舍曲林抗創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙效應(yīng)及其對(duì)一氧化氮的影響

孫樹(shù)崢，張黎明，姬雅君，李 雷，蔣湘云，王恒林，張有志（1.河北北方學(xué)院研究生部，河北張家口 075000；.北京解放軍第09醫(yī)院麻醉科，北京 100091；.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850；.滄州市中心醫(yī)院麻醉科，河北滄州 061000）

·論著·

舍曲林抗創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙效應(yīng)及其對(duì)一氧化氮的影響

孫樹(shù)崢1，2，3，張黎明3，姬雅君4，李 雷3，蔣湘云3，王恒林2，張有志3
（1.河北北方學(xué)院研究生部，河北張家口 075000；2.北京解放軍第309醫(yī)院麻醉科，北京 100091；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850；4.滄州市中心醫(yī)院麻醉科，河北滄州 061000）

目的 利用大鼠條件性恐懼模型，探討舍曲林抗創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（PTSD）作用與一氧化氮（NO）之間的關(guān)系。方法 采用聲音線索配對(duì)足底電擊對(duì)成年雄性SD大鼠造成條件性恐懼應(yīng)激，第2天進(jìn)行消退訓(xùn)練。每天實(shí)驗(yàn)前1 h，ig給予舍曲林15 mg·kg-1，連續(xù)8 d。消退訓(xùn)練后第1，4和7天，分別測(cè)試大鼠僵住行為。第7天測(cè)試完成后取杏仁核，Griess法檢測(cè)NO含量，Western蛋白印跡法檢測(cè)神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)水平。結(jié)果 行為學(xué)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，消退對(duì)照組和消退訓(xùn)練組僵住不動(dòng)時(shí)間均顯著增高（P＜0.01），提示大鼠條件恐懼造模成功。大鼠恐懼消退訓(xùn)練后第1和4天，舍曲林15 mg·kg-1組僵住不動(dòng)時(shí)間均低于消退訓(xùn)練組（P＜0.05）；在第7天，顯著低于消退訓(xùn)練組（P＜0.01），提示舍曲林減輕了恐懼反應(yīng)。舍曲林15 mg·kg-1組大鼠杏仁核區(qū)NO含量、nNOS和iNOS表達(dá)水平明顯低于消退訓(xùn)練組（P＜0.01）。結(jié)論 舍曲林能促進(jìn)條件恐懼記憶的消退，在條件恐懼模型上具有抗PTSD效應(yīng)，其作用機(jī)制可能與抑制NO過(guò)度釋放有關(guān)。

舍曲林；創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙；一氧化氮合酶；條件性恐懼；杏仁核

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.04.003

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是遭受突發(fā)的災(zāi)難性事件后，個(gè)體出現(xiàn)超乎尋常創(chuàng)傷應(yīng)激的焦慮性精神疾病，其主要臨床表現(xiàn)為病理性創(chuàng)傷記憶增強(qiáng)，警覺(jué)性增高，以及對(duì)創(chuàng)傷相關(guān)的情景出現(xiàn)持續(xù)的回避［1］。國(guó)外研究資料顯示，加拿大PTSD終生患病率約為9.2%，美國(guó)為6.8%～12.3%［2-3］。近年來(lái)我國(guó)的兒童及青少年地震PTSD合并患病率高達(dá)30.2%［4］。

然而PTSD的發(fā)生機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，至今尚未完全闡明。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)提示，一氧化氮（nitric oxide，NO）作為重要的效應(yīng)分子和信使分子參與PTSD的發(fā)生［5-6］。正常狀態(tài)下，NO對(duì)突觸可塑性、神經(jīng)內(nèi)分泌、神經(jīng)傳遞等功能有著重要的生理作用，而過(guò)度釋放時(shí)有明顯的神經(jīng)毒性。研究發(fā)現(xiàn)，將NO供體硝普鈉微量注射到大鼠海馬中可損傷該側(cè)海馬錐體神經(jīng)元和齒狀回顆粒細(xì)胞［7］。有研究證實(shí)，PTSD患者長(zhǎng)時(shí)間服用帕羅西?。╬arox?etine），可逆轉(zhuǎn)海馬萎縮，促進(jìn)海馬神經(jīng)元再生，并有助于改善患者的陳述性記憶和認(rèn)知能力［8］。

舍曲林（sertraline）是一種選擇性5-羥色胺（血清素，hydroxy trptamine，5-HT）重?cái)z取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI），也是被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為臨床上抗PTSD的一線藥物之一。本課題組前期在多個(gè)PTSD動(dòng)物模型上發(fā)現(xiàn)其在15 mg·kg-1劑量時(shí)有良好治療作用［9-10］，但其抗PTSD的作用是否經(jīng)由NO信號(hào)通路尚不明確。本研究觀察舍曲林對(duì)大鼠條件性恐懼模型的抗PTSD作用，并探究其與NO通路作用機(jī)制之間的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1試劑和主要儀器

舍曲林購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；NO檢測(cè)試劑盒（S0021）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；抗神經(jīng)型一氧化氮合酶抗體（anti-neuronal nitric oxide synthase，Anti-nNOS）（ab16650）和抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶抗體（anti-inducible nitric oxide synthase，Anti-iNOS）（ab3523）均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；β肌動(dòng)蛋白抗體（TA-09）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG （H+L）（ZB-2301）和辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）抗體（ZB-2305）均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

大鼠Med紅外視頻恐懼系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Med Associates，Inc公司，由4個(gè)大鼠操作性條件恐懼箱組成，外部由體積60 cm×35 cm×70 cm的光滑的木質(zhì)箱（一面為門(mén)）體構(gòu)成，體積為30 cm× 25 cm×25 cm的內(nèi)部箱體中有三面為光滑的不銹鋼墻壁（側(cè)壁有發(fā)聲器），一面為透明的有機(jī)塑料門(mén)，頂部由不銹鋼壁密封，底部為不銹鋼柵欄，間隔1.5 cm。外部連接一個(gè)信號(hào)處理器和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。

1.2動(dòng)物

36只成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（京）2011-0004）。動(dòng)物自由進(jìn)食水，飼養(yǎng)在溫度22～24℃、相對(duì)濕度約50%的安靜環(huán)境下，12 h晝夜明暗交替，適應(yīng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。適應(yīng)期間每天抓取大鼠5 min，以減少無(wú)關(guān)應(yīng)激刺激對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作的影響。所有的行為學(xué)測(cè)試均在上午8：00-12：00進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前3 d，每天將大鼠放入條件恐懼箱內(nèi)適應(yīng)5 min。

1.3動(dòng)物模型的建立和分組

大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、消退對(duì)照組、消退訓(xùn)練組、消退訓(xùn)練+舍曲林藥物治療組（15 mg·kg-1），每組9只。將各組大鼠分別放入條件恐懼箱內(nèi)，適應(yīng)2 min后給予單一頻率聲音信號(hào)（4.5 kHz，70 dB，15 s）適應(yīng)4次（2次聲音間隔2 min），然后再給予6次以聲音信號(hào)為提示的不可逃避足底電擊（1 mA，5 s），聲音與電擊同時(shí)結(jié)束，2次聲音間隔為2 min。24 h后將已建立的條件性恐懼動(dòng)物再次放入條件恐懼箱，僅給予聲音信號(hào)30次，每次15 s，2次聲音間隔為1 min。消退對(duì)照組在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)放進(jìn)條件恐懼箱，不進(jìn)行消退訓(xùn)練（不給聲音刺激）。條件性恐懼消退訓(xùn)練后1 h內(nèi)ig給予舍曲林，正常對(duì)照組給予相應(yīng)體積的生理鹽水。

1.4條件性恐懼消退保持測(cè)試

各組分別在條件恐懼消退訓(xùn)練后的第1，4和7天進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試前1 h內(nèi)進(jìn)行相應(yīng)的藥物處理，共連續(xù)8 d給藥。將大鼠放在訓(xùn)練箱內(nèi)，給予5次聲音信號(hào)，每次15 s，時(shí)間間隔為10 s，記錄5 min內(nèi)的僵住時(shí)間（計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)記錄），作為消退保持的成績(jī)。僵住不動(dòng)時(shí)間越短，消退保持成績(jī)?cè)胶?。每只大鼠?shí)驗(yàn)結(jié)束后及時(shí)清理測(cè)試箱中的排泄物，同時(shí)10%乙醇進(jìn)行擦拭，避免殘留氣味對(duì)其他大鼠的影響。

1.5Griess法檢測(cè)杏仁核內(nèi)NO含量

消退訓(xùn)練后第7天待各組行為學(xué)測(cè)試全部結(jié)束后，斷頭取腦，冰上分離杏仁核，按照每1 mg組織加10 μL裂解液的比例，每組加入相應(yīng)體積的裂解液（RIPA），快速冰上裂解，勻漿，離心（5000×g，4℃，30 min），取上清液。取部分樣品于-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。采用Griess法NO檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)杏仁核內(nèi)NO含量。用文獻(xiàn)已知NO濃度進(jìn)行稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。

1.6Western蛋白印跡法檢測(cè)杏仁核內(nèi)nNOS和iNOS表達(dá)

常規(guī)配制8%的分離膠和5%的積層膠，進(jìn)樣后，80 V電泳待marker略分開(kāi)，改換120 V繼續(xù)電泳約1 h，然后100 V恒壓轉(zhuǎn)膜約1.5 h。取出PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，之后加抗nNOS/ iNOS兔源多克隆抗體（按1∶1000進(jìn)行稀釋）4℃輕度振蕩過(guò)夜。PVDF膜用TBST漂洗3次，每次10 min。室溫下孵育二抗（辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG）1 h。待TBST洗3次，后，吸掉膜上水分，使用ECL化學(xué)發(fā)光底物液用1∶1的A，B液混合后覆蓋PVDF膜，在凝膠成像系統(tǒng)（FluorChem FC2）內(nèi)顯影并生成圖像。以圖像中的目標(biāo)蛋白條帶與內(nèi)標(biāo)蛋白條帶的積分吸光度比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，采用Graphpad Prism 5.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異比較采用Dunnett t檢驗(yàn)，P＜0.05為有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1舍曲林對(duì)條件性恐懼消退訓(xùn)練大鼠行為的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，消退對(duì)照組和消退訓(xùn)練組僵住不動(dòng)時(shí)間3次測(cè)試均顯著增高（P＜0.01）；而與消退對(duì)照組相比，消退訓(xùn)練組僵住時(shí)間無(wú)明顯差異，提示條件恐懼造模成功后單純采取行為訓(xùn)練來(lái)消除已建立的恐懼反應(yīng)，其消退的效果并不理想；在消退訓(xùn)練后第1和4天，與消退訓(xùn)練組相比，舍曲林組僵住不動(dòng)時(shí)間明顯降低（P＜0.05）；第7天舍曲林組的僵住不動(dòng)時(shí)間顯著降低（P＜0.01）；且與第4天相比，消退訓(xùn)練組僵住不動(dòng)時(shí)間呈下降趨勢(shì)（無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），而舍曲林組明顯下降。

2.2舍曲林對(duì)條件恐懼大鼠杏仁核內(nèi)NO含量的影響

如表2所示，經(jīng)過(guò)條件恐懼性應(yīng)激的消退對(duì)照組大鼠杏仁核內(nèi)NO含量明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；與消退對(duì)照組相比，消退訓(xùn)練組大鼠杏仁核內(nèi)NO含量無(wú)顯著性降低，而舍曲林藥物干預(yù)后，NO含量明顯低于消退訓(xùn)練組（P＜0.01），說(shuō)明舍曲林能逆轉(zhuǎn)條件恐懼大鼠過(guò)度增高的大鼠杏仁核內(nèi)NO水平。

Tab.1 Effect of sertraline on freezing time of rats after extinction training

Tab.2 Effect of sertraline on released nitric oxide（NO）in amygdala tissue of rats after extinction training

2.3舍曲林對(duì)條件恐懼大鼠杏仁核內(nèi)nNOS和iNOS表達(dá)的影響

如圖1所示，與正常對(duì)照組相比，消退對(duì)照組nNOS和iNOS蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與消退對(duì)照組相比，消退訓(xùn)練組NOS蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化；經(jīng)過(guò)舍曲林藥物干預(yù)后，與消退對(duì)照組相比，舍曲林組nNOS和iNOS蛋白水平明顯降低（P＜0.01）。

Fig.1 Effect of sertraline on expression of neuronal nitric oxide（nNOS）and inducible nitric oxide（iNOS）protein in amygdala tissue of rats after extinction training by Western blotting.See Tab.1 for the treatment. B was the semiquantitative result of A.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with extinction control group.

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，舍曲林具有較好的抗PTSD作用，并發(fā)現(xiàn)其可降低條件性恐懼大鼠杏仁核區(qū)NO含量和NOS表達(dá)，提示其抗PTSD作用機(jī)制可能與其對(duì)NO信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。我們的前期研究顯示，長(zhǎng)期給予該劑量的舍曲林對(duì)大鼠一般狀態(tài)無(wú)不良影響，且不影響正常大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，具有良好的安全性。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究以巴甫洛夫條件恐懼反射為基礎(chǔ)，建立了以聲音為線索與恐懼記憶相關(guān)的大鼠條件恐懼模型，此模型是經(jīng)典的PTSD動(dòng)物模型之一［11］。首先對(duì)大鼠進(jìn)行非條件性刺激（如不可逃避的足底電擊）與條件性刺激（如聲音）相聯(lián)結(jié)匹配的訓(xùn)練，24 h后進(jìn)行只有聲音線索而沒(méi)有電擊的消退訓(xùn)練，在消退訓(xùn)練后第1，4和7天再次將大鼠暴露于訓(xùn)練過(guò)的條件線索下，觀察其對(duì)具體的聲音線索所表現(xiàn)出恐懼反應(yīng)，即僵住行為。該模型很好地模擬了PTSD患者對(duì)恐懼記憶產(chǎn)生的回避性行為，是研究PTSD發(fā)病機(jī)制較理想的動(dòng)物模型。

大量文獻(xiàn)報(bào)道，NO過(guò)度釋放與焦慮癥、PTSD等應(yīng)激相關(guān)性疾病密切相關(guān)［12-14］：對(duì)PTSD的動(dòng)物模型強(qiáng)烈應(yīng)激3周之后發(fā)現(xiàn)，NOS表達(dá)水平持續(xù)性升高［15］；增強(qiáng)NO的環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷信號(hào)通路可誘發(fā)小鼠出現(xiàn)焦慮樣行為；在大鼠捕食應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)激組大鼠海馬NO和nNOS含量在捕食應(yīng)激后明顯增高［16］。海馬萎縮以及海馬神經(jīng)元再生障礙與PTSD發(fā)生密切聯(lián)系［17-18］；而應(yīng)激導(dǎo)致的NO過(guò)度釋放進(jìn)而作用于N-甲基-D-天冬氨酸受體和環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，是參與海馬神經(jīng)元再生障礙的重要因素。有研究表明，腦室注射NOS抑制劑或nNOS基因敲除小鼠，均可表現(xiàn)為神經(jīng)元再生增強(qiáng)，且nNOS抑制劑可逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激所誘導(dǎo)的神經(jīng)元再生減少［19-20］；而SSRI類藥物能抵抗PTSD小鼠海馬突觸蛋白的降低，逆轉(zhuǎn)海馬萎縮［18］。有文獻(xiàn)報(bào)道，氟西汀的神經(jīng)保護(hù)作用可歸因于其能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞減少了炎癥因子和NO的過(guò)度釋放［21］，SSRI類藥物甚至被認(rèn)為是特殊“NOS抑制劑”［22］，在動(dòng)物慢性應(yīng)激抑郁樣模型研究中發(fā)現(xiàn)，氟西汀能抑制NOS過(guò)度表達(dá)進(jìn)而逆轉(zhuǎn)大鼠結(jié)構(gòu)異常的海馬神經(jīng)元［23］。隨后又發(fā)現(xiàn)，nNOS過(guò)度表達(dá)是慢性應(yīng)激大鼠造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制，行為絕望改變等病變的主要原因［24］。因此，結(jié)合文獻(xiàn)及本研究結(jié)果，認(rèn)為舍曲林抗PTSD效應(yīng)的作用機(jī)制之一可能與其抑制NO的過(guò)度釋放有關(guān)。

但舍曲林影響NO變化的具體機(jī)制尚不明確，其逆轉(zhuǎn)NO過(guò)度釋放是間接作用還是作為“NOS抑制劑”直接發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步研究。有研究發(fā)現(xiàn)，時(shí)間敏化動(dòng)物模型NOS表達(dá)持續(xù)性升高，帕羅西汀和選擇性iNOS抑制劑氨基胍可逆轉(zhuǎn)其升高，而nNOS抑制劑7-NI卻無(wú)此作用，表明PTSD發(fā)生時(shí)過(guò)量產(chǎn)生的NO主要來(lái)自于iNOS，而非nNOS［25］。而本研究中，舍曲林干預(yù)后nNOS和iNOS表達(dá)均被抑制，過(guò)度釋放的NO究竟來(lái)自nNOS還是iNOS，或是二者共同作用，需要對(duì)相關(guān)通路進(jìn)行深入研究。

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（本文編輯：?jiǎn)?虹）

Anti-post-traumatic stress disorder effect of sertraline and its effect on nitric oxide

SUN Shu-zheng1，2，3，ZHANG Li-ming3，JI Ya-jun4，LI Lei3，JIANG Xiang-yun3，WANG Heng-lin2，ZHANG You-zhi3
（1.Department of Postgraduates，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China；2.Department of Anesthesiology，Hospital 309 of Chinese People′s Liberation Army，Beijing 100091，China；3.Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；4.Department of Anesthesiology，Cangzhou Central Hospital，Cangzhou 061000，China）

OBJECTlVE To investigate the relationship between the anti-post-traumatic stress disorder（PTSD）effect of sertraline and nitric oxide in fear conditioning rats.METHODS Conditioned fear stress was established by electric shock with a cue tone，and fear extinction training was carriedout by giving the rats only tone signals the next day.The rats were treated with sertraline（15 mg·kg-1）intragastrically within 1 h before the experiment for 8 d.Freezing time was tested at the 1st，4th and 7th day after the extinction training in rats.The NO contents were detected by Griess method and the nNOS and iNOS level on amygdala was detected by Western blotting.RESULTS The behavior tests showed that compared with normal control group，the freezing time was significantly increased in extinction control group and extinction training group（P＜0.01），indicating that the conditioned fear model of rats was successfully established.At the 1st and 4th day after conditioned fear extinction training in the rats，freezing time in sertraline（15 mg·kg-1）group was decreased compared with extinction training group （P＜0.05）.At the 7th day，the freezing time was significantly decreased（P＜0.01），indicating that ser?traline reversed the fear response.At the same time，the contents of NO，nNOS and iNOS on amygdala of rats in sertraline group were lower than that in extinction training group（P＜0.01）.CONCLUSlON Sertraline can promote extinction of conditioned fear memory，suggesting that sertraline has anti-PTSD effects on the model of fear condition in rats.The underlying mechanisms may be connected with NO.

post-traumatic stress disorder；nitric oxide synthase；fear condition；amygdala

Fopundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81001653）；National Natural Science Foundation of China（30973516）

WANG Heng-lin，E-mail：hlin309@sina.com，Tel：13718782182；ZHANG You-zhi，E-mail：zhyouzhi@aliyun.com，Tel：（010）66931619

R971

A

1000-3002-（2016）04-0317-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（81001653）；國(guó)家自然科學(xué)基金（30973516）

孫樹(shù)崢，女，碩士研究生，主要從事麻醉藥理學(xué)研究，E-mail：sszheng1212@sina.com；王恒林，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事麻醉藥理學(xué)研究；張有志，男，博士，研究員，主要從事精神藥理學(xué)研究。

王恒林， E-mail：hlin309@sina.com，Tel：13718782182；張有志，E-mail：zhyouzhi@aliyun.com，Tel：（010）66931619

2015-09-13接受日期：2016-02-25）