妊娠對孕婦外周血IGH-CDR3免疫組庫的影響

郭昌龍 杜 蒙,2 王啟迪 曹小芳 楊 英 蔡瑞琨 安莉莎 邱 月,2 劉 昕,3 彭左旗 王興宇,3 馬 旭,2*

1.國家衛(wèi)生計生委科學技術研究所(北京，100081)； 2.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院；3. 北京高血壓聯(lián)盟研究所

·基礎研究·

妊娠對孕婦外周血IGH-CDR3免疫組庫的影響

郭昌龍1杜 蒙1,2王啟迪1曹小芳1楊 英1蔡瑞琨1安莉莎1邱 月1,2劉 昕1,3彭左旗1王興宇1,3馬 旭1,2*

1.國家衛(wèi)生計生委科學技術研究所(北京，100081)； 2.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院；3. 北京高血壓聯(lián)盟研究所

目的：探討妊娠期女性外周血中IGH-CDR3序列的多樣性與免疫學特性。方法：分離9例正常妊娠末期和7例非妊娠期女性外周血淋巴細胞，逆轉錄為cDNA ARM-PCR擴增H鏈CDR3區(qū)序列，高通量測序后通過與IMGT數據庫對比，揭示妊娠期IGH-CDR3免疫組庫的多樣性及免疫學特征。結果：妊娠期女性外周血IGH-CDR3 的數目和種類均小于非妊娠女性；妊娠期女性有獨特的免疫學特性，包括IGH-CDR3 長度、N末端堿基的添加數、V區(qū)域使用偏好基因及末端去除的堿基數；一些CDR3肽段在妊娠期女性中特有表達。結論：妊娠會降低孕婦外周血循環(huán)中B細胞的數量和種類并使IGH-CDR3區(qū)的免疫學特性發(fā)生變化。

妊娠； 免疫組庫； IGH-CDR3

妊娠期間，母體免疫系統(tǒng)的適度調節(jié)對妊娠成功至關重要，隨著胎兒的生長發(fā)育，其自身免疫系統(tǒng)逐漸成熟，分泌的細胞因子可干擾母體免疫系統(tǒng)[1-2]。母體的免疫系統(tǒng)發(fā)生一系列的調整以維持妊娠：①隨著妊娠的進行，母體分泌的Th1型細胞因子不斷下降，Th2型細胞因子不斷增加，最終形成免疫功能由Th1 型向Th2型轉變，細胞免疫功能受抑制而體液免疫功能占優(yōu)勢[3-4]；②HLA-G、HLA-E分子表達增加，并通過抑制NK細胞和CD8+T淋巴細胞功能產生機體對妊娠的免疫耐受[5-7]；③ Th17細胞比例下降、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例增高，以抑制細胞免疫功能并維持免疫耐受狀態(tài)[8-9]等。妊娠過程中B細胞也會發(fā)生一些調整[10]，如母體分泌一些特殊抗體以保護胎盤組織免受母體免疫系統(tǒng)的攻擊[11]，調節(jié)性B細胞可通過分泌IL-10抑制Th1型細胞功能以維持免疫耐受[12]，而一些自身抗體的異常表達，如AT1-AA[13-14]，可以誘導先兆子癇的發(fā)生。妊娠對B細胞免疫學特性的研究目前尚無報道，本研究利用高通量測序技術對妊娠末期和未妊娠女性外周血免疫球蛋白重鏈-互補決定區(qū)3(IGH-CDR3)的多樣性與免疫學特性進行研究，為進一步揭示妊娠對母體免疫系統(tǒng)的影響提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究選取的外周血標本均從北京婦產醫(yī)院獲得。正常妊娠末期女性入選標準：孕>39周，正常待產，無妊娠期疾病及感染史；無家族遺傳病史及血液病史；B超顯示胎兒發(fā)育正常，無先天畸形。非妊娠健康女性是年齡、籍貫與妊娠孕婦匹配的志愿者。本研究嚴格遵守赫爾辛基宣言，所有血液標本的取得均簽署了知情同意書，并經北京婦產醫(yī)院與本所倫理委員會通過。

1.2 實驗程序

1.2.1 PBMC分離 采集每個研究對象的外周靜脈血8ml，肝素鈉抗凝， Ficoll法分別分離出淋巴細胞，細胞重懸于RNA保護液并凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取 采用Qiagen公司試劑盒，離心柱法。

1.2.3 ARM-PCR擴增 取1μg total RNA逆轉錄為cDNA， 用iRepertoire公司HBHI-M的引物試劑盒對IGH重鏈區(qū)域進行兩步PCR擴增反應，第一步擴增反應條件：50℃ 40min；95℃ 15min；94℃ 30s，63℃ 2min，72℃ 30s，15cycle；94℃ 30s，72℃ 2min，10cycle；72℃ 10min。第一步PCR結束后取2ul反應產物作為第二步PCR的模板，反應條件：95℃ 15min；94℃ 30s，72℃ 90s，30cycle；72℃，5min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，切下490-570bp大小的片段做膠回收。

1.2.4 高通量測序 回收產物定量后用二代測序儀Miseq進行測序反應。

1.3 生物信息學分析

將測得的原始測序數據上傳至iRepertoire公司網站，由專業(yè)生物信息人員進行統(tǒng)計分析。具體步驟包括：①去除掉數據中的冗余序列、短片段序列及測序質量差的序列；②將數據與公共數據庫IMGT(http://www.imgt.org/)進行比對查詢，根據IGH-CDR3區(qū)域V、J、D各區(qū)段的特點鑒定出各個樣本的CDR3肽段序列；③統(tǒng)計各樣本的免疫學特征。

2 結果

2.1 樣本基本信息

9例正常妊娠末期孕婦和7例未妊娠健康女性的一般情況和樣本基本信息見表1。

表1 研究標本基本信息

2.2 樣本擴增情況

16例樣本均擴增出外周血IGH-CDR3免疫組庫，結果顯示妊娠末期孕婦外周血IGH-CDR3 read數目和種類均低于未妊娠健康女性(CDR3數目：2.06×106/3.63×106；CDR3種類：9.34×103/5.86×104。見圖1-A、1-B)。

A：IGH-CDR3總數比較；B：unique IGH-CDR3總數比較；C：IGH-CDR3長度比較；D：N末端添加的堿基數比較；E：J區(qū)域末端去除堿基數比較；F：J區(qū)域基因使用頻率比較；G：V區(qū)域末端去除堿基數比較；H：V區(qū)域基因使用頻率比較

圖1 正常妊娠末期孕婦與未妊娠健康女性外周血IGH-CDR3免疫學特性的比較

2.3 IGH-V、J基因亞家族的使用偏好性和其他免疫學特征

與未妊娠女性對比，妊娠末期女性外周血B細胞的免疫學特性發(fā)生一些變化，具體表現(xiàn)為：CDR3區(qū)域的長度33bp(13個氨基酸)和45bp(15個氨基酸)的利用率高于未妊娠女性(圖1C)；N末端添加的堿基數從0到40bp呈高斯分布， N末端添加的堿基數比未妊娠女性平均增加2～3個堿基(頻率最高的堿基數由12、13個堿基增加為14、15個堿基，見圖1D)；二者在J基因末端去除的堿基數上也有不同，未妊娠女性去除的堿基數更多集中在0-5bp范圍內，而妊娠女性去除的堿基數更偏向于6-15bp(圖1E)；J基因使用頻率妊娠女性使用J3、J4亞基因較多，未妊娠女性J6基因使用頻率較多，但二者間的差異無統(tǒng)計學意義(圖1F)；V基因末端去除的堿基數二者沒有明顯規(guī)律性，妊娠女性去除頻率較高的堿基數分別為0bp、3bp、5bp、7bp(圖1G)；妊娠女性較少使用V1、V2基因家族，而偏好使用V3家族的亞基因，尤其是V3-7、V3-9、V3-11、V3-234個亞基因的使用頻率遠遠高于未妊娠女性(圖1H)。

2.4 妊娠對IGH-CDR3肽段的影響

IGH-CDR3序列是BCR分子與抗原結合的主要部分，決定了B細胞與抗原結合的特異性和強度，為了研究妊娠對外周B細胞功能的影響，分別對獲取樣本IGH-CDR3肽段數據進行會聚研究，建立了妊娠期與非妊娠期女性外周血IGH-CDR3數據庫。結果顯示在未妊娠7例樣本共表達了3112種不同的肽段，其中肽段AREDY在全部7例樣品中均有表達，肽段ARGLDY、AKDRSRTYLYDSSGYDY在6例樣品中表達；而在9例妊娠樣品中，共有186種肽段表達，其中樣品間共享頻率最高的肽段ARVCRGHNSCYFDS在5例樣品中表達，肽段VTVPRIGTAY在4例樣品中表達，其余的肽段共享頻率均較低。由此可見妊娠末期的女性間共同表達的肽段顯著少于未妊娠女性，但是肽段ARVCRGHNSCYFDS、VTVPRIGTAY在7例未妊娠女性中均未找到，所以這兩個肽段是否是妊娠期女性獨有的肽段尚需進一步的研究。

3 討論

高通量測序技術的出現(xiàn)為生命科學的研究提供了巨大便利。本研究首次利用高通量測序技術對末期妊娠女性外周血IGH-CDR3免疫組庫進行了篩查，并通過與未妊娠女性對比，揭示妊娠對女性IGH-CDR3免疫特性的影響。本研究顯示，妊娠使女性IGH-CDR3的免疫學特性發(fā)生了一些變化，包括N末端添加的堿基數平均增加2-3bp、J基因末端去除更多的堿基、更偏好使用V3基因家族的亞基因等等，這些改變的具體機制尚未清楚，推測這可能與母體細胞免疫受到抑制、TH2型免疫占優(yōu)勢、Treg細胞以及調節(jié)性B細胞表達量增高有密切關系。另外肽段ARVCRGHNSCYFDS、VTVPRIGTAY在妊娠末期女性中表達的頻率較高，而在未妊娠7例女性中并未發(fā)現(xiàn)這2個肽段表達，提示其與妊娠有密切關系，但具體作用需要更進一步的研究。本研究發(fā)現(xiàn)妊娠女性外周血中循環(huán)CDR3總數和種類均顯著低于未妊娠女性，而且評價機體免疫能力的重要指標CDR3種類和總數也顯著低于未妊娠女性，表明妊娠期女性體液免疫總體上處于抑制狀態(tài)。當然由于妊娠期平均血容量增加造成的血液稀釋也會對循環(huán)CDR3數量和種類有一定影響，妊娠期孕婦平均增加1400～1500ml血容量，約多出全部血容量45%[15-17]。但是由于在本研究中無論妊娠女性與未妊娠女性均選取等量的外周血淋巴細胞RNA(1ug)進行研究，所以即使考慮到血容量增加的因素，妊娠期女性的CDR3總數、種類也相對少于未妊娠女性。

綜上所述，本研究利用ARM-PCR擴增與高通量測序技術成功地揭示了妊娠對女性IGH-CDR3多樣性和免疫學特性的影響，為全面揭示免疫耐受在妊娠過程中的作用和機制提供了重要的基礎。

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[責任編輯：董 琳]

Effect of pregnancy on IGH-CDR3 immunerepertoire in peripheral blood of pregnant women

GUO Changlong, DU Meng, WANG Qidi, CAO Xiaofang，YANG Ying， CAI Ruikun，AN LiSha，QIU Yue，LIU Xing，PENG Zuoqi，WANG Xingyu，Ma Xu

1.National Research Institute for Family Planning, Beijing 100081; 2.Peking Union Medical College; 3.Beijing hypertension league institute

*Corresponding author：Ma Xu, Email: xumagroup@163.com

Objective: To investigate the diversity and immunological characteristics of IGH-CDR3 in peripheral blood of pregnant women. Methods: In order to know the diversity and immunological characteristics of IGH-CDR3 of pregnant women, circulating lymphocyte was separated from peripheral blood of 9 pregnant and 7 non-pregnant women, cDNA was reversed from RNA, IGH-CDR3 region was amplified by ARM-PCR, the corresponding PCR products were sequenced using high-throughput sequencing and then blasted with the IMGT database. Results: The number and species of IGH-CDR3 in pregnant women were much lower than that of non-pregnant women. But pregnant women have unique immunological characteristics, which including IGH-CDR3 length, number of N addition and V removal, usage bias of V gene. Some CDR3 peptides were exclusively expressed in pregnant women. Conclusion: Pregnancy can reduce the number and variety of B cells in peripheral blood of women, and the immunological characteristics of IGH - CDR3 district has changed during pregnancy.

Pregnancy; Immunerepertoire; IGH-CDR3

國家國際科技合作專項項目(2012DFB30130)、國家自然科學基金(81501418)

2016-03-22

2016-04-08

10.3969/j.issn.1004-8189.2016.05

*通訊作者：xumagroup@163.com