基于培養(yǎng)基優(yōu)化和保護(hù)劑篩選的直投式酸奶發(fā)酵劑的研制*

張鋒

（寶雞文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，陜西省植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 寶雞 721013）

油田化學(xué)

基于培養(yǎng)基優(yōu)化和保護(hù)劑篩選的直投式酸奶發(fā)酵劑的研制*

張鋒

（寶雞文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，陜西省植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 寶雞 721013）

利用正交試驗(yàn)確定了嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化，冷凍保護(hù)劑篩選實(shí)驗(yàn)的最佳條件。添加1.0%番茄汁+0.3%玉米漿+2.0%乳糖的優(yōu)化培養(yǎng)基具備良好生理特性，谷氨酸鈉與脫脂乳對(duì)菌種活性在冷凍過(guò)程中有明顯保護(hù)作用。在優(yōu)化工藝下，凍干后活菌數(shù)分別達(dá)到4.3×1011cfu·g-1和4.2×1011cfu·g-1；凍干粉復(fù)配成直投式發(fā)酵劑后具有良好的發(fā)酵特性，完全符合發(fā)酵高粘度酸奶用直投式發(fā)酵劑的要求。

凍干粉；直投式發(fā)酵劑；酸奶發(fā)酵

發(fā)酵酸奶由于其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和良好的保健功能，國(guó)內(nèi)消費(fèi)者對(duì)酸奶的認(rèn)識(shí)逐步提高，其產(chǎn)銷量亦呈迅猛增長(zhǎng)之勢(shì)。目前，我國(guó)發(fā)酵酸奶的生產(chǎn)過(guò)程中，一般采用繼代式酸奶菌種和直投式酸奶發(fā)酵劑（Direct-to-vat cultures，簡(jiǎn)稱DVS）。繼代式酸奶菌種方便、價(jià)廉，使得大小生產(chǎn)廠家均可自行調(diào)制，極大地?cái)U(kuò)充了酸奶生產(chǎn)領(lǐng)域，但在酸奶生產(chǎn)的進(jìn)一步集約化、規(guī)?；l(fā)展中，繼代式酸奶菌種的多次活化和擴(kuò)培的煩瑣工藝越來(lái)越不能滿足要求［1］。直投式酸奶發(fā)酵劑不需要經(jīng)過(guò)活化、擴(kuò)增而直接應(yīng)用于生產(chǎn)，郵寄儲(chǔ)藏方便、保質(zhì)期長(zhǎng)，接種量少，使得每批發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，也防止了菌種的退化和污染，大大提高了發(fā)酵酸奶制品工業(yè)的勞動(dòng)生產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量。因此，近年來(lái)越來(lái)越多的酸奶生產(chǎn)公司選擇直投式酸奶發(fā)酵劑用于生產(chǎn)［2］。

為了得到高活菌數(shù)并且具有良好發(fā)酵性能的發(fā)酵劑，本文從培養(yǎng)基優(yōu)化、冷凍干燥保護(hù)劑篩選關(guān)鍵技術(shù)方面入手，研究了適合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間，確定最佳的培養(yǎng)條件，并配制成具有良好發(fā)酵特性的直投式酸奶發(fā)酵劑。旨在生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)廉價(jià)、發(fā)酵特性與國(guó)外同類產(chǎn)品相近的直投式酸奶發(fā)酵劑，并優(yōu)化其工業(yè)化生產(chǎn)工藝。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1菌種

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus GF，文中以 GF表示） 嗜熱鏈球菌（Streptococcus. thermophilus BF，文中以BF表示）由寶雞圣豐乳業(yè)有限責(zé)任公司鑒定并提供。

1.2pH值測(cè)定

采用PHS-3C型酸度計(jì)。

1.3酸度測(cè)定［3］

在無(wú)菌條件下取出10mL酸奶于50mL小燒杯中，加入20mL蒸餾水，混勻后在其中加入1～3D酚酞試劑，用0.100mol·L-1NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至樣品呈粉紅色且30s不退去，讀出所用的NaOH的體積數(shù)，再乘以10，則此數(shù)值即為樣品的滴定酸度，以吉爾涅度（oT）表示。

1.4生長(zhǎng)曲線測(cè)定

為了得到GF和BF的生長(zhǎng)規(guī)律，按2%的接種量將GF和BF分別接種到其發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間取樣測(cè)OD和pH值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)作圖，得出生長(zhǎng)曲線。

1.5OD值測(cè)定

Cary-50型分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)下測(cè)定，當(dāng)OD超過(guò)0.7時(shí)作稀釋，控制稀釋倍數(shù)，使測(cè)得的OD值在0.4～0.7范圍內(nèi)，實(shí)際測(cè)得的OD值乘以稀釋倍數(shù)就是所得的OD值。

1.6菌落計(jì)數(shù)

BF和GF計(jì)數(shù)都采用傾注平板法計(jì)數(shù)，以MRS固體培養(yǎng)基，在37℃下厭氧恒溫培養(yǎng)48～72h，使用Scan100菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

1.7培養(yǎng)基優(yōu)化

以MRS培養(yǎng)基［4］為基礎(chǔ)，參考部分文獻(xiàn)研究結(jié)果，選取番茄汁、玉米漿、乳糖作為促生長(zhǎng)因子，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素，具體方案見(jiàn)表1，在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，活菌計(jì)數(shù)。

表1　培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案Tab.1　Experiment scheme of medium optimization

1.8保護(hù)劑篩選

取離心后收集的菌體0.5mL沉淀并作活菌計(jì)數(shù)，作為對(duì)照，同時(shí)對(duì)加入不同保護(hù)劑的菌種并經(jīng)過(guò)預(yù)凍和真空冷凍干燥的菌體測(cè)定活菌數(shù)，計(jì)算存活率，篩選最優(yōu)保護(hù)劑。不同保護(hù)劑正交實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表2。

表2　保護(hù)劑篩選實(shí)驗(yàn)方案Tab.2　Experiment scheme of protective agent screening

1.9酸奶發(fā)酵

11.5%全脂奶粉和6%的蔗糖，完全按酸奶生產(chǎn)工藝溶解均質(zhì)滅菌后，接種，在43℃恒溫發(fā)酵。

2　結(jié)果與討論

2.1培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

表3　GF/BF培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3　Orthogonal experiment results of the GF/BF culture medium composition optimization

由表3得出，對(duì)菌落數(shù)目影響因素的大小順序?yàn)榉阎居衩诐{＞乳糖。由活菌數(shù)結(jié)果結(jié)果可知，優(yōu)化最佳培養(yǎng)基成分為番茄汁1.0%+玉米漿0.3%+乳糖2.0%。在最優(yōu)培養(yǎng)基條件下，重復(fù)進(jìn)行了兩次驗(yàn)證試驗(yàn)，活菌計(jì)數(shù)平均為1.58×109cfu· mL-1，與表1數(shù)據(jù)相似。張?zhí)m威［5］等將脫脂乳分別與番茄汁和啤酒混合進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，對(duì)菌落數(shù)增值起到了明顯促進(jìn)作用。啤酒中含有豐富的氨基酸、維生素等酵母代謝必需物，有利于GF和BF增殖。但隨著啤酒含量超過(guò)5%，反而對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)出現(xiàn)較為明顯的抑制作用，這可能與酒精對(duì)細(xì)菌的作用有關(guān)。而單純添加番茄汁則可能會(huì)影響培養(yǎng)基pH值，進(jìn)而抑制BF增殖。劉丹［6］等則通過(guò)碳氮源及緩沖鹽篩選提高了菌種培養(yǎng)效果。而報(bào)道的專利［7］和文獻(xiàn)［8］則通過(guò)添加超濾濃縮乳或蛋白胨作為輔助營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)使菌落增值，菌數(shù)可達(dá)108cfu·mL-1，但不足之處在于培養(yǎng)基成本較高。而本研究的增殖培養(yǎng)基也能達(dá)到相同數(shù)量級(jí)的細(xì)菌增殖效果，相比較之下成本較低。

2.2保護(hù)劑篩選實(shí)驗(yàn)

表4　保護(hù)劑篩選正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4　Orthogonal experiment results of protective agent screening

由表4直觀分析得出，對(duì)活菌凍干后存活影響因素谷氨酸鈉＞脫脂乳＞海藻糖＞甘油＞吐溫80。KILARA A等將麥芽提取液、煉乳、乳清用于菌種冷凍干燥的保護(hù)劑，均得到了較好的效果。GRACIELA等則將多元醇引入添加脫脂乳的保護(hù)體系，結(jié)果證明聚乙二醇、甘油、果膠等多羥基物質(zhì)均能起到保護(hù)菌種活性的作用。這與該類物質(zhì)物質(zhì)與菌種蛋白形成氫鍵，從而保證其在冷凍過(guò)程中結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)。而谷氨酸鈉、吐溫80作為常規(guī)的冷凍干燥保護(hù)劑，在相關(guān)文獻(xiàn)中均有涉及［9］。但是不同保護(hù)劑對(duì)菌株的保護(hù)作用，只有對(duì)其進(jìn)行合理搭配才能起到最佳保護(hù)效果。如表4數(shù)據(jù)所示，上述保護(hù)劑之間存在一定程度相互抑制作用，同時(shí)添加不利于達(dá)到最佳保護(hù)效果，按照影響因素大小優(yōu)先考慮谷氨酸鈉與脫脂乳作為冷凍保護(hù)劑。

2.3最佳生長(zhǎng)曲線

將經(jīng)過(guò)活化的GF和BF，按2%的接種量接入優(yōu)化培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣分別測(cè)定發(fā)酵液OD值、pH值，得到GF和BF的生長(zhǎng)曲線。

圖1　GF和BF生長(zhǎng)時(shí)的OD變化情況Fig.1　OD changes in GF and BF growth

從圖1可以看出，GF和BF的發(fā)酵曲線十分相似。在0～4h時(shí)兩株菌的OD都沒(méi)多大變化，菌體生長(zhǎng)處與延滯期。4～12hOD值迅速上升處在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12h后OD增加趨緩，進(jìn)入菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定期。

圖2　GF和BF生長(zhǎng)時(shí)pH值變化情況Fig.2　pH changes in GF and BF growth

從圖2也可以看出這一趨勢(shì)。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期和穩(wěn)定期前期的菌種保存活力最高［10］。所以我們選擇12、14h作為菌體培養(yǎng)的收獲期，作凍干試驗(yàn)。根據(jù)前期試驗(yàn)，我們選用已經(jīng)成熟的菌體收集工藝、凍干保護(hù)劑配方和凍干工藝。兩株菌在培養(yǎng)12、14h后分別離心收集菌體，添加保護(hù)劑，凍干，測(cè)定活菌數(shù)得到表5的數(shù)據(jù)。

表5　GF和BF在培養(yǎng)12、14h后收集后的凍干情況（1000mL發(fā)酵液）Tab.5　Freeze dry conditions of GF and BF collection after 12 and 14h culture（1000mL fermentation broth）

從表5可以看出，在不同收獲點(diǎn)兩株菌的菌粉得率和活菌數(shù)都有較大差異，GF在培養(yǎng)12和14h后收獲的菌粉分別達(dá)到1.12和2.19g·L-1，得率差距比較大，但活菌數(shù)沒(méi)有數(shù)量級(jí)上的差別。BF在培養(yǎng)12、14h后收獲的菌粉分別達(dá)到4.99和4.85g·L-1，菌粉得率差別不大，而且活菌數(shù)差別也不大。

將所得到的GF和BF菌粉添加保護(hù)劑后復(fù)配制成直投式發(fā)酵劑，發(fā)酵牛奶，3.5h時(shí)已經(jīng)全部凝乳，4h時(shí)終止發(fā)酵，測(cè)定酸度，放入6℃冰箱后酵。結(jié)果見(jiàn)表6

表6　不同時(shí)間段收獲得到的凍干粉配制的發(fā)酵劑的發(fā)酵性能Tab.6　Fermentation capability of Leavening agents prepared by freeze dried powder obtained at different time periods

從表6可以看出，14h收獲的菌體制成發(fā)酵劑后的性能明顯優(yōu)于12h收獲的菌體制成的發(fā)酵劑。而同一時(shí)間段收獲的菌體制成的發(fā)酵劑，在菌種比例不同時(shí)發(fā)酵性能也不相同。我們選擇14h收獲的菌體來(lái)制成菌粉，按活菌數(shù)1∶1比例再添加適量保護(hù)劑后配制成發(fā)酵劑。

按上述工藝500L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)菌粉，將菌粉復(fù)配（暫命名為FJJ）后發(fā)酵酸奶，以目前市場(chǎng)上兩家公司的兩款主流發(fā)酵劑做對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　復(fù)配后發(fā)酵劑的發(fā)酵曲線Fig.3　Fermentation curve of compound fermentation agent

從圖3可以看出，當(dāng)發(fā)酵到3h時(shí)，F(xiàn)JJ與對(duì)照2酸度幾乎相同，高于對(duì)照1。而當(dāng)發(fā)酵到4h時(shí)，對(duì)照1酸度65.970T，對(duì)照2酸度74.170T，F(xiàn)JJ的酸度為69.580T，基本達(dá)到生產(chǎn)要求。發(fā)酵從4h培養(yǎng)到6h時(shí)，對(duì)照1和對(duì)照2酸度增長(zhǎng)明顯，而FJJ酸度增長(zhǎng)開(kāi)始變慢，這從側(cè)面說(shuō)明該發(fā)酵劑后酸化情況十分理想。但是GF在離心過(guò)程中不易分離收集，菌體浪費(fèi)現(xiàn)象嚴(yán)重，為了進(jìn)一步降低成本需要改進(jìn)培養(yǎng)和分離工藝。發(fā)酵劑成品在穩(wěn)定性加速試驗(yàn)中表現(xiàn)優(yōu)秀，但還需穩(wěn)定性長(zhǎng)期試驗(yàn)驗(yàn)證。

3　結(jié)論

添加1.0%番茄汁+0.3%玉米漿+2.0%乳糖的優(yōu)化培養(yǎng)基具有良好的生理特性，能夠促進(jìn)GF和BF菌株生長(zhǎng)，是最佳增殖培養(yǎng)基，活菌計(jì)數(shù)平均為1.58×109cfu·mL-1。冷凍干燥保護(hù)劑保護(hù)效果谷氨酸鈉＞脫脂乳＞海藻糖＞甘油＞吐溫80，優(yōu)先考慮谷氨酸鈉、脫脂乳作為冷凍保護(hù)劑。

在上述優(yōu)化條件下GF和BF菌體在凍干后均達(dá)到1011cfu·mL-1以上，且培養(yǎng)14h時(shí)收獲的菌體，在制成直投式發(fā)酵劑后具有良好的發(fā)酵特性及后酸化水平，制備得到的酸奶與市售酸奶口感風(fēng)味較為接近，完全符合直投式發(fā)酵劑的要求，可以滿足酸奶制造商的需要，具備開(kāi)發(fā)成酸奶發(fā)酵劑的前提。

［1］ 高松柏，黃少磊.雙歧桿菌和雙歧桿菌菌粉的研究［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，1991，19（2）：51-61.

［2］ 呂兵，張國(guó)農(nóng)，肖光輝.新型酸奶發(fā)酵劑的研究［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，1999，27（5）：9-16.

［3］ 周雪峰.雙歧桿菌與酸奶菌的混合發(fā)酵中菌種配比的研究［J］.淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，10（4）.

［4］ ISO 7889-2003 Yogurt-Enumeration of characteristic microorganisms-Colony-count technique at 37℃.

［5］ 張?zhí)m威，劉維，張書(shū)軍.促進(jìn)混合培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生產(chǎn)物質(zhì)的研究［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，1999，27（3）：12-15.

［6］ 劉丹，潘道東.直投式乳酸菌發(fā)酵劑增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2005，26（9）：204-207.

［7］ 吳榮榮，張柏林.直投式酸奶發(fā)酵劑的發(fā)酵工藝及其優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2006，27（2）：178-181.

［8］ 張建友，李艷武，趙群波，等.凍干乳酸菌菌種增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2002，30（5）：14-17.

［9］ 呂燕妮，靳志強(qiáng)，李平蘭，等.酸奶生產(chǎn)用直投式乳酸菌發(fā)酵劑研究［J］.乳品加工，2005，11（2）：47-50.

［10］ 凌代文.乳酸菌細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法［M］北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999.111-112.

Study on the direct-to-vat culture based on culture medium optimization and protective agent screening*

ZHANG Feng
（Dept.of Chemistry and Chemical Engineering，Baoji University of Arts and Science，Shaanxi Key Laboratory of Phytochemistry，Baoji 721013，China）

In this paper，the optimization experiment condition of culture medium optimizing and cryoprotectants screening was determined for Streptococcus.thermophilus and Lactobacillus bulgaricus by orthogonal experiment.and the best of the.Optimized medium has good physical properties with adding mixture of 1.0%tomato juice，0.3%corn pulp and 2.0%lactose.Sodium glutamate and skimmed milk have obvious protective effects on bacterial activity in the freezing process.In the optimization process，their viable count can separately reach 4.3×1011cfu·g-1and 4.2×1011cfu·g-1in the freeze-dried microbial powder.The Direct-to-vat cultures，consistted of both freezedried microbial powder，had good characteristics in compliance with the high viscosity yogurt fermentation.

Freeze-drying microbial powder；direct-to-vat cultures；yogurt fermentation

TS252.4

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20160718

2016-04-26

陜西省科技廳工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（2014K08-36）；寶雞市科技局項(xiàng)目（2013R7-4）；陜西省植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（14JS0 05、12JS008）；寶雞文理學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目（ZK12033）

張鋒（1982-），男，碩士，講師，2010年畢業(yè)于華東理工大學(xué)生物化學(xué)專業(yè)，主要從事生物催化研究。