0.05).In week 12，15，18，21 and 24，group 4 was higher than group 2 in body weight(P<0.05).Group 2 and group 4 had higher ALT，AST，TG and TC levels in week 8，16 and 24 and higher IL-6 and TNF-α levels and higher liver wet weight in week 24 than group 1 and group 3(P<0.05);group 4 had higher ALT and AST levels in week 8，16 and 24，higher TG and TC levels in week 16 and 24，higher IL-6 and TNF-α levels and higher liver wet weight in week 24 than group 2(P<0.05).The pathological section of HE and oil red staining showed that group 1 and group 3 had no obvious inflammation degree and fatty degeneration，and group 2 and group 4 showed slight inflammation and fatty degeneration which was mainly manifested as small fat drops in week 8 and showed severer inflammation and fatty degeneration which featured medium or large small fat drops in week 16 and 24，and group 4 had severer inflammation degree and fatty degeneration than group 2.Conclusionα7nAChR gene knockout can significantly aggravate the liver inflammation in NASH mice.

Non-alcoholic steatohepatitis；Gene knockout techniques；α7nAChR；Cytokines;Inflammation

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81100279)；浙江省新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目(2015R410013)

310005浙江省杭州市，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染科

唐翠蘭，310005浙江省杭州市，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染科；E-mail:1747603542@qq.com

R 575.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.23.013

2015-11-16；

2016-05-26)