乳酸聯(lián)合飽和氫鹽水模擬缺血后適應(yīng)減輕大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的研究

張國(guó)明，王曉菲，談紅，許琳，李曉燕，趙傳旭

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乳酸聯(lián)合飽和氫鹽水模擬缺血后適應(yīng)減輕大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的研究

張國(guó)明1，王曉菲2，談紅1，許琳1，李曉燕1，趙傳旭1

目的 探討乳酸和飽和氫鹽水能否模擬機(jī)械后適應(yīng)，通過(guò)線粒體途徑減輕心肌細(xì)胞凋亡。方法 108只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組（R/I 組）、后適應(yīng)組（M-Post組）、乳酸組（Lac組，60μl）、 氫鹽水組（Hyd組，250μl/kg）和乳酸+氫鹽水組（Lac+Hyd組，乳酸60 μl+氫鹽水 250μl/kg）6組，每組18只。急性心肌缺血45 min后，于再灌注即刻根據(jù)分組給予相應(yīng)藥物或機(jī)械后適應(yīng)干預(yù)。測(cè)定再灌注3 min后右心房血漿PH值，于不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，分別測(cè)定缺血心肌組織丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量，線粒體在再灌注3 min和30 min后吸光度，缺血心肌組織中Bcl-2/Bax、細(xì)胞色素c（Cyt-c）和Caspase-9含量，以及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果 Lac+Hyd組再灌注后3 min右心房血漿PH值顯著低于R/I組（7.32±0.06 vs. 7.43±0.03，P＜0.05），MDA含量顯著低于R/I組（1.14±0.16 nmol/mgpro vs. 1.56±0.21 nmol/mgpro，P＜0.05），SOD含量高于R/I組（57.92±15.12 U/ mgpro vs. 35.48±12.46 U/mgpro，P＜0.05）。Lac+Hyd組線粒體吸光度再灌注后3 min和30 min各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于R/I 組（P＜0.05）。再灌注30 min后心肌組織Bcl-2（1.06±0.13 vs. 0.02±0.01，P＜0.05）含量顯著高于R/I 組，Bax含量（0.41±0.06 vs. 2.40±0.45，P＜0.05），Caspase-9含量（0.32±0.08 vs. 1.48± 0.21，P＜0.05）和胞漿中Cyt-c含量（0.76±0.09 vs. 6.69±1.26，P＜0.05）均顯著低于R/I組；心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于R/I組（9.50%±1.51% vs. 15.21%±1.91%，P＜0.05）。以上指標(biāo)均與M-Post組相比均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論 乳酸和飽和氫鹽水聯(lián)合使用可較好模擬后適應(yīng)上游觸發(fā)因子，可通過(guò)線粒體途徑有效減輕心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。

再灌注損傷；線粒體；藥物后適應(yīng)；乳酸；氫鹽水

急性心肌梗死是最為兇險(xiǎn)的急診之一，溶栓和急診介入治療可有效降低死亡率，但也帶來(lái)再灌注損傷。缺血后適應(yīng)是一種減輕再灌注損傷的有效方法［1］，多種系實(shí)驗(yàn)均證實(shí)后適應(yīng)可有效降低心肌梗死面積，減輕細(xì)胞凋亡，改善心功能［2-6］。但臨床應(yīng)用存在一定風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)樵诓∽儾课环磸?fù)的機(jī)械擴(kuò)張容易導(dǎo)致斑塊破裂、遠(yuǎn)端栓塞乃至冠狀動(dòng)脈夾層等并發(fā)癥。近年來(lái)提出使用藥物模擬機(jī)械后適應(yīng)的保護(hù)機(jī)制，即藥物后適應(yīng)可有效避免上述機(jī)械并發(fā)癥的發(fā)生。

后適應(yīng)的保護(hù)機(jī)制目前尚未明了，2007年Cohen等［7，8］提出的酸中毒假說(shuō)受到普遍認(rèn)可，他們認(rèn)為再灌注后短暫延長(zhǎng)局部組織酸中毒和適量氧自由基的生成是機(jī)械后適應(yīng)最上游的觸發(fā)因子。因?yàn)槿毖笏嶂卸镜闹饕煞质侨樗?，既往研究發(fā)現(xiàn)局部注射乳酸可較好的模擬缺血心肌的酸中毒。另近年來(lái)發(fā)現(xiàn)氫氣可有效清除羥自由基和另近年來(lái)發(fā)現(xiàn)氫氣可有效清除羥自由基（·OH）和過(guò)氧亞硝基陰離子（ONOO-），上述兩種是造成組織損傷的主要自由基；對(duì)超氧負(fù)離子（O2-）和雙氧水（H2O2）等無(wú)抑制作用，而O2-和H2O2是激發(fā)細(xì)胞保護(hù)因子的自由基［9-14］。本研究在活體大鼠急性心肌梗死再灌注模型中，使用乳酸延長(zhǎng)局部組織酸中毒，使用飽和氫鹽水保存激活的信號(hào)分子自由基，觀察其能否發(fā)揮有效的心肌保護(hù)作用，以進(jìn)一步探討后適應(yīng)保護(hù)機(jī)制的上游觸發(fā)因子。

1　材料與方法

1.1主要試劑 乳酸（北京化學(xué)試劑公司）為分析純產(chǎn)品，注射前使用4 mol/L NaOH滴定PH至5.5備用；氫氣飽和鹽水按Sun等［12］方法制作， 將高壓氫氣（輸出壓力0.4 MPa）通人0.9%氯化鈉6 h以達(dá)到飽和濃度，4℃保存，3 d內(nèi)使用；注射用生理鹽水使用4 mol/L NaOH滴定PH至7.4備用。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型的建立 108健康SPF級(jí)SD大鼠，雌雄不拘，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重200～250 g。按趙秀梅等［15］球囊墊扎法復(fù)制大鼠在體心肌梗死后再灌注模型。大鼠稱重后用腹腔注射法麻醉（2%戊巴比妥鈉，0.23 ml/100 g），切開頸部皮下和肌肉插入氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸（HX-200 型動(dòng)物呼吸機(jī)，潮氣量 30 ml/ kg，頻率50～60 次/min，吸呼比1∶2）。開胸保留心臟，在左心耳下緣與肺動(dòng)脈圓錐間用5-0縫合線穿過(guò)前降支深部，將壓力為1 ATM后擴(kuò)張球囊（Grip，3.0×12 mm，Acrostak 公司）墊于血管與結(jié)扎線之間并結(jié)扎，而后將壓力迅速調(diào)節(jié)為12 ATM。壓力泵壓力45 min后迅速調(diào)為0 ATM，根據(jù)分組給予不同處理。處理完畢后縫合胸腔、氣管和頸部組織，術(shù)后24 h麻醉后經(jīng)右頸總動(dòng)脈進(jìn)行插管，監(jiān)測(cè)主動(dòng)脈壓力后將軟管插入左心室（動(dòng)脈插管中使用肝素鹽水，濃度25 u/ml），使用生物信號(hào)及壓力測(cè)試系統(tǒng)（MFL lab 200）監(jiān)測(cè)主動(dòng)脈及左心室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。而后經(jīng)頸動(dòng)脈抽血3～4 ml，離心后保存擬測(cè)定心肌酶；處死大鼠取心臟行心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)。另術(shù)后3 min每組各取6只大鼠直接處死，取左心室缺血心肌組織，液氮冷凍后置于-80℃冰箱保存擬行缺血心肌MDA和SOD含量以及線粒體檢測(cè)。術(shù)后30 min每組各取6只大鼠直接處死取左心室缺血心肌組織冷凍后，擬行線粒體和Western blot檢測(cè)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 如圖1所示，大鼠隨機(jī)分為6組：①假手術(shù)組（Sham）：開胸并分離左冠狀動(dòng)脈，穿線但不結(jié)扎，曠置45 min后在心臟前壁注射生理鹽水60 μl；②缺血再灌注組（R/I）：缺血45 min后將壓力泵壓力調(diào)至0 ATM，移除球囊后立即在缺血部位分三點(diǎn)注射生理鹽水共計(jì)60μl，而后持續(xù)再灌注；③后適應(yīng)組（M-Post）：缺血45 min后、再灌注前通過(guò)球囊放氣-充盈實(shí)現(xiàn)再灌注和缺血反復(fù)4輪，其時(shí)間為20/20 s×4，移除球囊后立即在缺血部位分三點(diǎn)注射生理鹽水共60 μl，而后持續(xù)再灌注；④乳酸組（Lac）：缺血45 min移除球囊后，立即在缺血部位分三點(diǎn)注射乳酸共計(jì)60 μl，而后持續(xù)再灌注；⑤氫飽和鹽水組（Hyd）：缺血45 min移除球囊后，立即在缺血部位分三點(diǎn)注射氫飽和鹽水60 μl，而后持續(xù)再灌注；⑥乳酸+氫飽和鹽水組（Lac+Hyd）：缺血45 min移除球囊后，立即在缺血部位分三點(diǎn)注射乳酸和氫飽和鹽水稀釋液共計(jì)60 μl，而后持續(xù)再灌注。

圖1　實(shí)驗(yàn)各組處理模式圖

1.4血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 術(shù)后24 h（每組6只），以20%烏拉坦腹腔注射麻醉后，經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入左心室導(dǎo)管，使用生物信號(hào)及壓力測(cè)試系統(tǒng)描記頸動(dòng)脈和左心室壓力曲線，以MFL lab 200軟件分析心率、平均主動(dòng)脈壓（MAP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）和左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）。

1.5血漿pH值測(cè)定 再灌注3 min后，以1 ml注射器抽取右心房血液0.5 ml，立即使用血?dú)夥治鰞x測(cè)定PH值，同時(shí)無(wú)菌棉球填塞止血。

1.6缺血心肌組織微量丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定 分別采用硫代巴比妥酸法和分光光度計(jì)法測(cè)定心肌組織MDA含量和SOD活性，試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司。

1.7缺血心肌組織線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的測(cè)定 缺血心肌組織線粒體吸光度值（A值）的變化，間接反映了mPTP的開放程度，A值越低，說(shuō)明mPTP開放程度越高。檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，線粒體分離試劑盒和吸光度檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海杰美基因科技公司。首先使用差速離心法提取線粒體，提取線粒體后每組取5 μl進(jìn)行蛋白定量。而后取線粒體（每組含蛋白200 μg），按試劑盒說(shuō)明書稀釋、加用誘導(dǎo)劑后，使用酶標(biāo)儀在520 nm測(cè)定線粒體A值，取0、0.5、1、3和5 min 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)。

1.8Bcl-2/Bax、Caspase-9和Cyt-c含量Western blot檢測(cè) 缺血心肌組織勻漿后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，而后經(jīng)轉(zhuǎn)膜、2次免疫反應(yīng)，抗原抗體復(fù)合物用ECL法顯示，采用Image-Pro Plus 圖像分析軟件（Version 4.1，Media Cybernetics，LP，美國(guó)）分析蛋白條帶的積分光密度值（IOD值），光密度值=平均光密度值×面積。另以兔抗小鼠β-actin（1∶200）單

克隆抗體同上操作作為對(duì)照，以靶蛋白IOD值/β-actin IOD值的比值反映靶蛋白相對(duì)表達(dá)水平。Western blot法檢測(cè)Cyt-c時(shí)，需先分離線粒體，提取胞漿。而后以上述方法檢測(cè)胞漿中Cyt的表達(dá)水平，具體方法參考文獻(xiàn)［16］。Bcl-2/Bax和Caspase-9，以及細(xì)胞色素C（Cyt-c）多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，相應(yīng)二抗購(gòu)自瑞典Amersham公司。

1.9心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的檢測(cè) 取大鼠心臟將缺血區(qū)心肌組織剪下，置于中性甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的 dUTP缺口末端標(biāo)記法進(jìn)行心肌組織切片細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)，凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。每張切片于凋亡細(xì)胞分布區(qū)域各取5個(gè)高倍視野，計(jì)算平均每100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，并以百分?jǐn)?shù)（%）表示心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用（±s）表示 。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果 各組大鼠間心率和平均動(dòng)脈壓未見明顯差異（表1）。Lac組、Hyd組和Lac+Hyd組+dp/dtmax和-dp/dtmax均顯著高于R/I組（P＜0.05）；Lac+Hyd組與M-Post組組間比較差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Lac組和Hyd組則均顯著低于M-Post組（P＜0.05）。

2.2右心房血漿pH值 再灌注3 min后右心房血漿PH值如表1所示，Lac和Lac+Hyd組均顯著降低于R/I組（P＜0.05），Hyd組低于R/I組但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；Lac和 Lac+Hyd組血漿pH值與M-Post組相似（P＞0.05），Hyd組顯著高于M-Post組（P＜0.05）。

2.3缺血心肌組織MDA和SOD含量 如表1所示，再灌注10min后缺血心肌組織MDA含量，Hyd和Lac+Hyd組均顯著低于R/I組（P＜0.05），而SOD含量則均顯著高于R/I組（P＜0.05）；Lac組MDA 和SOD含量與R/I組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同M-Post組相比，Hyd和Lac+Hyd組MDA和SOD含量與之相似（P＞0.05），Lac組MDA顯著高于M-Post組（P＜0.05），SOD含量顯著低于M-Post組（P＜0.05）。

表1　各組大鼠血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、血漿pH、心肌組織MDA和SOD含量比較（±s）

表1　各組大鼠血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、血漿pH、心肌組織MDA和SOD含量比較（±s）

注：MAP：平均動(dòng)脈壓，+dp/dtmax：左心室內(nèi)壓最大上升速率，- dp/dtmax：左心室內(nèi)壓最大下降速率；與R/I 組比較，aP＜0.05；與M-Post組相比，bP＜0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

SOD （U/mgpro）（n=6）假手術(shù)組391.32±31.25101.63±9.27966.12±60.62ab721.82±86.16ab7.45±0.01b0.82±0.16ab74.68±4.69abR/I 組355.61±20.1699.36±11.21606.27±63.62b436.01±37.76b7.43±0.03b1.56±0.21b35.48±12.46bM-Post組364.26±35.27104.32±5.24786.61±56.73a549.62±57.76a7.33±0.04a1.13±0.36a59.52±12.17aLac組354.37±31.7299.28±5.42688.62±61.02ab486.18±34.4ab7.32±0.05a1.52±0.26b46.99±18.02bHyd組363.27±36.6199.88±9.27693.67±43.26ab468.19±36.88ab7.38±0.06b1.14±0.19a58.38±13.72aLac+Hyd組374.18±31.92102.01±6.72779.16±68.71a539.27±56.21a7.32±0.06a1.14±0.16a57.92±15.12a組別　心率（次/min）（n=6）MAP （mmHg）（n=6）+dp/dtmax （mmHg/s）（n=6）-dp/dtmax （mmHg/s）（n=6）PH （n=18）MDA （nmol/mgpro）（n=6）

2.4缺血心肌組織線粒體吸光度 再灌注后3 min 和30 min所取心肌線粒體組織均連續(xù)監(jiān)測(cè)5 min，隨著時(shí)間延長(zhǎng)各組線粒體吸光度值均呈下降趨勢(shì)（表2，3）。結(jié)果顯示各組線粒體吸光度值在各時(shí)間點(diǎn)從低到高依次為R/I 組、Hyd組、Lac組、Lac+Hyd組、M-Post組和Sham組。再灌注3 min后的缺血心肌線粒體組織，在各時(shí)間點(diǎn)Lac和Lac+Hyd吸光度值均顯著高于R/I 組（P ＜0.05），而與M-Post組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Hyd組則顯著低于M-Post組（P＜0.05），且與R/I 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再灌注30 min后的缺血心肌線粒體組織，在各時(shí)間點(diǎn)Lac+Hyd組與M-Post組比較差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Hyd組與R/I 組比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Lac組在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于M-Post組（P＜0.05），且在1 min，3 min和5 min時(shí)同R/I組相似（P＞0.05）。

2.5心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 如圖2所示，Hyd和Lac+Hyd組心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著低于R/I組（10.67%±4.16%，9.50%±1.51% vs. 15.21%± 1.91%，P＜0.05），Lac組與R/I組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（13.97%±2.47% vs. 15.21%±1.91%，P＞0.05）。與M-Post組比較Hyd和Lac+Hyd組與之相似，Lac組則明顯高于M-Post組（P ＜0.05）。

2.6缺血心肌組織Bcl-2/Bax和Caspase-9蛋白表達(dá)水平 如圖3所示，Lac、Hyd和Lac+Hyd組Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著高于R/I組（0.22± 0.03，0.26±0.06，1.06±0.13 vs. 0.02±0.01， P ＜0.05）；Lac+Hyd組與M-Post組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.06±0.13 vs. 1.21±0.35，P＞0.05），Lac組和Hyd組均顯著低于M-Post組（P ＜0.05）。Bax和Caspase-3表達(dá)水平呈相反變化，Lac、Hyd和Lac+Hyd組Bax（1.01±0.16，0.93±0.21，0.41±0.06 vs. 2.40±0.45，P＜0.05）和Caspase-9蛋白（0.67±0.07，0.56±0.14，0.32 ±0.08 vs. 1.48±0.21，P＜0.05）表達(dá)水平均顯著低于R/I組，Lac+Hyd組與M-Post組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Bax: 0.41±0.06 vs. 0.37±0.11， P＞0.05；Caspase-9: 0.32±0.08 vs. 0.35±0.08， P＞0.05），Lac組和Hyd組均顯著高于M-Post組（P ＜0.05）。

2.7心肌細(xì)胞胞漿中Cyt-c 如圖4，Lac、Hyd和Lac+Hyd組心肌細(xì)胞胞漿中Cyt-c含量均顯著低于R/I 組 （3.03±0.46，2.64±0.39，0.76±0.09 vs. 6.69±1.26，P＜0.05）；同M-Post組相比Lac+Hyd組與之相似（0.76±0.09 vs. 0.52±0.18，P＞0.05），Lac組和Hyd組Cyt-c含量均顯著高于M-Post組（P＜0.05）。

3　討論

近年來(lái)我國(guó)溶栓特別是急診介入治療技術(shù)廣泛開展，急性心肌梗死患者病死率大大降低，但再灌注損傷仍是影響療效的重要原因。2003年Zhao等提出的缺血后適應(yīng)是一種減輕再灌注損傷的有效方法，但因后機(jī)械適應(yīng)需要反復(fù)擴(kuò)張和壓迫受累動(dòng)脈，臨床應(yīng)用存在一定風(fēng)險(xiǎn)。所以藥物后適應(yīng)，即使用藥物模擬機(jī)械后適應(yīng)的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，在很大程度上降低機(jī)械后適應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)又起到心臟保護(hù)作用，具有良好的臨床應(yīng)用前景。但目前后適應(yīng)的保護(hù)機(jī)制尚未完全明了，其最上游觸發(fā)因子目前尚不明確，認(rèn)為可能與腺苷、阿片肽、氧自由基和乙酰膽堿等分子有關(guān)。

新近Cohen等［8］提出的酸中毒和適量氧自由基假說(shuō)為此拓寬了思路，認(rèn)為后適應(yīng)的保護(hù)作用緣于mPTP的兩次抑制，即機(jī)械后處理的短暫缺血延長(zhǎng)了局部組織酸中毒，第一次抑制了mPTP的開放，使線粒體和細(xì)胞免于因mPTP的開放而造成損傷，為后續(xù)保護(hù)途徑的激活爭(zhēng)取了時(shí)間；而與此同時(shí)短暫再灌注提供了少量活性氧（ROS），其中部分ROS（主要是超氧負(fù)離子和雙氧水）激活了諸多細(xì)胞保護(hù)分子，而后通過(guò)激活線粒體ATP敏感性鉀通道（mKATP）最終又一次抑制mPTP的開放，從而發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)［8，17，18］。我們既往研究發(fā)現(xiàn)乳酸可有效延長(zhǎng)缺血心肌的局部組織酸中毒，使用低劑量依達(dá)拉奉可抑制大量氧自由基的生成［19］。但依達(dá)拉奉不是選擇性氧自由基清除劑，其有效劑量難以掌握，劑量過(guò)小不能有效清除羥自由基等惡性氧自由基，劑量過(guò)大又會(huì)抑制超氧陰離子和雙氧水等信號(hào)氧自由基，從而破壞其細(xì)胞保護(hù)途徑的激活作用。故如能有效清除羥自由基等惡性氧自由基，又能保持信號(hào)氧自由基的有效濃度，即可激活下游的細(xì)胞保護(hù)途徑。

表2　各組大鼠缺血心肌組織再灌注3 min后線粒體吸光度比較（±s）

表2　各組大鼠缺血心肌組織再灌注3 min后線粒體吸光度比較（±s）

注：與R/I 組比較，aP＜0.05；與M-Post組相比，bP＜0.05

組別0 min0.5 min1 min3 min5 min假手術(shù)組0.39±0.09a0.38±0.06a0.38±0.12a0.38±0.10a0.37±0.12aR/I 組0.31±0.05b0.31±0.12b0.31±0.11b0.30±0.13b0.30±0.12bM-Post組0.38±0.06a0.37±0.09a0.36±0.10a0.36±0.11a0.36±0.13aLac組0.37±0.06a0.36±0.06a0.36±0.12a0.35±0.11a0.35±0.12aHyd組0.32±0.07b0.31±0.06b0.31±0.09b0.31±0.13b0.30±0.12bLac+Hyd組0.37±0.12a0.37±0.06a0.36±0.11a0.36±0.12a0.35±0.11a

表3　各組大鼠缺血心肌組織再灌注30 min后線粒體吸光度比較（±s）

表3　各組大鼠缺血心肌組織再灌注30 min后線粒體吸光度比較（±s）

注：與R/I 組比較，aP＜0.05；與M-Post組相比，bP＜0.05

組別0 min0.5 min1 min3 min5 min假手術(shù)組0.38±0.09ab0.38±0.06ab0.38±0.05ab0.37±0.06a0.37±0.10aR/I 組0.27±0.05b0.27±0.04b0.27±0.08b0.26±0.12b0.26±0.11bM-Post組0.34±0.06a0.35±0.08a0.34±0.07a0.35±0.08a0.34±0.12aLac組0.32±0.06a0.31±0.060.29±0.08b0.28±0.11b0.27±0.14bHyd組0.28±0.07b0.28±0.06b0.28±0.09b0.27±0.09b0.26±0.11bLac+Hyd組0.34±0.07a0.34±0.09a0.34±0.08a0.34±0.09a0.33±0.12a

圖2　各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的檢測(cè)結(jié)果（正常細(xì)胞呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞呈綠色，×400；與R/I 組比較，aP＜0.05；與M-Post組相比，bP＜0.05）

圖3　各組大鼠心肌組織Bcl-2/Bax和Caspase-9蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（與R/I 組比較，aP＜0.05；與M-Post組相比，bP＜0.05）

圖4　各組大鼠心肌細(xì)胞胞漿中Cytc-c表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（與R/I 組比較，aP＜0.05；與M-Post組相比，bP＜0.05）

2007年Ohsawa等發(fā)現(xiàn)氫氣可有效清除羥自由基和過(guò)氧亞硝基陰離子，上述自由基可造成組織損傷，而對(duì)超氧陰離子和雙氧水并無(wú)抑制作用。其后多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)氫氣（氫鹽水）可有效減輕多種屬的再灌注損傷。我們既往研究發(fā)現(xiàn)乳酸模擬機(jī)械后適應(yīng)、延長(zhǎng)酸中毒理論上更接近真實(shí)的生理變化過(guò)程，但對(duì)ROS的生成并無(wú)明顯影響。Hyd組術(shù)后10 min右心房血漿pH值雖低于R/I組，但仍顯著高于M-Post組，說(shuō)明氫飽和鹽水延長(zhǎng)局部組織酸中毒的程度尚未達(dá)到機(jī)械后適應(yīng)的程度。Hyd組MDA和SOD代謝指標(biāo)與M-Post組相似，說(shuō)明氫鹽水可成功模擬后適應(yīng)中適量氧自由基的生成。所以Lac+Hyd組理論上可從延長(zhǎng)酸中毒和生成適量ROS兩方面模擬機(jī)械后適應(yīng)。

mPTP是線粒體內(nèi)外膜上的特殊蛋白復(fù)合體，mPTP開放會(huì)導(dǎo)致線粒體腫脹，繼而細(xì)胞色素c等膜間隙前凋亡因子通過(guò)破損的線粒體外膜釋放至胞漿，引發(fā)細(xì)胞凋亡；如大量mPTP開放，則會(huì)引起細(xì)胞能量合成障礙，直接導(dǎo)致細(xì)胞壞死，故mPTP開放是細(xì)胞最終凋亡和壞死的共同原因。本研究顯示再灌注3 min后所取樣本Lac組、Lac+Hyd組均能有效抑制mPTP的開放，同M-Post組相似，這可能來(lái)源于乳酸延長(zhǎng)了缺血心肌局部組織酸中毒。再灌注30 min后Lac組抑制mPTP能力明顯下降，而Lac+Hyd組還能保持同M-Post組相似的保護(hù)作用，這可能源于氫鹽水有效的抑制了羥自由基等惡性氧自由基，而信號(hào)氧自由基并未抑制，其激活了細(xì)胞保護(hù)途徑，從而有效的抑制了第二次mPTP的開放；Lac組則因?yàn)槿狈ρ踝杂苫宄齽?，生成的大量氧自由基中不乏羥自由基等惡性氧自由基，造成了大量組織的損傷。Bcl-2/Bax是一對(duì)經(jīng)典凋亡調(diào)節(jié)因子，其比例下降會(huì)導(dǎo)致Cyt-c和Caspase-3的上升，從而激活凋亡程序。上述信號(hào)分子的表達(dá)結(jié)果再次證實(shí)了飽和氫鹽水在其中發(fā)揮著決定性的作用，說(shuō)明后適應(yīng)保護(hù)機(jī)制的激活延長(zhǎng)酸中毒和信號(hào)氧自由基的生成缺一不可。

本研究不足之處是未能測(cè)定大鼠缺血心肌組織的PH值，而是使用右心房血漿PH值間接進(jìn)行判斷，另未能直接測(cè)定羥自由基、超氧陰離子和雙氧水的具體濃度，這是本研究的不足之處。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)局部注射乳酸和飽和氫鹽水可較好模擬后適應(yīng)最上游觸發(fā)因子，激活其保護(hù)機(jī)制，有效減少心肌細(xì)胞的凋亡。

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本文編輯：劉暢，田國(guó)祥

Lactic acid and saturated hydrogen saline could attenuate myocardial apoptosis by mimicking ischemic postconditioning

ZHANG Guo-ming*， WANG Xiao-fei， TAN Hong， XU Lin， LI Xiao-yan， ZHAO Chuan-xu.*Department of Cardiology， Jinan Military General Hospital， Jinan 250031， China.

LI Xiao-yan， E-mail: lixiaoyanpaper@126.com

Objective To test the hypothesis that mechanical postconditioning with lactic acid and saturated hydrogen saline could mimic the upstream trigger factor of mechanical postconditioning and relieve cardiomyocytes apoptosis through mitochondrion pathway. Methods 108 rats were randomly divided into 6 groups: sham，reperfusion/injury（R/I）， mechanical postconditioning （M-Post）， lactic acid （Lac，60μl）， saturated hydrogen saline （Hyd， 250μl/kg）， and lactic acid + saturated hydrogen saline （Lac+Hyd， Lactate acid 60μl+ saturated hydrogen saline 250μl/kg）. After 45min of myocardial ischemia， corresponding drugs or mechanical postconditioning were administrated according to groups at the time of reperfusion. After 3 min of reperfusion， PH value of right atrial plasma was measured in all rats. Then the rats were executed at different times. The content of MDA and SOD in ischemic myocardia， the absorbance of mitrochondria with reperfusion after 3 min and 30 min， the expression of Bcl-2/Bax， Caspase-9 Cytochrome c， and cardiomyocytes apoptotic index were detected. Results After 3 min of reperfusion， PH of blood from right atrium in Lac+Hyd group was significantly lower than that in R/I group （7.32 ±0.06 vs. 7.43±0.03，P＜0.05）； the content of MDA was lower（1.14±0.16 nmol/mgpro vs. 1.56±0.21 nmol/ mgpro，P＜0.05） and the content of SOD was higher（57.92±15.12 U/mgpro vs. 35.48±12.46 U/mgpro，P＜0.05） than those in R/I group. The absorbance of mitrochontria with reperfusion after 3 min and 30 min in Lac+Hyd group were all significantly higher than those in R/I group（P＜0.05）. The expression level of Bcl-2 in ischemic cardiomyocytes in Lac+Hyd group was significantly higher than R/I group （1.06±0.13 vs. 0.02± 0.01， P＜0.05）， the level of Bax （0.41±0.06 vs. 2.40±0.45， P＜0.05）， Caspase-9（0.32±0.08 vs.1.48±0.21， P ＜0.05） and Cyt-c （0.76±0.09 vs. 6.69±1.26， P＜0.05） were all lower than those in R/I group. Apoptotic index of Lac+Hyd group was much lower than that of R/I group （9.50%±1.51% vs. 15.21%±1.91%， P＜0.05）. At the sametime， all above variables of Lac+Hyd group were not significant different than those of M-Post group（P＞0.05）. Conclusion Lactic acid and saturated hydrogen asline could mimic the upstream trigger factor of mechanical postconditioning and attenuate cardiomyocytes apoptosis through mitochondrion pathway.

Reperfusion injury； Mitochondria； Pharmacological postconditioning； Lactic acid； Hydrogen saline

R541.4

A

1674-4055（2016）05-0533-06

濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院院長(zhǎng)基金（2014Q01）

1250031 濟(jì)南，濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科；2250031 濟(jì)南，濟(jì)南軍區(qū)聯(lián)勤部門診部

李曉燕，E-mail:lixiaoyanpaper@126.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.05.07