瑞舒伐他汀對急性心肌梗死大鼠心肌重構(gòu)的作用及其機(jī)制

吳春濤，馬士新

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瑞舒伐他汀對急性心肌梗死大鼠心肌重構(gòu)的作用及其機(jī)制

吳春濤1，馬士新2

目的 探討瑞舒伐他汀對急性心肌梗死（AMI）大鼠心肌重構(gòu)的作用及其機(jī)制。方法 選擇健康成年雄性SD大鼠60只，通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立AMI大鼠模型51只，按照隨機(jī)數(shù)表法分成假手術(shù)組、模型組和他汀組，每組各17只。他汀組大鼠灌胃給藥瑞舒伐他汀鈣片10 mg/（kg·d），1/日，另外兩組大鼠給予等量的蒸餾水，連續(xù)給藥6周。采用彩色多普勒超聲診斷儀檢測左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）及左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測心肌組織基質(zhì)金屬蛋白酶-2/9/10（MMP2/9/10）、Perionstin蛋白及轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）mRNA表達(dá)情況。結(jié)果 模型組和他汀組大鼠的LVEDD及LVESD均明顯高于假手術(shù)組，LVEF顯著低于假手術(shù)組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。與模型組相比，他汀組大鼠的LVEDD及LVESD明顯下降，LVEF顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。與假手術(shù)組相比，其余兩組大鼠心肌組織中MMP-2/9/10、Perionstin蛋白及TGF-β1的mRNA表達(dá)均明顯升高；其中他汀組大鼠心臟中MMP2/9/10、Perionstin蛋白及TGF-β1的mRNA表達(dá)顯著低于模型組，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。藥物干預(yù)結(jié)束后，假手術(shù)組大鼠存活率為76.47%（13/17）明顯高于模型組的41.18%（7/17）和他汀組的64.71%（11/17），同時他汀組的存活率顯著高于模型組，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)論 瑞舒伐他汀可改善AMI大鼠心臟功能，可能通過調(diào)節(jié)MMP2/9/10、Perionstin蛋白及TGF-β1的mRNA表達(dá)來調(diào)控其心肌重構(gòu)。

瑞舒伐他??；急性心肌梗死；心肌重構(gòu)；機(jī)制；大鼠

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是心內(nèi)科常見疾病之一，是導(dǎo)致心力衰竭（心衰）的重要原因之一。AMI的發(fā)病率急劇升高，嚴(yán)重威脅人們的健康狀況［1］。AMI是由于心臟的供血血管發(fā)生急性閉塞，從而導(dǎo)致相應(yīng)的心肌細(xì)胞出現(xiàn)缺血、缺氧狀態(tài)，甚至壞死，其臨床典型癥狀為進(jìn)展性心電圖變化、胸骨后疼痛等［2］。

1　材料和方法

1.1儀器與藥品 HX-300動物呼吸機(jī)（上海益聯(lián)科教設(shè)備有限公司）、ASB 240 U生物信號采集分析系統(tǒng)（成都邀生電子有限公司）、美國ABI9700RT-PCR擴(kuò)增儀、PHILPS IU22彩色多普勒超聲診斷儀、美國Bio-Rad伯樂電泳儀。瑞舒伐他汀鈣片（商品名：可定，阿斯利康制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：H20110563）、烏拉坦（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2/9/10、Perionstin蛋白及轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）兔多克隆抗體購自美國BD公司、PCR引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2實驗動物及分組 SPF級健康雄性SD大鼠60只，8周齡，體重220～270 g，平均（250.32± 10.42）g，購自上海西普爾—必凱實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（滬）2013-0016，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，溫度保持在25℃±3℃，相對濕度為45%～70%，自由進(jìn)食飲水，普通飼料喂養(yǎng)。通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支建立AMI大鼠模型，其中只有51只造模成功，按照隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的大鼠分成模型組、假手術(shù)組和他汀組，每組各17只。

1.3造模與給藥方法 造模方式采用Fishbein MC等［7］改進(jìn)的冠狀動脈左前降支結(jié)扎的方法，首先腹腔注射20%烏拉坦（0.4 ml/kg）麻醉大鼠，將大鼠固定于手術(shù)臺上，沿頸中部中線切開皮膚，固定好，氣管插管連接動物呼吸機(jī)，頻率為90 次/min，潮氣量15 ml/kg，關(guān)閉呼吸機(jī)，用來排除實驗大鼠是否存在先天性變異。之后呼吸機(jī)正常運(yùn)轉(zhuǎn)，在心臟搏動明顯處，鈍性逐層打開胸腔，暴露心臟，6-0線結(jié)扎冠狀動脈左前降支近端。結(jié)扎后左室壁變白，室壁運(yùn)動減弱；QRS波峰降低，J點升高，ST段明顯升高，這些指標(biāo)表明造模成功。造模成功的大鼠復(fù)張胸腔，清理胸腔，逐層關(guān)閉胸腔，斷開呼吸機(jī)，清理呼吸道。其中假手術(shù)組僅穿線并不在冠狀動脈處結(jié)扎。他汀組大鼠灌胃給予瑞舒伐他汀鈣10 mg/（kg·d），1/日，另外兩組大鼠給予等量的蒸餾水，連續(xù)給藥6周。

1.4心臟超聲心動圖檢測 給藥結(jié)束后，腹腔注射20%烏拉坦（0.4 ml/kg）麻醉大鼠，使用高頻超聲探頭（12MHz）進(jìn)行心臟超聲檢查，連續(xù)三個心動周期測量取平均值，計算左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）及左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）。

1.5RT-PCR檢測方法 實驗結(jié)束后采用RT-PCR方法檢測大鼠心臟中MMP2/9/10、Perionstin蛋白及TGF-β1的mRNA表達(dá)，于無菌環(huán)境下取大鼠心臟組織200 mg置于液氮中，加入Trizol溶液，抽提總RNA，嚴(yán)格按照說明書上操作，得到所需樣品，置于PCR擴(kuò)增儀，PCR擴(kuò)增的條件是95℃，5 min，之后95℃ 30 s，58℃ 40 s，75℃ 45 s，共35次循環(huán)。產(chǎn)物進(jìn)行電泳，凝膠成像掃描系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三組大鼠超聲相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)比較 模型組和他汀組大鼠的LVEDD及LVESD均明顯高于假手術(shù)組，LVEF顯著低于假手術(shù)組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；與模型組相比，他汀組大鼠的LVEDD及LVESD明顯下降，LVEF顯著升高，［（8.54±1.21）mm vs. （6.43±0.76）mm］，［（4.88±0.3）mm vs. （3.73±0.26）mm］和［（47.32±4.12）% vs. （67.41±5.32）%］，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（表1）。

2.2三組大鼠心臟MMP-2/9/10、Perionstin蛋白及TGF-β1的mRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組相比，其余兩組大鼠心肌組織中MMP-2/9/10、Perionstin蛋白及TGF-β1的mRNA表達(dá)均明顯升高；其中他汀組大鼠心臟中MMP2/9/10、Perionstin蛋白及TGF-β1的mRNA表達(dá)顯著低于模型組，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（表2、圖1）。

表1　三組大鼠心臟超聲結(jié)果比較

（A）M：DNA maker；1：假手術(shù)組；2：模型組；3：他汀組

（B） M：DNA maker；1和2：假手術(shù)組；3和4：模型組；5和6：他汀組

（C）M：DNA maker；1和2：假手術(shù)組；3和4：模型組；5和6：他汀組

（D）M是DNA maker；1：假手術(shù)組；2和3：模型組；4和5：他汀組

圖1　RT-PCR檢測結(jié)果（A-E分別為MMP2、MMP9、MMP10、Perionstin蛋白及TGF-β1）

2.3三組大鼠存活率比較 藥物干預(yù)結(jié)束后，假手術(shù)組大鼠存活率為76.47%（13/17）明顯高于模型組的41.18%（7/17）和他汀組的64.71% （11/17），同時他汀組的存活率顯著高于模型組，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

3　討論

AMI發(fā)生后心肌細(xì)胞受損，導(dǎo)致心肌整體收縮力下降，心室肥厚，發(fā)生擴(kuò)張，細(xì)胞外基質(zhì)和間質(zhì)纖維組織增生，心肌纖維化增加及心肌細(xì)胞肥大，最終導(dǎo)致心衰［8］。心肌重構(gòu)的初期為了維持心臟輸出量，血流動力學(xué)會發(fā)生適應(yīng)性變化，但是在長期病理狀態(tài)下，會增加心臟負(fù)荷，損傷心臟的舒縮功能而出現(xiàn)代償性心衰［9］。

本研究中采用開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法建立AMI大鼠模型，具有操作簡單，方法成熟，成功率高等特點。這種方法用于探究AMI的發(fā)病機(jī)制，并觀察AMI的病理變化［10］。實驗中造模成功率為85%，其中造模失敗的原因可能是結(jié)扎不準(zhǔn)確，手術(shù)技術(shù)不熟練，定位差，操作不規(guī)范造成感染等。

MMPs是一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，主要由巨噬細(xì)胞分泌，能降解細(xì)胞外基質(zhì)和多種膠原纖維，造成心肌細(xì)胞的損傷，增大梗死區(qū)域［10］。心肌重構(gòu)初期至代償性心衰過程中，MMPs活性增高，心衰末期MMPs激活，其表達(dá)明顯升高，同時纖維膠原結(jié)構(gòu)減少［11］。MMP-2和MMP-9屬于MMPs家族中重要成員，MMP-10可以降解血管外基質(zhì)，從而破壞血管的完整，在AMI心肌中高度表達(dá)［5］。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠心臟中MMP-2、MMP-9和MMP-10的mRNA的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），提示MMP-2、 MMP-9和MMP-10可能與AMI大鼠的心肌重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，為治療AMI提供了研究思路。AMI大鼠心肌發(fā)生病理性纖維化變化，而Periostin蛋白是由成纖維細(xì)胞合成的一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，可以造成心肌肌束滑動而產(chǎn)生心腔擴(kuò)大，心臟功能受損，還可以與其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聯(lián)合促進(jìn)病理性纖維化的形成［12］，機(jī)體在正常狀態(tài)下并無表達(dá)，當(dāng)心肌細(xì)胞受損后會高度表達(dá)，因此實驗中發(fā)現(xiàn)模型組大鼠心臟中Periostin蛋白的mRNA表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）。AMI發(fā)生后炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子激活TGF-β1，從而促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)展［13］，TGF-β1主要由心肌細(xì)胞產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，同時刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)，誘發(fā)心肌纖維化［14］。有研究認(rèn)為［15］，Periostin作為Ang II-TGF-β1信號系統(tǒng)下游因子，促進(jìn)心肌纖維化，形成穩(wěn)定的膠原網(wǎng)，從而誘發(fā)AMI患者發(fā)生心肌重構(gòu)。因此實驗中模型組大鼠心臟中TGF-β1的變化趨勢類似于Periostin蛋白，即明顯高于假手術(shù)組（P ＜0.05）。

表2　三組大鼠心臟MMP2/9/10、Perionstin蛋白及TGF-β1的mRNA表達(dá)比較

他汀類藥物是一類3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-COA）還原酶抑制劑，主要是通過抑制HMG-COA還原酶從而影響膽固醇的合成，具有降脂、抗氧化、抗炎、抑制心肌纖維化、保護(hù)心臟、促進(jìn)血管再生等作用［10］。瑞舒伐他汀是其中一種，可以競爭性抑制膽固醇合成過程中的關(guān)鍵酶，從而抑制膽固醇的合成，還能降低細(xì)胞表面低密度脂蛋白，加速其代謝，從而可明顯改善心臟功能［16］。除此之外，瑞舒伐他汀能夠抑制巨噬細(xì)胞分泌的MMPs，防止心肌纖維化加重［17］，還能夠抑制TGF-β1的mRNA表達(dá)水平，調(diào)節(jié)periostin蛋白的表達(dá)從而減少膠原的沉積，最終達(dá)到改善心臟功能及改善心肌重構(gòu)的目的［11］。實驗中他汀組大鼠心臟中MMPs、periostin蛋白及TGF-β1的mRNA表達(dá)水平明顯低于模型組，表明瑞舒伐他汀改善心臟功能及心肌重構(gòu)進(jìn)程。此外，假手術(shù)大鼠存活率明顯高于模型組和他汀組，同時他汀組的存活率顯著高于模型組，表明瑞舒伐他汀對于AMI大鼠具有治療作用。

綜上所述，瑞舒伐他汀可以顯著改善AMI大鼠的心臟功能，并顯著下調(diào)MMPs、periostin蛋白及TGF-β1的mRNA表達(dá)，從而改善AMI大鼠心肌重構(gòu)，其作用機(jī)制也可能是通過抑制心肌重構(gòu)過程中相關(guān)蛋白的表達(dá)從而達(dá)到治療目的。

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本文編輯：姚雪莉

Effect of rosuvastatin on myocardial remodeling and mechanism in rats with acute myocardial infarction

WU Chun-tao， MA Shi-xin. Jinshan Branch Hospital， Sixth People's Hospital of Shanghai City， Shanghai 201599， China.

MA Shi-xin， E-mail: shxma@sina.com

Objective To discuss the effect of rosuvastatin on myocardial remodeling and mechanism in rats with acute myocardial infarction （AMI）. Methods Male adult SD rats （n=60） were chosen and AMI model was established in 51 rats through ligating left coronary anterior descending branch， and then they were randomly divided into sham-operation group， model group and rosuvastatin group （each n=17）. The rosuvastatin group was intragastrically given rosuvastatin calcium tablets ［10 mg/（kg·d）］ once a day， and other 2 groups were given distilled water in the same dose for 6 w. The left ventricular ejection fraction （LVEF）， left ventricular enddiastolic inner diameter （LVEDd） and left ventricular end-systolic diameter （LVESd） were detected by using color Doppler ultrasonic diagnostic apparatus. The mRNA expressions of myocardial matrix metalloproteinase-2/9/10 （MMP-2/9/10）， Perionstin protein and transforming growth factor β1 （TGF-β1） were detected by using reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results LVEDd and LVESd were significantly higher and LVEF was significantly lower in model group and rosuvastatin group than those in sham-operation group （all P《0.05）. Compared with model group， LVEDd and LVESd decreased significantly and LVEF increased significantly in rosuvastatin group （all P《0.05）. Compared with sham-operation group， the mRNA expressions of MMP-2/9/10， Perionstin protein and TGF-β1 increased significantly in other 2 groups， and were significantly lower in rosuvastatin group than those in model group （all P《0.05）. After drug intervention finished， the survival rate of rat was 76.47% （13/17） in sham-operation group， which was significantly higher than that in model group ［41.18% （7/17）］ and rosuvastatin group ［64.71% （11/17）］， and meanwhile， the survival rate of rat was significantly higher in rosuvastatin group than that in model group （all P《0.05）. Conclusion Rosuvastatin can improve heart function and control myocardial remodeling through regulating the mRNA expressions of MMP-2/9/10， Perionstin protein and TGF-β1.

Rosuvastatin； Acute myocardial infarction； Myocardial remodeling； Mechanism； Rats

R541.4

A

1674-4055（2016）05-0560-04

1201599 上海，上海市第六人民醫(yī)院金山分院；2200233 上海，上海市第六人民醫(yī)院

馬士新，E-mail:shxma@sina.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.05.14

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為受損的心肌細(xì)胞會退出細(xì)胞周期，而最近研究表明哺乳動物的心肌細(xì)胞處于一個持續(xù)循環(huán)的狀態(tài)，具有再生能力，這為治療AMI提供了新的思路［3］。在AMI發(fā)生早期，心臟的結(jié)構(gòu)和功能受調(diào)節(jié)會發(fā)生心肌重構(gòu)［4］。有研究表明［5］，他汀類藥物有助于改善心肌重構(gòu)，降低AMI的發(fā)生率，同時可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和保護(hù)心肌細(xì)胞。瑞舒伐他汀是他汀類藥物家族中的成員，具有抗炎、穩(wěn)定斑塊、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和保護(hù)心肌細(xì)胞等作用［6］。本研究觀察了瑞舒伐他汀對AMI大鼠心電圖影響及心肌重構(gòu)的作用，并探索其作用機(jī)制。