大黃素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠急性肝衰竭

王鳳玲　金　茜　于　盈　毛娟娟　侯　偉　陳永平.浙江省臺州市立醫(yī)院感染科，浙江臺州　38000；.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，浙江溫州　35000

大黃素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠急性肝衰竭

王鳳玲1金茜1于盈1毛娟娟1侯偉1陳永平2
1.浙江省臺州市立醫(yī)院感染科，浙江臺州318000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，浙江溫州325000

目的探討大黃素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對急性肝衰竭大鼠的治療作用。 方法選擇SD大鼠51只，隨機(jī)分4組：健康對照組6只，急性肝衰竭（ALF）模型組15只，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）組15只，大黃素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（EMD+BMSCs）組15只。D-氨基半乳糖（D-GalN）誘導(dǎo)大鼠急性肝衰竭模型；BMSCs組及EMD+ BMSCs組于造模后12 h尾靜脈注射BMSCs懸液1.5 mL（約含BMSCs1.0×106cells/mL），共1次；EMD+BMSCs組于造模后12 h開始腹腔注射大黃素10 mg/kg，每天2次，共3 d。ALF模型組于造模后12 h尾靜脈注射等體積無菌PBS。各組大鼠均在造模后72 h，以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取門靜脈血及肝組織標(biāo)本。測血清ALT、AST、TBil，免疫組化測肝組織Bcl-2、Bax及PCNA蛋白表達(dá)。結(jié)果造模后72 h，ALF模型組大鼠血清ALT、AST 和TBil指標(biāo)顯著升高，與健康對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.191、6.796、6.835，P均＜0.05）。與ALF模型組比較，BMSCs組及EMD+BMSCs組血清ALT、AST、TBil均有不同程度下降，以EMD+BMSCs組為著。EMD+BMSCs組中Bcl-2、PCNA表達(dá)明顯高于健康對照組及ALF模型組，而Bax表達(dá)則顯著低于ALF模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.557，P＜0.05）。 結(jié)論大黃素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療對急性肝衰竭大鼠肝功能的改善及促進(jìn)肝細(xì)胞再生作用更佳，此種作用可能部分與Bcl-2/Bax的調(diào)節(jié)有關(guān)。

大黃素；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；肝功能衰竭；Bcl-2；Bax；

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）是多種病因引起的一種肝功能急劇喪失的臨床重癥。其治療的關(guān)鍵在于減少肝細(xì)胞壞死和刺激肝細(xì)胞再生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種來源廣泛、免疫原性低、具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞［1］，因其強(qiáng)大的可塑性，且能在體外分化為包括肝細(xì)胞在內(nèi)的多種成體細(xì)胞，有望成為各種組織損傷或器官衰竭的替代療法［2-4］。既往研究表明，BMSCs對肝硬化及肝衰竭有一定的治療作用［5，6］。大黃素（emodin，EMD）為大黃的一種主要有效成分，具有抑制腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、肝保護(hù)等作用［7-9］。本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠急性肝衰竭模型，尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)腹腔注射大黃素，觀察兩者聯(lián)合治療對急性肝衰竭大鼠的影響及相關(guān)機(jī)制。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物清潔級健康雄性SD大鼠共51只，重200 g左右，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供［許可證號：SYYK（浙）2010-0150］。

1.1.2儀器和試劑全自動生化分析儀、D-氨基半乳糖（D-GalN）、大黃素分別由日本日立公司、重慶醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室、蘇州寶澤堂醫(yī)藥科技有限公司提供。胎牛血清、低糖DMEM購自Hyclone公司。Percoll分離液、免疫組化試劑盒分別購自美國Sigma公司和北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Bcl-2、Bax、PCNA一抗購自美國Santa Cruze公司。

1.2方法

1.2.1動物分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法分為四組：健康對照組、急性肝衰竭（ALF）模型組、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）組、大黃素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)（EMD+BMSCs）組。健康對照組6只，其余各組每組15只，各組大鼠均在造模后72 h，采集肝組織標(biāo)本和肝門靜脈血。各組大鼠均予正常飲食，術(shù)前禁飲4 h，禁食12 h。

1.2.2BMSCs分離培養(yǎng) 無菌條件下分離SD大鼠股骨，去除軟組織。在無菌操作臺取出完整股骨和脛骨，切除股骨和脛骨兩端，DMEM（低糖）培養(yǎng)基沖出骨髓，輕輕混勻，使充分散開。采用Percoll（密度為1.073）梯度離心方法（2500 rmp，25 min），用滴管小心取得中間絮狀層，DMEM洗滌2次（1000 rmp，5 min），含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1 d后予以首次半量換液，然后每隔3 d換新鮮的DMEM液。于細(xì)胞鋪滿瓶底近80%時(shí)，予以傳代。在傳至第3代時(shí)，完全去除非貼壁的球形骨髓造血細(xì)胞，得到純化的BMSCs。然后每次均于細(xì)胞接近80%鋪滿瓶底時(shí)再傳代，細(xì)胞濃度為1.0×106/mL時(shí)移植。

1.2.3動物處理 健康對照組腹腔注射生理鹽水，其余各組大鼠給予10%D-GalN 1.25 g/kg腹腔注射1次。BMSCs組及EMD+BMSCs組于造模后12 h尾靜脈注射BMSCs懸液 1.5 mL（約含BMSCs1.0×106/mL），共1次；EMD+BMSCs組于造模后12 h開始腹腔注射大黃素10 mg/kg，每天兩次，共3 d。ALF模型組于造模后12 h尾靜脈注射等體積無菌PBS。各組大鼠均在造模后72 h，用水合氯醛（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1）腹腔注射麻醉，在無菌條件下收取3～5 mL門靜脈血，獲取離心后的上清液，放-80℃冰箱保存；另留取大鼠肝組織，予甲醛（體積分?jǐn)?shù)為0.04）固定。

1.2.4測定肝臟功能 采集的門靜脈血清標(biāo)本，用日本日立公司提供的全自動生化分析儀（型號7600-010）檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine animotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate animotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）和血白蛋白（albumin，Alb）。1.2.5肝組織標(biāo)本HE染色 取肝組織，予以石蠟包埋，切片4 μm，蘇木精-伊紅染色，置光學(xué)顯微鏡下觀察。1.2.6肝組織Bcl-2、Bax及PCNA蛋白檢測石蠟切片脫蠟復(fù)水，3%過氧化氫室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡，5%～10%正常山羊血清封閉。滴加一抗，4℃過夜。PBS沖洗，滴加適量生物素標(biāo)記工作液、堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，每次滴加后均予37℃孵育10～30 min，PBS沖洗，然后顯色劑顯色、自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。陰性對照中以PBS代替一抗，免疫組化染色，陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核呈棕黃色。經(jīng)Image-ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定肝組織平均光密度OD值［積分光密度（IOD SUM）/組織面積（Area SUM）］，代表蛋白表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料多組間比較用單因素方差分析，Levene法檢驗(yàn)方差齊性，方差齊時(shí)多樣本均數(shù)之間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血清ALT、AST、TBil和Alb的數(shù)值

數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，各組同一指標(biāo)數(shù)據(jù)之間的方差具有齊性（F=118.73、124.28、84.35和73.33，P均＜0.05），故各組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。ALF模型組大鼠血清ALT、AST和TBil在造模后72 h均有升高，與健康對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.009、0.004、0.021，P均＜0.05）；BMSCs組血清 ALT、AST和TBil較ALF模型組有所下降（P=0.012、0.011和0.027，P均＜0.05），而EMD+BMSCs組較ALF模型組下降更為顯著（P=0.001、0.000和0.003，P均＜0.01），EMD+BMSCs組較BMSCs組對ALT及AST的改善作用更加（P=0.032和0.021，P均＜0.05）；ALF模型組Alb較健康對照組明顯下降（P=0.028，P＜0.05），BMSCs組及EMD+BMSCs組高于ALF組（P=0.043、0.036，均P＜0.05），而BMSCs組與EMD+BMSCs組無明顯差異（P=0.253，P＞0.05），見表1。

表1　各組大鼠血清ALT、AST和TBil水平變化（）

表1　各組大鼠血清ALT、AST和TBil水平變化（）

注：ALT：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；TBil：總膽紅素；Alb：血白蛋白。各組與健康對照組相比，aP＜0.05；BMSCs組、EMD+BMSCs組與ALF模型組相比，bP＜0.01，cP＜0.05；EMD+BMSCs組與BMSCs組相比，dP＜0.05，eP＞0.05

組別　n　ALT （U/L）AST （U/L）TBil （μmol/L）Alb （g/L）健康對照組ALF模型組BMSCs組EMD+BMSCs組F值P值6 15 15 15 24.5±3.2 1206.3±193.7a528.0±77.4ac296.7±34.4abd118.73 0.016 49.6±9.1 1537.2±159.3a716.7±154.7ac468.4±50.8abd124.28 0.062 7.1±2.3 31.6±6.2a9.6±9.1c7.6±3.1be84.35 0.027 38.6±5.2 29.9±6.4a32±7.2c33±5.8ce73.33 0.011

2.2肝組織病理學(xué)改變

健康對照組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)完整，ALF模型造模后72 h，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，可見大片壞死肝細(xì)胞。表明已成功建立急性肝衰竭模型。見圖1、2。

圖1　正常大鼠肝組織（蘇木素-伊紅染色，×400）

圖2　ALF大鼠肝組織（蘇木素-伊紅染色，×400）

2.3免疫組化法檢測肝臟Bcl-2、Bax及PCNA蛋白的表達(dá)

Bcl-2、Bax及PCNA數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，各組之間的方差具有齊性（F=115.75、132.72和66.87，P均＜0.05），故各組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。ALF模型組肝組織Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax蛋白表達(dá)升高，與健康對照組比較差異顯著（P=0.029、0.014，P均＜0.05）；與ALF模型組比較，BMSCs組與EMD+BMSCs 組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加（P=0.005、0.000，P均＜0.01），Bax蛋白表達(dá)下降 （P=0.031、0.025，P均＜0.05）；BMSCs組與EMD+BMSCs組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Bcl-2、Bax蛋白在肝組織內(nèi)表達(dá)見表2。正常組PCNA蛋白表達(dá)很少，ALF模型組肝組織PCNA表達(dá)較正常組升高 （P=0.035，P＜0.05），BMSCs組及EMD+ BMSCs組較ALF模型組變化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026、0.005，P均＜0.05）。見表2、3。

表2　各組大鼠肝組織Bcl-2和Bax水平變化（）

表2　各組大鼠肝組織Bcl-2和Bax水平變化（）

注：各組與健康對照組相比，aP＜0.01，bP＜0.05；各治療組與ALF模型組相比，cP＜0.01，dP＜0.05；EMD+BMSCs組與BMSCs組相比，eP＞0.05

組別　n　Bcl-2　Bax健康對照組ALF模型組BMSCs組EMD+BMSCs組F值P 6 15 15 15 0.084±0.007 0.047±0.003b0.195±0.012ac0.211±0.014ace115.75 0.031 0.071±0.007 0.119±0.025b0.084±0.014d0.079±0.011de132.72 0.023

表3　各組大鼠肝組織PCNA水平變化（）

表3　各組大鼠肝組織PCNA水平變化（）

注：PCNA：增殖細(xì)胞核抗原。各組與健康對照組相比，aP＜0.01，bP＜0.05；各治療組與ALF模型組相比，cP＜0.01，dP＜0.05；EMD+BMSCs組與BMSCs組相比，eP＜0.05

組別　n　PCNA健康對照組ALF模型組BMSCs組EMD+BMSCs組F值P 6 15 15 15 0.054±0.007 0.101±0.032b0.155±0.031ad0.197±0.043ace66.87 0.045

3　討論

急性肝衰竭（ALF）是由多種因素所引起的一種嚴(yán)重肝臟損害，臨床以凝血機(jī)制異常、黃疸、肝性腦病和腹水等為主要表現(xiàn)，病程進(jìn)展快、病死率高、預(yù)后差，其治療仍是世界性難題［10］。原位肝移植是最根本的治療方法，但因供體缺乏、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高、高額的醫(yī)療費(fèi)用以及移植排斥反應(yīng)，極大限制了肝移植的臨床應(yīng)用［11］。近年來細(xì)胞移植開始作為肝移植的輔助或替代療法，成為治療肝衰竭研究的熱點(diǎn)［12］。BMSCs是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，BMSCs不但能分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，還能在肝臟微環(huán)境中分化為膽管細(xì)胞和肝細(xì)胞，幫助修復(fù)損傷的肝細(xì)胞，最終達(dá)到改善肝功能的目的［13-15］，使干細(xì)胞移植成為急性肝衰竭治療新的手段。

本研究表明，BMSCs移植后，急性肝衰竭大鼠血清ALT、AST及TBil較ALF模型組下降，說明BMSCs對急性肝衰竭大鼠肝功能具有保護(hù)作用。BMSCs可能分化形成正常肝細(xì)胞，補(bǔ)充肝細(xì)胞數(shù)量，改善肝功能，或者分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，以抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞再生。本實(shí)驗(yàn)中將BMSCs經(jīng)尾靜脈注射，其遷移并定位至肝臟需要一定的時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)只觀察72 h，故BMSCs通過分化成正常肝細(xì)胞，補(bǔ)充肝細(xì)胞數(shù)量而改善肝功能可能性不大，考慮肝功能的改善作用可能與BMSCs遷移至肝臟時(shí)，首先通過分泌細(xì)胞因子及生長因子，從而刺激和修復(fù)損傷的肝細(xì)胞有關(guān)［16］。

增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的合成與細(xì)胞的增殖有著密切的關(guān)系，其含量的多少直接反映細(xì)胞的增殖活性，是評價(jià)肝臟細(xì)胞再生的重要指標(biāo)。既往研究表明，大黃素可以增加急性肝衰竭大鼠肝組織PCNA的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生［17］。本實(shí)驗(yàn)中各治療組肝組織PCNA表達(dá)較ALF模型組明顯增加，而EMD+BMSCs組促進(jìn)肝細(xì)胞的再生作用最強(qiáng)，表明EMD+BMSCs聯(lián)合治療的優(yōu)勢。

大黃素可以抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活，減少核因子-κb、腫瘤壞死因子-α、白介素-10等致炎因子的釋放。通過抑制免疫細(xì)胞激活及細(xì)胞因子釋放而發(fā)揮抗炎作用。減少損傷肝組織的Kupffer細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的浸潤，減輕肝細(xì)胞壞死，保護(hù)肝細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)以D-GalN誘導(dǎo)大鼠急性肝衰竭模型，發(fā)現(xiàn)BMSCs移植后，可以降低急性肝衰竭大鼠血清ALT、AST及TBil水平，而EMD+BMSCs組效果更佳，推測可能與大黃素減少內(nèi)毒素吸收入血，減輕內(nèi)毒素血癥有關(guān)［18］。同時(shí)大黃素能抑制由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNF-α等相關(guān)炎癥因子的分泌，減輕肝臟炎癥反應(yīng)［19］。

Bcl-2家族是近年來研究較多的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，許多研究顯示肝細(xì)胞是否發(fā)生凋亡受Bcl-2家族的調(diào)控。Bcl-2的上調(diào)可通過抑制肝細(xì)胞凋亡而減輕肝細(xì)胞的纖維化程度［20］。而Bax是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白。大黃素能抑制抗凋亡蛋白（Bcl-2）和促進(jìn)促凋亡蛋白（Bax）的表達(dá)，增加細(xì)胞凋亡［21］。而BMSCs能促進(jìn)人肺泡上皮細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡［22］。本研究中，ALF模型組肝組織內(nèi)Bcl-2表達(dá)較健康對照組減少，Bax表達(dá)增加，說明肝細(xì)胞凋亡增加；與ALF模型組比較，BMSCs組及EMD+BMSCs組肝組織Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加，Bax蛋白表達(dá)下降，EMD+BMSCs組Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)與BMSCs組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明聯(lián)合治療中大黃素并沒有抵消BMSCs的抗凋亡作用，而是具有協(xié)同作用，更好地保護(hù)肝細(xì)胞。

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Combined therapy of emodin and bone marrow mesenchymal stem cells transplantation for rat model of acute liver failure

WANG Fengling1JIN Qian1YU Ying1MAO Juanjuan1HOU Wei1CHEN Yongping2
1.Department of Infection and Liver Disease，Taizhou Municipal Hospital，Taizhou318000，China；2.Department of Infection and Liver Disease，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou325000，China

Objective To evaluate synergic effects of emodin combined with bone marrow mesenchymal stem cells transplantation in liver injury following acute liver failure（ALF）in rats.Methods 51 SD rats were divided into four groups.There were six rats in normal group and forty five in model group of ALF.The model of ALF（including ALF group，BMSCs group，EMD+BMSCs group，with each of 15 rats）was induced in rats by D-galactosamine（D-GalN）successfully.Rats in BMSCs group&EMD+BMSCs group were treated with injection of 1.5 mL of suspension liquid of BMSCs（including BMSCs 1.0×106/mL）via caudal vein 12 h after model establishment.The sera and hepatic tissue samples were collected at 72 h after D-GalN injection.The sera were used for detecting ALT，AST and TBil.Bcl-2 and Bax in hepatic tissue samples were detected by S-P immunohistochemical staining.Results The levels of ALT，AST and TBil in model group of ALF at 72 h were significantly higher than those in normal group，and the levels of ALT，AST and TBil in every treated group were significantly reduced，especially in group EMD+BMSCs.The levels of Bcl-2 and PCNA in group EMD+BMSCs were significantly higher than those in normal and model group.The levels of Bax in group EMD+BMSCs were lower than model group.Conclusion EMD combined BMSCs are more effective to protect rats against acute liver failure，which is partly by means of down-regulating Bax expression and up-regulating Bcl-2 expression in liver tissue.

Emodin；BMSCs；Liver failure；Bcl-2；Bax

R575.3

A

1673-9701（2016）14-0023-04

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計(jì)劃（2010ZA118）；浙江省臺州市椒江區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（112070）