阿魏酸對(duì)脂多糖損傷的PC12細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用

黃　浩，馬增春，王宇光，高　月（1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 10014；.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

阿魏酸對(duì)脂多糖損傷的PC12細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用

黃浩1，2，馬增春2，王宇光2，高月2
（1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

目的 探討阿魏酸（FA）對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。方法 體外實(shí)驗(yàn)：FA 2.5～40 μmol·L-1與PC12細(xì)胞預(yù)處理12 h，加入LPS 0.15 g·L-1繼續(xù)培養(yǎng)8 h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（IL-1β）的釋放；激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞骨架蛋白F肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：FA 25，50和100 mg·kg-1ip給予SD大鼠，每天1次，連續(xù)35 d。給藥第29天時(shí)ip給予LPS 0.2 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)7 d，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法觀察大鼠海馬神經(jīng)元磷酸二酯酶4B（PDE4B）蛋白表達(dá)的變化；Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）和磷酸化CREB（p-CREB）表達(dá)。結(jié)果 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：與LPS組細(xì)胞比較，F(xiàn)A 10，20和40 μmol·L-1預(yù)處理組細(xì)胞活力明顯升高（P＜0.05），炎性因子TNF-α和IL-1β的釋放顯著減少（P＜0.05），細(xì)胞骨架蛋白F肌動(dòng)蛋白的分布和結(jié)構(gòu)明顯改善。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：HE染色結(jié)果顯示，預(yù)先給予FA 50和100 mg·kg-1可以減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元損傷；免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)A 50和100 mg·kg-1能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元PDE4B蛋白表達(dá)水平的升高（P＜0.05）；Western蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)A 50和100 mg·kg-1可逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)CREB和p-CREB蛋白表達(dá)的抑制作用（P＜0.05）。結(jié)論 FA對(duì)LPS誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，F(xiàn)A抗神經(jīng)炎癥的作用可能與抑制PDE4表達(dá)、激活cAMP/CREB信號(hào)通路相關(guān)。

阿魏酸；磷酸二酯酶4B；脂多糖；cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.04.005

阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）是當(dāng)歸、川芎和升麻等中藥的有效成分之一，具有抑制炎癥介質(zhì)形成和釋放、疏通微循環(huán)和改善血液流變的作用，還可改善免疫功能、清除和抑制自由基等［1］。FA可以透過(guò)血腦屏障，提高腦組織超氧化物歧化酶活性，顯著降低丙二醛含量，通過(guò)抗氧化應(yīng)激的作用發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用［2-5］。FA對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷有一定程度的保護(hù)作用，對(duì)于β淀粉樣前體蛋白/早老素轉(zhuǎn)基因小鼠也具有保護(hù)作用［6］，并能夠破壞已形成的β-樣淀粉小纖維，減緩阿爾茨海默病的病理過(guò)程［7］，從而改善阿爾茨海默病的癥狀。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A可以拮抗β-淀粉樣蛋白所致的神經(jīng)細(xì)胞毒性、細(xì)胞內(nèi)活性氧升高以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，F(xiàn)A可以逆轉(zhuǎn)神經(jīng)炎癥等引起的小鼠記憶缺失，升高羰基蛋白水平，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷［8-9］。本研究利用脂多糖（lipopolysaccha?rides，LPS）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的體外模型以及ip給予LPS導(dǎo)致大鼠皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元損傷的體內(nèi)模型，探討FA對(duì)LPS所致神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1　材料與方法

1.1藥物、細(xì)胞、試劑和儀器

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用反式FA為白色粉末（相對(duì)分子質(zhì)量為194.18），由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，純度＞99.6%，用二甲亞砜溶解，配置成100 mmol·L-1的母液，用時(shí)加RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用FA和LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，前者用二甲亞砜溶解配置成100 mmol·L-1的母液，后者用PBS溶解為3.125 g·L-1母液，用時(shí)加RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。PC12細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心提供。RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清購(gòu)自新西蘭Gibco公司；CCK-8測(cè)定試劑盒購(gòu)自同仁化學(xué)研究所；大鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽購(gòu)自上海Invitrogen公司；核蛋白提取試劑盒和BCA蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；磷酸二酯酶4B （phosphodiesteras 4B，PDE4B）（H-56）抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；抗cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）抗體和磷酸化CREB（phospho-CREB，p-CREB）（Ser133）抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自柏奧易杰北京科技有限公司。KD-BM生物組織包埋機(jī)（中國(guó)科迪儀器），RM2016輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），Nikon E200光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司），UltraVIEWVoX Confocal Imaging System激光共聚焦顯微鏡（美國(guó)PerkinElmer公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞按其培養(yǎng)要求接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%滅活胎牛血清和5%馬血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中加入100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素（1%），置于37°C，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。將PC12用含2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至1×108L-1細(xì)胞，接種于6孔板或96孔板培養(yǎng)24 h，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活

FA單用對(duì)PC12細(xì)胞存活的影響：將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組（0.1%DMSO）和FA 2.5，5.0，10，20和40 μmol·L-1組，每組5孔，每孔200 μL。待細(xì)胞貼壁并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按照分組換液，培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，37°C孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處每孔的吸光度值（A450 nm）。細(xì)胞存活率（%）=藥物處理組A450 nm/正常對(duì)照組A450 nm×100%。

FA對(duì)LPS損傷的PC12細(xì)胞存活的影響：將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、LPS對(duì)照組和LPS+FA 2.5，5.0，10，20和40 μmol·L-1組。FA預(yù)處理PC12細(xì)胞12 h，然后加入LPS 0.15 g·L-1繼續(xù)孵育8 h，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4ELlSA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α 和lL-1β 的水平

將PC12細(xì)胞用FA 2.5，5，10，20和40 μmol·L-1預(yù)處理12 h，然后加入LPS 1 g·L-1與PC12細(xì)胞繼續(xù)孵育8 h，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子，收集各組細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α和IL-1β水平。

1.5激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)PC12細(xì)胞F肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)和分布

FA 10，20和40 μmol·L-1預(yù)處理PC12細(xì)胞12 h，加入LPS 1 mg·L-1繼續(xù)孵育8 h，收集細(xì)胞，用4%的多聚甲醛固定15 min。用PBS洗滌3次；用含0.5%BSA的PBS封閉，0.1%Triton X-100透化10 min；用PBS洗滌3次；室溫下用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽1 μmol·L-1孵育PC12細(xì)胞30 min；PBS洗滌3次，用DAPI染核；PBS洗滌3次，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。羅丹明：激發(fā)波長(zhǎng)561 nm，吸收波長(zhǎng)580～650 nm；DAPI：激發(fā)波長(zhǎng)405 nm，吸收波長(zhǎng)415～475 nm。

1.6動(dòng)物、模型制備和給藥

60只成年雌性SD大鼠，體質(zhì)量280～320 g，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：SCXK（京）2012-0001；大鼠自然晝夜節(jié)律光照，適應(yīng)1周以上開始實(shí)驗(yàn)。將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、LPS模型組、FA 25，50和100 mg·kg-1防護(hù)組。正常對(duì)照組和LPS模型組每天給予等體積生理鹽水。FA防護(hù)組大鼠ip給予FA，每天1次，連續(xù)35 d。于第29天開始，除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠ip給予LPS 0.2 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)7 d。第36天，大鼠麻醉后處死，心臟灌流后迅速取大鼠海馬組織，分成2份，一份固定于4%甲醛中，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，在顯微鏡下觀察海馬組織病理變化。另一份用無(wú)RNA酶水沖洗，液氮速凍，-80°C保存，用于基因或者蛋白表達(dá)分析。

1.7免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元PDE4B蛋白表達(dá)

大鼠海馬組織切片，經(jīng)二甲苯梯度脫蠟和乙醇梯度脫水，用PBS洗滌3次，每次5 min；切片浸入EDTA溶液中并放入微波爐以中高火進(jìn)行抗原修復(fù)；切片放入3%雙氧水去離子水中常溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS洗滌2次，每次3 min；滴加正常山羊血清工作液室溫孵育15 min封閉，傾去，勿洗；隨后滴加PDE4B一抗（1∶200），4℃過(guò)夜；PBS沖洗3次，每次3 min，滴加二抗，37℃溫箱15 min；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），放入37℃溫箱孵育15 min；PBS沖洗3次，每次3 min；DAB顯色劑顯色，蒸餾水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。用Nikon ECLIPSE E200顯微鏡連接Tucsen TCH-5.0數(shù)碼相機(jī)拍照，并用Image-Pro Plus 6.0軟件分析染色陽(yáng)性區(qū)域積分吸光度（integrated absorbance，IA），表達(dá)PDE4B蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.8Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元CREB和p-CREB蛋白表達(dá)

按照核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取大鼠海馬組織核蛋白和胞漿蛋白，必須在蛋白提取液中加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。高速離心后收集上清，將胞漿蛋白和核蛋白分別提取收集并放入-80°C冰箱保存?zhèn)溆?。?jīng)BCA法進(jìn)行蛋白定量后，每個(gè)點(diǎn)樣孔加入50 μg蛋白樣品，以12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳，用預(yù)飽和的PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，Westren蛋白質(zhì)印跡封閉液（BSA，Tris系統(tǒng)）封閉1 h后，用1∶1000稀釋的抗CREB，p-CREB和Histone H3一抗孵育，4°C過(guò)夜，次晨用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的1∶2000稀釋的二抗37°C孵育1 h，ECL顯影，用Image J圖像分析軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行IA分析，以待測(cè)蛋白和Histone核蛋白內(nèi)參條帶的IA比值表示待測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用x±s表示，數(shù)據(jù)經(jīng)Graphpad Prism5軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（oneway ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1FA對(duì)LPS損傷PC12細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，與正常對(duì)照組相比，F(xiàn)A 2.5～20 μmol·L-1單獨(dú)對(duì)PC12細(xì)胞處理24 h，對(duì)PC12細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響；FA 40 μmol·L-1處理組細(xì)胞存活率有所升高（P＜0.05）。LPS 0.15 g·L-1可使PC12細(xì)胞存活率降低至正常對(duì)照組的約75%；FA 10，20和40 μmol·L-1預(yù)處理PC12細(xì)胞12 h，對(duì)LPS導(dǎo)致的PC12細(xì)胞存活率下降有一定的防護(hù)作用（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2FA對(duì)LPS損傷PC12細(xì)胞TNF-α 和lL-1β 釋放的影響

如圖2所示，與正常對(duì)照組相比，LPS組PC12細(xì)胞上清液中炎性因子TNF-α和IL-1β的釋放量顯著增加（P＜0.01）；FA 2.5～40 μmol·L-1預(yù)處理PC12細(xì)胞12 h，能顯著降低LPS所致TNF-α和IL-1β水平的升高（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.1　Effect of ferulic acid（FA）alone（A）or in combination with lipopolysaccharides（LPS）（B）on viability of PC12 cells.A：PC12 cells were treated with FA for 24 h；B：PC12 cells were pretreated with FA for 12 h，then exposed to LPS 0.15 g·L-1for 8 h.±s，n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with corresponding control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with LPS group.

Fig.2 linhibition of FA on generation of tumor necrosis factor-α （TNF-α ）and interleukin-1β （lL-1β ）in PC12 cells injuried by LPS.PC12 cells were pre-incubated with FA for 12 h，then exposed to LPS 1 mg·L-1for 8 h.±s，n=3.**P＜0.01，compared with corresponding control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with LPS group.

2.3FA對(duì)LPS損傷PC12細(xì)胞骨架蛋白F肌動(dòng)蛋白的保護(hù)作用

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果（圖3）顯示，正常對(duì)照組PC12細(xì)胞內(nèi)F肌動(dòng)蛋白染色清晰，骨架完整，在細(xì)胞質(zhì)中分布均勻；LPS模型組PC12細(xì)胞骨架排列紊亂，并且集結(jié)成束狀，細(xì)胞輪廓不清晰；FA 10 μmol·L-1組細(xì)胞骨架與LPS組比較無(wú)明顯差異；FA 20 μmol·L-1組細(xì)胞骨架形態(tài)有所恢復(fù)；FA 40 μmol·L-1組細(xì)胞骨架良好，F(xiàn)肌動(dòng)蛋白排列有序，細(xì)胞形態(tài)完整。表明FA對(duì)LPS所致PC12細(xì)胞F肌動(dòng)蛋白骨架的損傷具有保護(hù)作用。

2.4FA對(duì)LPS導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用

HE染色結(jié)果（圖4）顯示，正常對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完好，未見(jiàn)缺血性神經(jīng)元改變。LPS模型組海馬神經(jīng)元均有不同程度的局部缺血性改變，海馬神經(jīng)元核固縮、胞漿紅染，結(jié)構(gòu)不清。FA 25 mg·kg-1組海馬神經(jīng)元呈局部缺血性改變伴細(xì)胞及血管間隙加大，提示有輕度水腫，病理改變均較正常對(duì)照組嚴(yán)重。FA 50 mg·kg-1組海馬神經(jīng)元偶見(jiàn)缺血性改變，病理改變均較模型組為輕；FA 100 mg·kg-1組海馬神經(jīng)元之間輕微的病理改變。提示FA 50和100 mg·kg-1對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。

2.5FA對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元PDE4B表達(dá)的影響

如圖5所示，正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元中PDE4B廣泛表達(dá)，其定位主要是在細(xì)胞漿中，成棕黃色。與正常對(duì)照組相比，LPS損傷模型大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)PDE4B表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；給予FA 25，50 和100 mg·kg-1進(jìn)行預(yù)保護(hù)，海馬神經(jīng)元內(nèi)PDE4B表達(dá)較LPS模型組減弱（P＜0.05）。

2.6FA對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元CREB和p-CREB蛋白表達(dá)的影響

由圖6所示，與正常對(duì)照組相比，LPS模型組大鼠海馬神經(jīng)元CREB和p-CREB蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.01）；給予FA 50和100 mg·kg-1進(jìn)行預(yù)保護(hù)，其海馬神經(jīng)元內(nèi)CREB表達(dá)較LPS模型組明顯增強(qiáng)（P＜0.01），同時(shí)p-CREB表達(dá)亦明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。提示FA可能對(duì)PDE4/cAMP/CREB信號(hào)通路有明顯調(diào)節(jié)作用。

Fig.3 Effect of FA on F-actin in PC12 cells injured by LPS.See Fig.2 for the cell treatment.Fluorescence staining of F-actin with Alexa Fluor 488 rodamine-conjugated phalloidin（red）and with DAPI（blue）to label cell nucleus（blue）.

Fig.4 Effect of FA on pathological changes of hippocampus of rats induced by LPS（HE staining，×400）.FA was ip given SD rats once a day for 39 d.From the 29th day，LPS 0.2 mg·kg-1was ip given once a day for 7 d.Arrows show histopathological changes.

Fig.5 Effect of FA on phosphodiesteras 4B（PDE4B）expressions in hippocampus of rats induced by LPS （Immunohistochemistry，×200）.See Fig.4 for the rat treatment.IA：integrated absorbance.B was semi-quantitative result of A.±s，n=6，#P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with LPS model group.

Fig.6 Effect of FA on expression of cAMP response element-binding protein（CREB） and phospho-CREB（p-CREB）protein in hippocampal neuros of rats induced by LPS by Western blotting.See Fig.4 for the rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.**P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with LPS model group.

3　討論

LPS具有很強(qiáng)的促炎活性，參與炎癥的發(fā)生發(fā)展。LPS刺激PC12細(xì)胞在一定程度上模擬了體內(nèi)炎癥反應(yīng)過(guò)程。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)A對(duì)LPS所致PC12細(xì)胞的活性降低具有抑制作用，可顯著降低LPS所致TNF-α和IL-1β水平的升高。神經(jīng)炎癥會(huì)造成神經(jīng)元突觸功能異常和認(rèn)知能力下降，過(guò)度的神經(jīng)炎癥是阿爾茲海默病等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。FA具有良好的抗氧化和抗炎作用［10］，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用［11-12］。

F肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞骨架的主要成分之一，對(duì)細(xì)胞起支撐作用，在維持細(xì)胞形態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、增殖及細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中起重要作用［13］。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)F肌動(dòng)蛋白排列整齊，分布均勻，基本充滿細(xì)胞質(zhì)，尤其胞膜部分F肌動(dòng)蛋白骨架清晰。LPS模型組細(xì)胞F肌動(dòng)蛋白集結(jié)成粗大的束狀，提示應(yīng)力纖維大量形成，有可能導(dǎo)致細(xì)胞骨架受損，細(xì)胞膜失去支持。FA預(yù)處理組的PC12細(xì)胞，其F肌動(dòng)蛋白的形態(tài)、排列均有不同程度的改善。本研究結(jié)果提示，F(xiàn)A對(duì)LPS所致F肌動(dòng)蛋白損傷具有保護(hù)作用。

大鼠腹腔注射LPS可引起大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能減退及海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷［14-15］。本研究通過(guò)腹腔注射LPS誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損傷，部分胞體有凋亡和壞死改變，核深染且結(jié)構(gòu)不清，有核固縮、碎裂和溶解現(xiàn)象。腹腔注射LPS可誘導(dǎo)大鼠的學(xué)習(xí)記憶減退大腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元受損，與報(bào)道一致［20］。FA 50和100 mg·kg-1保護(hù)組SD大鼠海馬神經(jīng)元的損傷情況較LPS模型組明顯減輕。提示FA在防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有潛力。

據(jù)報(bào)道，LPS能夠特異性誘導(dǎo)PDE4B及相關(guān)炎性因子的表達(dá)升高，從而進(jìn)一步導(dǎo)致記憶和學(xué)習(xí)能力的下降［16-18］。本研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A對(duì)LPS誘導(dǎo)的PDE4B表達(dá)上調(diào)及其下游信號(hào)分子CREB和p-CREB下調(diào)的對(duì)抗作用。很多研究結(jié)果表明，PDE4B廣泛分布于在哺乳動(dòng)物腦部的杏仁核、紋狀體以及下丘腦，這也提示PDE4B可能作為抗抑郁及抗阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在治療靶點(diǎn)［19］。CREB作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其功能包括調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞的發(fā)育、成癮性、抑郁以及學(xué)習(xí)記憶等［20］。胞外信號(hào)通路通過(guò)影響CREB的磷酸化激活有關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄。CREB在細(xì)胞內(nèi)被相應(yīng)的激酶磷酸化以后，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，表現(xiàn)出相應(yīng)的功能。CREB的磷酸化受多條信號(hào)通路的影響，如cAMP信號(hào)通路、Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶信號(hào)通路和Ras/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路等［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A能降低LPS所引起SD大鼠海馬神經(jīng)元PDE4B表達(dá)的升高。LPS對(duì)PDE4B/cAMP/CREB信號(hào)通路的作用機(jī)制主要在于cAMP通過(guò)激活蛋白激酶A對(duì)LPS誘導(dǎo)的信號(hào)具有抑制作用。為了克服這種限制，LPS信號(hào)需要激活PDE4B基因的轉(zhuǎn)錄并積累PDE4B蛋白，在敲除PDE4B基因小鼠模型中不能去除cAMP的限制作用，也就不能對(duì)LPS的刺激產(chǎn)生正常的應(yīng)答［23］。

FA作為一種天然酚酸，本身具有強(qiáng)烈的抗氧化及抗炎作用，并且能夠通過(guò)血腦屏障［5，24］。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)A具有抑制LPS誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的作用；對(duì)LPS引起的大鼠海馬神經(jīng)元病理改變發(fā)揮保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其對(duì)LPS誘導(dǎo)的PDE4B表達(dá)上調(diào)及其下游信號(hào)分子CREB和p-CREB下調(diào)的對(duì)抗作用密切相關(guān)。FA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用是否涉及到其他機(jī)制還有待繼續(xù)研究。

［1］Dong GC，Kuan CY，Subramaniam S，Zhao JY，Sivasubramaniam S，Chang HY，et al.A potent inhibition of oxidative stress induced gene expression in neural cells by sustained ferulic acid release from chitosan based hydrogel［J］.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2015，49：691-699.

［2］Sgarbossa A，Giacomazza D，Di Carlo M.Ferulic acid：a hope for alzheimer′s disease therapy from plants［J］.Nutrients，2015，7（7）：5764-5782.

［3］Barone E，Calabrese V，Mancuso C.Ferulic acid and its therapeutic potential as a hormetin for agerelated diseases［J］.Biogerontology，2009，10（2）：97-108.

［4］Cao YJ，Zhang YM，Qi JP，Liu R，Zhang H，He LC. Ferulic acid inhibits H2O2-induced oxidative stress and inflammation in rat vascular smooth muscle cells via inhibition of the NADPH oxidase and NF-kappa B pathway［J］.Int Immunopharmacol，2015，28（2）：1018-1025.

［5］Lin TY，Lu CW，Huang SK，Wang SJ.Ferulic acid suppresses glutamate release through inhibition of voltage-dependent calcium entry in rat cerebrocortical nerveterminals［J］.JMedFood，2013，16（2）：112-119.

［6］Yan JJ，Jung JS，Kim TK，Hasan A，Hong CW，Nam JS，et al.Protective effects of ferulic acid in amyloid precursor protein plus presenilin-1 transgenic mouse model of Alzheimer disease［J］.Biol PharmBull，2013，36（1）：140-143.

［7］Bramanti E，F(xiàn)ulgentini L，Bizzarri RA，Sgarbossa A. β-Amyloid amorphous aggregates induced by the small natural molecule ferulic acid［J］.J Phys Chem B，2013，117（44）：13816-13821.

［8］Subash S，Essa MM，Braidy N，Awlad-Thani K，Vaishnav R，Al-Adawi R，et al.Diet rich in date palm fruits improves memory，learning and reduces betaamyloidintransgenicmousemodelof Alzheimer′s disease［J］.J Ayurveda Integr Med，2015，6（2）：111-120.

［9］Nabavi SF，Devi KP，Malar DS，Sureda A，Daglia M，Nabavi SM.Ferulic acid and Alzheimer′s disease：promises and pitfalls［J］.Mini Rev Med Chem，2015，15（9）：776-788.

［10］Di Domenico F，Perluigi M，F(xiàn)oppoli C，Blarzino C，Coccia R，De Marco F，et al.Protective effect of ferulic acid ethyl ester against oxidative stress mediated by UVB irradiation in human epidermal melanocytes［J］.Free Radic Res，2009，43（4）：365-375.

［11］Yabe T，Hirahara H，Harada N，Ito N，Nagai T，SanagiT，etal.Ferulicacidinducesneural progenitor cell proliferation in vitro and in vivo［J］. Neuroscience，2010，165（2）：515-524.

［12］Sultana R， Ravagna A， Mohmmad-Abdul H，Calabrese V，Butterfield DA.Ferulic acid ethyl ester protects neurons against amyloid beta-peptide（1-42）-induced oxidative stress and neurotoxicity：relationship to antioxidant activity［J］.J Neurochem，2005，92（4）：749-758.

［13］Villanueva J，Torregrosa-Hetland CJ，García-Martínez V，del Mar Francés M，Viniegra S，Gutiérrez LM.The F-actin cortex in chromaffin granule dynamics and fusion：a minireview［J］.J Mol Neurosci，2012，48 （2）：323-327.

［14］Lee B，Sur B，Park J，Kim SH，Kwon S，Yeom M，et al.Ginsenoside Rg3 alleviates lipopolysaccha?ride-induced learning and memory impairments by anti-inflammatory activity in rats［J］.Biomol Ther （Seoul），2013，21（5）：381-390.

［15］Lee JW，Lee YK，Yuk DY，Choi DY，Ban SB，Oh KW，et al.Neuro-inflammation induced by lipopolysaccharidecausescognitiveimpairment through enhancement of beta-amyloid generation ［J］.J Neuroinflammation，2008，5：37.

［16］Min SS，Quan HY，Ma JH，Han J，Seol GH. Chronic brain inflammation impairs two forms of long-term potentiation in the rat hippocampal CA1 area［J］.Neurosci Lett，2009，456（1）：20-24.

［17］Johansson EM，Sanabra C，Cortés R，Vilaró MT，Mengod G.Lipopolysaccharide administration in vivo induces differential expression of cAMP-specific phosphodiesterase 4B mRNA splice variants in the mouse brain［J］.J Neurosci Res，2011，89（11）：1761-1772.

［18］Reyes-IrisarriE， Perez-TorresS， MiroXA，Puigdomenech P，Palacios JM，Mengod G.Differen?tial distribution of PDE4B splice variant mRNAs in rat brain and the effects of systemic administration of LPS in their expression［J］.Synapse，2008，62 （1）：74-79.

［19］JohanssonEM，Reyes-IrisarriE，Mengod G. Comparison of cAMP-specific phosphodiesterase mRNAs distribution in mouse and rat brain［J］. Neurosci Lett，2012，525（1）：1-6.

［20］Giampà C， Middei S， Patassini S，Borreca A，Marullo F，Laurenti D，et al.Phosphodiesterase type IV inhibition prevents sequestration of CREB binding protein，protects striatal parvalbumin inter?neurons and rescues motor deficits in the R6/2 mouse model of Huntington′s disease［J］.Eur J Neurosci，2009，29（5）：902-910.

［21］Xi YD，Zhang DD，Ding J，Yu HL，Yuan LH，Ma WW，et al.Genistein inhibits Aβ25-35-inducedsynaptictoxicity and regulates CaMKⅡ/CREBpathway in SH-SY5Y cells［J/OL］.Cell Mol Neurobiol，（2015-12-11）［2016-01-29］.http：//link.springer.com/article/10.1007% 2Fs10571-015-0311-6

［22］Lee WR，Shen SC，Wu PR，Chou CL，Shih YH，Yeh CM，et al.CSE1L Links cAMP/PKA and Ras/ ERK pathways and regulates the expressions and phosphorylations of ERK1/2，CREB，and MITF inmelanoma cells［J/OL］.MolCarcinog，（2015-09-01）［2016-01-29］.http：//onlinelibrary.wiley.com/ doi/10.1002/mc.22407/full

［23］Guo J，Lin P，Zhao X，Zhang J，Wei X，Wang Q，et al.Etazolate abrogates the lipopolysaccharide （LPS）-induced downregulation of the cAMP/pCREB/ BDNF signaling，neuroinflammatory response and depressive-like behavior in mice［J］.Neuroscience，2014，263：1-14.

［24］Anselmi C，Centini M，Andreassi M，Buonocore A，La Rosa C，F(xiàn)acino RM，et al.Conformational analysis：a tool for the elucidation of the antioxidant properties of ferulic acid derivatives in membrane models［J］.J Pharm Biomed Anal，2004，35（5）：1241-1249.

Corresponding auther：GAO Yue，E-mail：gaoyue@bmi.ac.cn

（本文編輯：齊春會(huì)）

Protective effect of furelic acid on lipopolysaccharide induced damage in PC12 cells and hippocampal neurons of rats

HUANG Hao1，2，MA Zeng-chun2，WANG Yu-guang2，GAO Yue2
（1.College of Life Science and Bioengineering，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China；2.Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJCTlVE To investigate the protective effect of ferulic acid（FA）on lipopolysaccharide （LPS）-induced damage to PC12 cells and hippocampal neurons in Sprague-Dawley（SD）rats and its potential mechanisms.METHODS① in vitro study：PC12 cells were pretreated with FA 2.5-40 μmol·L-1for 12 h and treated with LPS for another 8 h.CCK-8 kit was used to test PC12 cell viability.Inflammatory cytokines tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-1β（IL-1β）were de?tected by ELISA kits.Laser scanning confocal microscopy was performed to measure F-actin expres?sion in the cells.②in vivo study：FA 25，50 and 100 mg·kg-1was ip given to Sprague-Dawley（SD）rats once a day for 35 d，and from the 29th day，ip co-administered with LPS（0.2 mg·kg-1）for 7 d. Immunohistochemistry method was used to determine protein expression of phophodiestera 4B （PDE4B）in the hippocampus of rats.The protein expression of cAMP response element-binding protein （CREB）and phospho CREB（p-CREB）was determined by Western blotting.RESULTS In the in vitro study，compared with LPS group，cell viability was significantly increased in FA 10，20 and 40 μmol·L-1groups（P＜0.05），while the production of inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β decreased（P＜0.05）. The structure and distribution of cytoskeletal protein F-actin were ameliorated markedly in PC12 cells.In the in vivo study，hematoxylin-eosin（HE）staining showed that pretreatment with FA（50 and 100 mg·kg-1）alleviated the damage to the hippocampus induced by LPS in SD rats.Immunohistochemistry showed that FA（50 and 100 mg·kg-1）pretreatment effectively prevented LPS-induced up-regulation of PDE4B expression in the hippocampus of rats（P＜0.05）.Western blotting analysis showed that the inhibitory effects on the protein expressions of CREB and p-CREB induced by LPS were altered by FA（50 and 100 mg·kg-1）pretreatment（P＜0.05）.CONCLUSlON FA can protect against LPS induced damage to PC12 cells and hippocampal neurons of rats.The resistant effect on neuron-inflammation of FA may be conferred by inhibiting LPS-induced up-regulation of PDE4B and stimulating signaling pathways of cAMP/CREB.

ferulic acid；phospholiesteras 4B；lipopolysaccharides；cAMP response element binding protein

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81130067）；and National Natural Science Foundation of China（81202936）

R967

A

1000-3002-（2016）04-0330-08

國(guó)家自然科學(xué)基金（81130067）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81202936）

黃 浩，男，博士研究生，主要從事中藥藥理學(xué)研究，Tel：（010）66931225，E-mail：happyhh758@163.com；高 月，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理學(xué)研究；馬增春，副研究員，主要從事新藥發(fā)現(xiàn)與中藥藥理研究。
通迅作者：高 月，E-mail：gaoyue@bmi.ac.cn

2016-01-29接受日期：2016-04-10）