北美海棠組培快繁研究

黃俊軒++劉艷軍++楊靜慧++李建科++李雕

摘 要：為了建立北美海棠組培快繁體系，以北美海棠一年生休眠枝條為外植體，經(jīng)過體外消毒后，將帶有腋芽的莖段接種到1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行無菌苗的培養(yǎng)，然后剪取帶有腋芽的北美海棠無菌苗的莖段接種到含有不同激素濃度的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行再生芽的增殖培養(yǎng)，從中篩選出增殖效果最好的培養(yǎng)基配方組合，之后將再生出的小芽的外植體接種到含有不同激素的伸長生長培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，從中篩選出伸長效果最好的培養(yǎng)基配方，之后待到伸長培養(yǎng)的小苗長到5 cm時(shí)，將其從外植體上剪下接種到含有不同生長素的生根培養(yǎng)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，從中篩選出最適的培養(yǎng)基配方。經(jīng)過不同階段的培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果顯示：增殖效果最好的培養(yǎng)基配方為MS+1.5 BA+0.5 IAA+30 g·L-1蔗糖；伸長效果最好的培養(yǎng)基為MS+0.5 BA+1.0 IAA+30 g·L-1蔗糖；生根效果最好的為1/2 MS+0. 5 NAA+20 g·L-1蔗糖。本試驗(yàn)結(jié)果將會(huì)應(yīng)用在北美海棠優(yōu)質(zhì)苗木的快繁及育種研究中。

關(guān)鍵詞：培養(yǎng)基；激素；增殖培養(yǎng)；分化

中圖分類號(hào)：S661.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.08.006

Abstract： In order to build the rapid propagation system of American Begonia， the annual dormant branches of American Begonia were taking as explants in this test. After disinfection in vitro， stem segment with axillary bud was inoculated onto the 1/2 MS medium for sterile seedling cultivation. Then the bud stem section of American Begonia was inoculated onto the MS medium containing different concentration hormones for bud multiplication culture， and to screen the best medium formula for proliferation. Then the explants with regenerated buds were inoculated onto the MS medium containing different concentration hormones for buds elongation， and to screen the best medium formula for elongation. When the seedlings for elongation were 5 cm long， they were cut off from the explant and inoculated onto the MS medium containing different concentration auxins for rooting culture， and to screen the best medium formula for rooting. Through the cultivation of different stages， the research results showed that the best culture medium formula for proliferation was MS+1.5 BA+0.5 IAA+30 g·L-1 sucrose. The best medium for elongation was MS+0.5 BA+1.0 IAA+30 g·L-1 sucrose； for the best medium for rooting was 1/2 MS+0.5 NAA+20 g·L-1sucrose. The test results will be applied in American Begonia fast propagation and breeding study.

Key words： medium； hormone； multiplication culture； differentiation

北美海棠，學(xué)名North Americart Begonia，為薔薇科蘋果屬落葉喬木，它是由美國和加拿大的育種者從自然雜交的海棠中選育出來的，已經(jīng)在北美種植和推廣了幾十年，因此被稱作北美海棠。北美海棠具有很高的觀賞價(jià)值，不但其花和果實(shí)的色彩豐富，而且許多品種的葉色和枝條亦隨著季節(jié)的不同呈現(xiàn)出不同的色彩。另外，北美海棠抗性強(qiáng)，耐寒，耐瘠薄，管理容易，觀賞效果好。北美海棠現(xiàn)已成為北方氣候條件下被廣泛應(yīng)用的一種重要的園林植物。隨著我國對(duì)園林業(yè)的大力發(fā)展和扶植，市場需要越來越多的優(yōu)質(zhì)綠化苗木，北美海棠已經(jīng)成為優(yōu)良的綠化資源，并逐漸成為苗木市場的主推品種[1]。在園林綠化中適于列植于道路兩旁，亦可孤植、叢植于草坪上或點(diǎn)綴于巖石旁、湖水邊[2]。

現(xiàn)在園林中應(yīng)用的主要北美海棠品種有：道格、紅麗、寶石、凱爾斯、粉芽、紅玉、王族、火焰、雪球、鉆石、絢麗、草莓果凍等。其中“凱爾斯”為重瓣花的新品種，“紅玉”海棠為垂枝的品種，“王族”海棠葉色紫紅，是觀花觀葉的優(yōu)秀品種。這些海棠的花期為4月下旬，花色極為豐富，主要體現(xiàn)在白色、粉色、紫色、紅色等色系中，有不同色深及冷暖色調(diào)差異 [3]。

北美海棠作為重要的園林綠化植物新品種，關(guān)于它的繁殖方法報(bào)道較多。其中多數(shù)是關(guān)于嫁接與扦插進(jìn)行繁殖的[4-6]。雖然扦插或嫁接的繁殖方法簡便易行，但受到季節(jié)限制及成活率等因素的影響，在生產(chǎn)上很難保證向市場提供充足的北美海棠苗木。另外，采用傳統(tǒng)繁殖方法還會(huì)造成繁殖苗木病蟲害的大范圍傳播，不能提供優(yōu)質(zhì)的繁殖苗木。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是組織培養(yǎng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，一些綠化用苗木已經(jīng)開始采用組培繁殖技術(shù)進(jìn)行繁殖，并逐漸取代傳統(tǒng)的嫁接與扦插繁殖方法[7-9]。與后者相比，組培繁殖具有以下優(yōu)勢：一是繁殖系數(shù)高，組培不受季節(jié)限制，可以周年生產(chǎn)，同時(shí)增殖系數(shù)高，繁殖系數(shù)相應(yīng)提高；二是苗木質(zhì)量優(yōu)，因?yàn)榭梢酝ㄟ^組培繁殖過程去除母株所帶的病蟲害，得到健壯的繁殖苗木；三是成活率高，節(jié)約生產(chǎn)成本。傳統(tǒng)繁殖方法在后期苗木培養(yǎng)過程中經(jīng)常會(huì)由于苗木質(zhì)量差，管理繁瑣等因素的影響造成成苗率顯著下降的現(xiàn)象，因此，會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加，尤其是大苗的高死亡率更是嚴(yán)重影響了苗木的種植與推廣。而組培苗越到生長后期，生長勢越強(qiáng)，這就保障了苗木的成苗率與成材率。

近年來，關(guān)于北美海棠組培快繁的報(bào)道越來越多[10-11]，雖然北美海棠的組培研究相對(duì)較為簡單，也很容易獲得再生苗，但多數(shù)增殖效率并不理想，許多品種還不能做到工廠化生產(chǎn)，因此，本研究主要針對(duì)北美海棠組培中這一問題，通過組培中影響其快繁效果的各種因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，目的就是要建立一套高效的北美海棠組培快繁體系，實(shí)現(xiàn)北美海棠試管苗的工廠化生產(chǎn)，為生產(chǎn)上提高充足的組培苗木。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

北美海棠一年生枝條取自天津農(nóng)學(xué)院園林植物教研室實(shí)習(xí)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 北美海棠外植體消毒處理 選取生長健壯、無病蟲害的北美海棠一年生枝條，選取時(shí)間應(yīng)在落葉1個(gè)月后。在實(shí)驗(yàn)室中用自來水將枝條表面反復(fù)沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行外植體的表面消毒處理。具體操作步驟為：先用70%的酒精將帶有休眠芽的枝條切斷浸泡30 s，然后采用40%的安替福民水溶液進(jìn)行消毒處理10 min，然后用無菌水進(jìn)行沖洗3～5次。將洗凈消毒劑的外植體用無菌的濾紙吸干表面水分，然后將其接種到含有10 mg·L-1 GA3的1/2MS培養(yǎng)基上，在溫度為25 ℃，24 h光照下進(jìn)行休眠芽的萌發(fā)培養(yǎng)。

1.2.2 北美海棠的增殖培養(yǎng) 當(dāng)北美海棠莖段外植體的休眠芽萌發(fā)并長到2～3 cm時(shí)，將其從外植體上切下，轉(zhuǎn)移到含有不同生長激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行再生芽的增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)采用容積為100 mL的廣口三角瓶，其中加入35 mL的固體培養(yǎng)基。每個(gè)處理做8瓶，每瓶接種5個(gè)萌發(fā)的腋芽。培養(yǎng)條件為25 ℃，24 h光照。經(jīng)過40 d的培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)每種處理腋芽的增殖情況。

1.2.3 北美海棠的伸長培養(yǎng) 當(dāng)增殖培養(yǎng)的北美海棠芽長到2～3 cm時(shí)，在超凈工作臺(tái)中將其從芽叢中分離開來，每個(gè)單獨(dú)的芽分別接種到含有不同激素的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行再生芽的伸長培養(yǎng)，試驗(yàn)條件同前。每個(gè)處理接種8～10個(gè)再生芽，并重復(fù)5次，經(jīng)過30 d的培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理再生芽的伸長情況。

1.2.4 北美海棠的生根培養(yǎng) 當(dāng)伸長培養(yǎng)的北美海棠苗長到5 cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到含有不同生長素的培養(yǎng)基上進(jìn)行再生苗的生根培養(yǎng)。其中每個(gè)三角瓶接種5～8個(gè)再生苗，并重復(fù)5次。培養(yǎng)條件與前面相同。經(jīng)過30 d后統(tǒng)計(jì)北美海棠再生苗的生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 北美海棠的腋芽增殖結(jié)果

北美海棠休眠芽在含有GA3的培養(yǎng)基上經(jīng)過30 d的培養(yǎng)后，腋芽萌發(fā)并正常生長。當(dāng)腋芽長到2～3 cm時(shí)將其切下轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過40 d的培養(yǎng)，從腋芽的頂點(diǎn)分生出一定數(shù)量的叢生芽，每個(gè)處理情況不同，通過對(duì)增殖芽數(shù)量與生長情況的統(tǒng)計(jì)，記錄整理形成表1。

從表1中可以看到，在采用不同分裂素情況下，北美海棠增殖情況明顯不同。從增殖系數(shù)來看，采用BA作為分裂素獲得的增殖系數(shù)明顯高于KT，且從再生芽生長情況來看，采用BA誘導(dǎo)出的再生芽生長基本健壯，只有BA達(dá)到2 mg·L-1時(shí)才生長緩慢；相反，采用KT為分裂素，增殖系數(shù)明顯低于BA，并且再生芽生長緩慢，且出現(xiàn)玻璃化顯現(xiàn)，說明KT不利于北美海棠的增殖培養(yǎng)。在采用BA為分裂素時(shí)，隨著其濃度的增加，增殖系數(shù)逐漸增大，但當(dāng)BA濃度達(dá)到2 mg·L-1時(shí)，再生芽的生長速度下降，同時(shí)增殖系數(shù)也降低，說明在適宜的BA作用下北美海棠的增殖效果最好。綜上情況，采用MS+1.5 BA+0.5 IAA+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基最適于北美海棠增殖培養(yǎng)。

2.2 北美海棠的伸長培養(yǎng)結(jié)果

將增殖培養(yǎng)中長出的再生芽剪下，接種到含有不同激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行伸長培養(yǎng)，經(jīng)過大約30 d的培養(yǎng)，再生芽開始伸長，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

從表2中可以看到，不同激素組合對(duì)北美海棠分化的影響不同。其影響變化主要決定于分裂素與生長素的比例，當(dāng)分裂素/生長素的比值較高時(shí)，再生芽仍然保持分化狀態(tài)，并有新的再生苗長出，而原來的再生芽也不再伸長。如果繼續(xù)延長培養(yǎng)時(shí)間則會(huì)造成再生芽玻璃化并褐變死亡，不能得到生長健壯的再生苗。相反，當(dāng)其比例降低時(shí)，即采用較高的生長素時(shí)，分化現(xiàn)象受到抑制，而出現(xiàn)再生苗迅速伸長生長現(xiàn)象。從表2可以看到，適宜的分裂素/生長素的比值可以獲得較好的再生苗伸長效果，結(jié)合再生苗的生長于伸長情況，在MS+0.5 BA+1.0 IAA的培養(yǎng)基上獲得的北美海棠伸長效果最好。

2.3 北美海棠的生根試驗(yàn)結(jié)果

待伸長培養(yǎng)的北美海棠苗長到5 cm左右時(shí)，在超凈臺(tái)中將其剪下，接種到含有生根培養(yǎng)基的三角瓶中。經(jīng)過大約一周的時(shí)間，在組培苗的基部就有根出現(xiàn)，經(jīng)過30 d的培養(yǎng)，在每種培養(yǎng)基的瓶中，生根情況出現(xiàn)明顯的不同，具體情況見表3。

北美海棠屬于木本植物，組培生根較困難，因此，筆者采用較低滲透壓的1/2 MS作為基本培養(yǎng)基，同時(shí)附加20 g·L-1的蔗糖。從表3中的數(shù)據(jù)可以看出：

首先，不同生長素對(duì)北美海棠的生根影響不同，IAA雖然能夠使得組培苗生根，但從數(shù)量與根長來看多表現(xiàn)為較低的數(shù)值，而且從生根的質(zhì)量上看，在IAA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的根都是短粗的肉質(zhì)根。這種根基本不具備根的基本功能，除了具有被動(dòng)的吸收之外，不具有真正根的任何生理機(jī)能，因此，即使進(jìn)行帶根移栽，這樣的組培苗一般都不能成活。因此，這類生根沒有實(shí)際意義。這一現(xiàn)象說明，北美海棠組培苗對(duì)IAA表現(xiàn)不好，相反，采用NAA則可以獲得生長正常、健壯的根，而且數(shù)量和根長都十分理想，因此，NAA適宜作為誘導(dǎo)北美海棠組培苗生根的激素。

其次，在采用NAA進(jìn)行誘導(dǎo)生根時(shí)可以見到，隨著NAA使用濃度的增加，可以誘導(dǎo)出數(shù)量較多的再生根，但當(dāng)NAA的濃度達(dá)到1.0 mg·L-1時(shí)，生根質(zhì)量出現(xiàn)明顯變化，根的長度減小，并且粗度變細(xì)，呈現(xiàn)出簇生狀態(tài)。這種根也與IAA誘導(dǎo)出的肉質(zhì)根相似，移栽時(shí)容易造成組培苗根的傷害，從而造成微生物感染，導(dǎo)致移栽成活率下降，因此，在生產(chǎn)上不采用這類生根苗進(jìn)行移栽。

綜上情況，在北美海棠生根試驗(yàn)中，采用1/2 MS+0. 5 NAA+20 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基可以獲得理想的生根苗。

3 討 論

3.1 不同分裂素對(duì)北美海棠增殖的影響

在本試驗(yàn)中，筆者采用了2種分裂素，即BA與KT。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，BA明顯優(yōu)于KT，這說明北美海棠的增殖更適于BA。一般在誘導(dǎo)增殖的組培研究中，分裂素是必需的，因?yàn)榻M織的分化與生長是一定的分裂素與生長素共同作用的結(jié)果，當(dāng)分裂素較高時(shí)，更利于組織分化，如增殖生長。相反，如果生長素較高則利于組織的增大生長，表現(xiàn)出組培材料生長速度加快。雖然如此，但每種植物對(duì)分裂素的選擇是不同的。當(dāng)采用某一分裂素進(jìn)行誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)時(shí)，如果通過改變其濃度不能收到理想的結(jié)果時(shí)，一般要考慮更換新的分裂素。因?yàn)橹参飳?duì)分裂素的種類是有所選擇的，所以在木本植物進(jìn)行增殖培養(yǎng)時(shí)，一般采用KT，而草本植物多采用BA。在本試驗(yàn)中結(jié)果正好相反，因此，這一規(guī)律也并不適于所有物種。因此，在進(jìn)行植物增殖培養(yǎng)研究中，具體采用哪種分裂素還是以試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。

3.2 組培快繁中增殖率對(duì)繁殖效率的影響

在進(jìn)行組培快繁研究中，影響繁殖系數(shù)的主要指標(biāo)就是增殖率，即增殖系數(shù)。一般認(rèn)為增殖率越高，繁殖效率也就相應(yīng)增高，但在實(shí)際生產(chǎn)中這一原則也是不準(zhǔn)確的。具體原因主要有以下幾方面。第一，過高的增殖率會(huì)影響增殖芽的質(zhì)量。由于增殖系數(shù)過高，再生芽的數(shù)量太大，勢必造成其生長緩慢，且由于營養(yǎng)競爭，實(shí)際上許多再生芽在生長過程中會(huì)被淘汰，只有少量存活下來，反而降低了增殖率。同時(shí)生長過慢，也最終影響繁殖效率；第二，如果只求較高的增殖率，也會(huì)需要高濃度的分裂素，如果分裂素過高，就會(huì)造成其對(duì)植物的毒害作用，比較明顯的現(xiàn)象就是會(huì)造成組培苗產(chǎn)生玻璃化，因此，即使增殖系數(shù)再高，但再生芽的質(zhì)量很差，一樣會(huì)導(dǎo)致實(shí)際的繁殖效果降低。因此，要在不造成再生芽傷害的前提下，適當(dāng)增加分裂素的用量，以此增加其增殖率，才能收到理想的快繁效果；第三，過高的增殖系數(shù)會(huì)導(dǎo)致再生芽個(gè)體較小，在進(jìn)行切分操作中會(huì)對(duì)再生芽造成較大的傷害，導(dǎo)致再生苗在轉(zhuǎn)移過程中影響其以后的生長速度，甚至造成死亡，因此，在實(shí)際生產(chǎn)中也不會(huì)使得快繁效率增加。綜上幾個(gè)原因，在進(jìn)行植物組培快繁研究中，在追求增殖率的同時(shí)也要考慮再生芽的質(zhì)量，適宜的增殖系數(shù)是實(shí)現(xiàn)組培快繁效率的關(guān)鍵。

3.3 滲透壓對(duì)生根的影響

滲透壓對(duì)于組培苗生根很重要，因?yàn)橹参锷枰^低的滲透壓，低滲透壓利于根原基的形成及根的快速伸長。在本試驗(yàn)中，采用1/2 MS，降低培養(yǎng)基中離子強(qiáng)度，從而使得培養(yǎng)基的滲透壓降低，同時(shí)又采用了20 g·L-1的蔗糖，這也是降低滲透壓的一種做法。雖然降低滲透壓利于生根培養(yǎng)，但也應(yīng)考慮組培苗的實(shí)際情況。首先，過低的滲透壓是犧牲培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分（如無機(jī)鹽或糖）換來的，因此，勢必造成組培苗從培養(yǎng)基中獲取營養(yǎng)的水平下降，一旦營養(yǎng)不足就會(huì)導(dǎo)致生根的效率下降，造成生根數(shù)量和生長速度的下降，不但不能增加生根率，相反還影響了生根的效果。其次，要根據(jù)組培苗的實(shí)際生長情況決定是否采用低滲透壓。在本試驗(yàn)中，北美海棠組培苗在進(jìn)行生根時(shí)生長的十分健壯，即使培養(yǎng)基營養(yǎng)缺乏，其也可以借助自身的營養(yǎng)積累實(shí)現(xiàn)生根。相反，如果組培苗生長較弱，應(yīng)盡量避免采用低營養(yǎng)的培養(yǎng)基。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中一定要根據(jù)具體情況適當(dāng)降低滲透壓來提高組培苗的生根效率。

4 結(jié) 論

北美海棠是一種重要的園林植物品種，因此，組培快繁對(duì)于其應(yīng)用與推廣具有十分重要的意義。本試驗(yàn)對(duì)其快繁中的主要技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行了研究，具體操作規(guī)程總結(jié)歸納如下。（1）外植體獲取。取休眠枝條，采用40%的安替福民水溶液進(jìn)行消毒處理10 min，無菌水沖洗后，接種到含有10 mg·L-1 GA3的1/2 MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽的萌發(fā)；（2）增殖培養(yǎng)。將無菌芽接種到MS+1.5 BA+0.5 IAA+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，經(jīng)過40 d的培養(yǎng)獲得再生芽；（3）伸長培養(yǎng)。將增殖培養(yǎng)長的再生芽剪下，接種到MS+0.5 BA+1.0 IAA+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，30 d后獲得伸長的組培苗。（4）生根培養(yǎng)。將長到5 cm的組培苗接種到1/2 MS+0. 5 NAA+20 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，經(jīng)過30 d的培養(yǎng)可以獲得理想的生根苗。本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于北美海棠組培快繁意義重大，可以直接應(yīng)用于北美海棠的工廠化育苗的生產(chǎn)。

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