DEC1基因表達對人食管癌ECA109細胞增殖及侵襲能力的影響

邱娟　張世坤

(焦煤集團中央醫(yī)院 檢驗科　河南 焦作　454000)

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DEC1基因表達對人食管癌ECA109細胞增殖及侵襲能力的影響

邱娟張世坤

(焦煤集團中央醫(yī)院 檢驗科河南 焦作454000)

目的分析DEC1基因表達水平在對人食管癌ECA109細胞增殖和侵襲能力的影響，并探討其可能機制。方法取人食管癌ECA109細胞，分別將質粒pcDNA3.1(-)/DEC1(研究組)和pcDNA3.1(-)(對照組)轉染至該細胞并獲得重組細胞。Western blot 技術對細胞周期蛋白cyclin D1、基質金屬蛋白酶9(MMP9)以及DEC1蛋白表達進行檢測；采用Transwell實驗、平板集落實驗以及CCK-8實驗對細胞增殖和侵襲能力進行檢測。結果研究組細胞DEC1蛋白表達水平高于對照組(P<0.05)，而cyclin D1、MMP9表達低于對照組(P<0.05)。研究組細胞增殖和侵襲能力低于對照組(P<0.05)。結論DEC1表達水平可對人食管癌ECA109細胞增殖和侵襲能力造成一定影響；抑制cyclin D1和MMP9表達可能為其作用機制。

食管癌；DEC1基因；ECA109細胞；增殖；侵襲

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。即便近年來關于食管癌的早期診斷與臨床干預技術獲得了較大進步，但其發(fā)病率與病死率仍居高不下[1-2]。因此，探討食管癌新的治療方案具有重要意義。多種基因可調控食管癌的發(fā)生發(fā)展[3-4]，其中分化型胚胎軟骨發(fā)育基因1(DEC1)參與機體神經、軟骨以及其他細胞的形成與分化，并在腫瘤細胞的增殖與分化中具有一定作用。本研究對DEC1基因在食管癌ECA109細胞中的作用進行研究，探討其對腫瘤細胞增殖與侵襲能力的影響。

1　資料與方法

1.1實驗材料及條件人食管癌ECA109細胞購自河南省腫瘤醫(yī)院實驗室；兔抗人DEC1單克隆抗體購自上海漢恒生物科技公司；兔抗人cyclin D1 和MMP9單克隆抗體以及HRP標記的羊抗兔IgG均購自南京建成生物技術研究所；actin抗體購自Santa Cruz；脂質體轉染試劑購自上海壹研生物科技公司；Total RNA提取試劑盒購自上海吉凱基因化學技術有限公司。全部實驗在焦煤集團中央醫(yī)院中心實驗室完成。

1.2檢測方法

1.2.1質粒的構建與轉染根據DEC1基因cDNA序列設計引物，引物合成由南京建成生物技術研究所制備。取人食管癌ECA109細胞，提取總RNA并反轉錄獲得cDNA，PCR擴增。嚴格依據上海吉凱基因化學技術有限公司說明書構建pcDNA3.1(-)/DEC1和pcDNA3.1(-)重組質粒，并分別令其為研究組和對照組。按照脂質體操作說明將其轉染至ECA109細胞。

1.2.2蛋白表達水平檢測轉染72 h后，提取兩組食管癌ECA109細胞總蛋白并測定濃度，加入緩沖液，80 V恒壓SDS-PAGE，250 mA恒流2 h后轉至PVDF膜，室溫下脫脂牛奶封閉2 h。4 ℃環(huán)境下與特異性一抗結合12 h，二抗孵育2 h，采用ECL化學發(fā)光并顯影，根據顯影結果定量檢測DEC1蛋白的表達水平。

1.2.3細胞增殖及侵襲能力檢測分別采取Transwell實驗、平板集落實驗以及CCK-8實驗對細胞增殖和侵襲能力進行檢測。①Transwell實驗：將血清BRMI 1640培養(yǎng)基稀釋、混勻，分別取60 μl置于Transwell小室，37 ℃孵育2 h。取細胞懸液100 μl加入上室中，取15%胎牛血清培養(yǎng)基加入下室，于5% CO2培養(yǎng)箱中，在37 ℃環(huán)境下孵育24 h。擦掉上室細胞，以PBS緩沖液洗3次，甲醇固定30 min，結晶紫染色10 min。PBS緩沖液洗凈，常溫下風干。光鏡下隨機選取3個視野進行細胞計數(shù)。②平板集落實驗：收集轉染24 h的各組細胞，接種于6孔板，每孔1 000個，于5% CO2培養(yǎng)箱中在37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，2～3 d換液，10 d后固定并結晶紫染色。③CCK-8實驗：收集轉染24 h的各組細胞接種于96孔板中，每孔2 000個。在細胞貼壁后計時。分別于1、24、48、72、96 h加入10 μl CCK-8液，37 ℃環(huán)境下孵育2 h，測定吸光度，波長450 nm。

2　結果

2.1蛋白表達水平研究組cyclin D1、MMP9以及DEC1蛋白表達水平分別為(1.14±0.04)kD、(0.62±0.02)kD和(0.24±0.01)kD，對照組則分別為(0.01±0.00)kD、(0.97±0.04)kD和(0.46±0.02)kD。研究組細胞DEC1蛋白表達水平高于對照組(P<0.05)，cyclin D1、MMP9表達水平低于對照組(P<0.05)。

2.2細胞生長與克隆能力平板集落實驗顯示，研究組細胞克隆團數(shù)量為(54.36±8.72)個，CCK-8實驗顯示其細胞生長速度較低；對照組細胞克隆團數(shù)量為(225.37±12.64)個，CCK-8實驗顯示其細胞生長速度較低。研究組細胞增殖能力低于對照組(P<0.05)。見圖1。

圖1　過表達DEC1基因對ECA109細胞克隆形成能力的影響

2.3細胞侵襲能力Transwell實驗顯示，研究組穿過基底膜的細胞數(shù)為(12.41±3.79)個，而對照組為(58.37±5.24)個。研究組細胞侵襲能力低于對照組(P<0.05)。見圖2。

圖2　過表達DEC1基因對ECA109細胞侵襲能力的影響

3　結論

盡管目前對食管癌已經采取外科手術、放療及化療等綜合方式治療，但患者病死率仍處于較高水平，預后不佳[5]。分子靶向治療是近年來的研究熱點，可通過調節(jié)相關基因表達水平對惡性腫瘤細胞進行抑制或促使其凋亡，并可完全避免常規(guī)治療所引起的毒副作用[6-7]，因此具有廣闊前景。

DEC1基因是DEC家族中的一種，該基因參與機體多種組織細胞的分化活動，在神經發(fā)育、軟骨形成以及其他細胞的形成與分化中具有重要作用，并在腫瘤細胞的增殖與分化中具有一定作用。近年來，已在食管癌、肺癌及乳腺癌等多種腫瘤細胞中檢測到DEC1基因高表達，提示該基因表達水平可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有一定關系。

cyclin D1和MMP9是調控惡性腫瘤細胞增殖的重要因子，并增強腫瘤細胞的侵襲能力。本研究通過構建重組細胞，并通過檢測上述蛋白的表達水平及腫瘤細胞的增殖與侵襲能力，進行對比分析。結果顯示，與對照組比較，在pcDNA3.1(-)/DEC1轉染的細胞中，DEC1蛋白高表達，而cyclin D1和MMP9低表達。在對細胞的增殖和侵襲能力進行分析后進一步發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.1(-)/DEC1轉染的細胞生長速度和克隆能力顯著下降，穿過基底膜的細胞數(shù)減少。上述結果表明，DEC1蛋白高表達可抑制食管癌細胞的增殖和侵襲能力，而作用機制可能為通過抑制cyclin D1和MMP9表達能力而達到上述作用。

綜上，通過本研究我們認為，DEC1基因表達水平對調節(jié)食管癌ECA109細胞增殖和侵襲能力具有一定作用。但能否將DEC1基因作為腫瘤標志物并靶向調控腫瘤細胞生長與凋亡尚需進一步研究，而本研究為食管癌的靶向治療提供了一定的參考價值。

[1]周榮秒,李賓,牛朝旭,等.shRNA干擾PLCε1基因對人食管癌Eca109細胞增殖和細胞周期的影響[J].基礎醫(yī)學與臨床,2015,35(2):208-212.

[2]樊建軍,武家艷,李海玉,等.RNAI沉默Grp94基因對人食管癌ECA109細胞遷移及侵襲能力的影響[J].第三軍醫(yī)大學學報,2015,37(12):1222-1225.

[3]尹素改,王慧慧,陳玉龍,等.啟膈散乙酸乙酯部位抑制食管癌Eca109細胞STAT3信號通路誘導細胞凋亡的研究[J].廣州中醫(yī)藥大學學報,2015,32(5):857-860.

[4]王昆侖,徐曉霞,張忠獻,等.DNA-PKcs蛋白在食管癌組織中的表達及臨床病理相關性研究[J].河南醫(yī)學研究,2014,23(12):1-3.

[5]王華川,溫劍虎.siRNA介導的nestin基因沉默對人食管癌ECA109細胞侵襲和遷移的影響及機制[J].中國病理生理雜志,2015,31(8):1432-1436.

[6]尹素改,王慧慧,吳耀松,等.六君子湯提取物對食管癌Eca109細胞的增殖抑制作用[J].中國實驗方劑學雜志,2015,21(1): 163-166.

[7]康強強,唐敏,侯妍利,等.兩性霉素B通過調節(jié)HIF-1α活性抑制缺氧環(huán)境下食管癌Eca109細胞的侵襲遷移能力[J].南方醫(yī)科大學學報,2015,34(6):798-801.

Effect ofDEC1 gene expression on proliferation and invasion abilities of human esophageal cancer ECA109 cells

Qiu Juan, Zhang Shikun

(DepartmentofClinicalLaboratory,JiaozuoCoalIndustryGroup,Jiaozuo454000,China)

ObjectiveTo investigate the effect ofDEC1 gene expression on proliferation and invasion abilities of human esophageal cancer ECA109 cells. MethodsHuman esophageal cancer ECA109 cells were selected and transfected with plasmid pc DNA3.1(-)/DEC1 (study group) and pcDNA3.1(-) (control group). The expression of DEC1 mRNA was evaluated by real-time PCR, and the protein of cyclin D1, MMP9 and DEC1 were evaluated by Western blot. The cell proliferation and invasion ability were evaluated by Transwell test, colony formation assay and CCK-8 assay. ResultsThe expression levels of DEC1 mRNA and DEC1 in the study group were significantly higher than those in the control group(P<0.05), but the expression levels of cyclin D1 and MMP9 were significantly lower than that of the control group(P<0.05). The cell proliferation and invasion ability of the study group was lower than that of the control group(P<0.05). ConclusionThe expression level of DEC1 may affect the proliferation and invasion of human esophageal cancer ECA109 cells, and the inhibition of cyclin D1 and MMP9 expression may be the mechanism of its action.

esophageal cancer;DEC1 gene; ECA109 cells； proliferation; invasion

R 735.1

10.3969/j.issn.1004-437X.2016.07.003

2016-02-29)