超低溫冷凍技術(shù)在馬鈴薯脫毒中應(yīng)用的研究進展

康俊++劉海英

摘 要：馬鈴薯莖尖超低溫冷凍脫毒技術(shù)是超低溫保存種質(zhì)資源方法在脫毒領(lǐng)域一個新的應(yīng)用，為今后解決馬鈴薯病毒病、生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)脫毒馬鈴薯種薯提供一條嶄新的高效利用途徑。本文詳細(xì)闡述了超低溫冷凍技術(shù)在馬鈴薯脫毒中的發(fā)展過程、應(yīng)用技術(shù)原理、常用操作方法，明確指出目前馬鈴薯莖尖超低溫冷凍脫毒技術(shù)在國內(nèi)還處在探索研究階段，今后還需在冷凍材料選擇、冷凍時間等方面進行深入研究，完善馬鈴薯莖尖超低溫冷凍脫毒技術(shù)體系。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；莖尖；超低溫冷凍；脫毒

中圖分類號：S532 文獻標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.08.003

Abstract： Potato shoot tip cryotherapy is a new application methods of cryopreservation germplasm to produce high quality virus-free seed potato. This paper described the development of potato shoot tip cryotherapy technology， applied technology principles， commonly used methods of operation， clearly pointed out that the current potato shoot tip cryotherapy in China is still in the research stage to explore the future needs in the freezer in-depth research， material selection， freezing time， perfect potato virus-free shoot tip cryotherapy technology system.

Key words： potato （Solanum tuberosum L.）； shoot tip； cryotherapy； detoxification

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）在生產(chǎn)上利用的是無性繁殖方式，無性繁殖會造成病毒在植物體內(nèi)逐代積累，多代后表現(xiàn)出發(fā)生病毒病，造成大幅度的減產(chǎn)，并且感病薯塊在貯運期間會發(fā)生腐爛，對生產(chǎn)和銷售都造成很大的損失[1]。目前尚無特效藥物能治愈馬鈴薯病毒性病害[2]，生產(chǎn)上解決這一問題運用最廣泛的方法是采用熱處理結(jié)合莖尖剝離脫毒技術(shù)[3]，獲得無毒植株后再通過組織培養(yǎng)擴繁獲得大量無毒苗，在溫室或網(wǎng)室生產(chǎn)出無毒種薯用于生產(chǎn)。然而該方法存在操作技術(shù)要求高、費時、成活率和脫毒率都較低等局限[4]。近年來，一種將超低溫冷凍保存種子資源技術(shù)應(yīng)用在脫毒領(lǐng)域的方法叫cryotherapy，王子成等[5]在2011年將其翻譯為低溫療法，筆者認(rèn)為叫超低溫冷凍法更直觀。該方法已經(jīng)成功應(yīng)用在馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯Y病毒[6]、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯X病毒[7]脫除上，該操作方法剪取莖尖1～2 mm，比莖尖剝離方法需要的0.2～0.3 mm操作起來容易，操作需要的時間較短，可以避免莖尖受損變褐，培養(yǎng)需要的周期較短、脫毒率較高等，是未來馬鈴薯脫毒領(lǐng)域一條嶄新的途徑[8]。

該方法發(fā)展時間較短，目前國外研究該方法的較多，國內(nèi)報道為數(shù)不多。本文通過詳細(xì)闡述馬鈴薯莖尖超低溫冷凍脫毒技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀、技術(shù)原理以及該方法的關(guān)鍵操作技術(shù)，為廣大從事馬鈴薯脫毒領(lǐng)域的工作人員開辟一條高效的途徑提供基礎(chǔ)參考。

1 超低溫冷凍脫毒技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

超低溫冷凍脫毒法脫除植物病毒是超低溫保存種質(zhì)資源技術(shù)在植物脫毒方面的最新應(yīng)用。超低溫保存種質(zhì)資源技術(shù)早在1973年就獲得了成功，Nag和Street第一次成功利用超低溫冷凍技術(shù)保存了胡蘿卜的細(xì)胞[9]，獲得完整胡蘿卜植株。隨后許多實驗室相繼展開了有關(guān)研究工作。將超低溫保存法首次成功應(yīng)用在脫毒技術(shù)領(lǐng)域的是Brison，他在1997年成功脫除了李樹的痘病毒（PPV），得到無病毒植株，病毒脫除率達(dá)到50%，而莖尖剝離脫毒只有20%[10]。伴隨著超低溫冷凍療法研究的深入，廣泛應(yīng)用于甘薯、草莓、葡萄、馬鈴薯等多種植物的脫毒方面，并取得了很好的脫毒率。

目前在馬鈴薯病毒脫毒領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒這四種病毒的成功脫除。Wang等[6]在2006年用該方法成功脫除了馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf curl disease，PLRV）和馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY），研究結(jié)果顯示對馬鈴薯卷葉病的脫毒率為83%～86%，對馬鈴薯Y病毒的脫毒率為91%～95%，明顯高于莖尖組織培養(yǎng)的脫毒率（56%和62%）。白建明等[7]采用超低溫冷凍法和常規(guī)三種脫毒法脫除馬鈴薯X病毒（PVX），比較四種方法的脫毒率，研究結(jié)果表明，馬鈴薯的莖尖在經(jīng)過超低溫冷凍脫毒后，脫毒率為59.13%，高于高溫處理結(jié)合莖尖脫毒法的56.02%、高溫脫毒法的42.16%、莖尖剝離脫毒法的35.83%，并且超低溫冷凍后的再生植株在植物形態(tài)學(xué)上與對照無顯著差異[11]。王子成等[5]在2011年成功脫除了馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯S病毒，研究結(jié)果顯示PVY的脫除率達(dá)83%，比傳統(tǒng)莖尖剝離法的脫毒率62%要高，PVS的脫除率為47%，莖尖剝離脫毒法只有17%的脫毒率（表1）。超低溫冷凍處理技術(shù)具有脫毒效率高、容易實現(xiàn)等優(yōu)點[5]。但是不同研究者在同一種病毒馬鈴薯Y病毒脫除上脫毒率有差異，表明今后需要在技術(shù)體系上進一步優(yōu)化。目前超低溫脫毒技術(shù)主要研究集中在常見的馬鈴薯四種病毒病上，尚未見在脫除馬鈴薯A病毒和馬鈴薯S病毒方面的研究報道。

另外，超低溫冷凍法還可以應(yīng)用在去除病原菌等的感染，如超低溫冷凍法可以去除番茄小葉病植原體，其去除率達(dá)100%，而采用莖尖培養(yǎng)只有7%[12]。該方法應(yīng)用在馬鈴薯病毒脫毒方面時可以同時實現(xiàn)馬鈴薯內(nèi)源細(xì)菌等微生物感染的脫除。

2 超低溫冷凍脫毒技術(shù)的原理

超低溫冷凍脫毒法是依據(jù)超低溫對細(xì)胞的選擇性破壞這一原理，同時結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)從而達(dá)到脫除植物病毒、獲得無病毒再生植株的目的[13]。研究表明，植物病毒在植物體內(nèi)的分布呈現(xiàn)不均勻狀態(tài)，感病植株體內(nèi)的病毒含量呈離分生組織越近的細(xì)胞內(nèi)病毒含量越少，莖尖的分生組織細(xì)胞內(nèi)不含病毒或含有很少的病毒，隨著距離分生組織越遠(yuǎn)病毒的含量就越大[14]。植物莖尖分生組織的細(xì)胞較小、細(xì)胞質(zhì)濃度大、液泡小，在超低溫冷凍過程中，這些細(xì)胞由于含自由水少則形成的冰晶也少，對細(xì)胞的破壞力小，因而抗冷凍能力強，不易被凍死，經(jīng)過液氮超低溫處理后再經(jīng)過培養(yǎng)容易成活[15]而形成植株個體。隨著離分生組織細(xì)胞越遠(yuǎn)分化細(xì)胞的液泡也越大，水分含量較多，在低溫過程中容易形成較多的冰晶，從而破壞細(xì)胞而使其致死。經(jīng)過液氮-196 ℃的超低溫處理后大多數(shù)細(xì)胞受到了損傷而死亡，能夠存活下來的僅有生長點的分生組織細(xì)胞（圖1）[16]。采用該技術(shù)可以選取2 mm長度的莖尖，大大提高成功率和脫毒率。超低溫冷凍后再經(jīng)過組織培養(yǎng)手段獲得的完整再生植株就是不含病毒的植株，從而達(dá)到脫除病毒的目的[17]。該方法在脫除馬鈴薯病毒方面有廣闊的發(fā)展前景，為未來馬鈴薯脫毒技術(shù)提供一條高效的新途徑。

3 超低溫冷凍療法常用的不同冷凍降溫方法

研究表明，不同材料采用超低溫冷凍法脫毒時冷凍降溫方法直接關(guān)系到成苗率，選擇合適的冷凍方法對脫毒成功與否至關(guān)重要。不同冷凍降溫方法各有優(yōu)缺點，根據(jù)材料特性選擇適合的方法（表2）。目前常用的冷凍方法[18]有：快速降溫法、慢速冷凍法、逐級冷凍法、干燥冷凍法、玻璃化冷凍法、包埋玻璃化法等。直接將預(yù)培養(yǎng)材料投入液氮中的快速降溫法具有操作簡單、不需要特殊設(shè)備的優(yōu)點，但是對含水量高的愈傷組織其成活率為零，不適用該方法。將材料從0 ℃逐漸降到-100℃，使得其細(xì)胞中的含水量逐漸流出到細(xì)胞外，細(xì)胞中的含水量降到最低程度，然后再從-100 ℃直接投入液氮中降到-196 ℃，這樣可以避免水分在細(xì)胞中結(jié)冰而破壞細(xì)胞，這種慢速冷凍法可以提高成活率。一般細(xì)胞在-10 ℃時細(xì)胞外的介質(zhì)基本形成結(jié)晶，而細(xì)胞內(nèi)部并未結(jié)冰，這樣形成細(xì)胞內(nèi)外的蒸氣壓差，如果使細(xì)胞在不同低溫下-20，-50，-70，-100 ℃下各處理一段時間[22]，使細(xì)胞內(nèi)的水溶液在蒸氣壓下向細(xì)胞外不斷擴散，脫水后細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)逐漸發(fā)生濃縮，其冰點降低，再投入液氮中時就減弱低溫結(jié)冰對細(xì)胞造成的傷害，大大提高回復(fù)率和成活率，這種逐級冰凍方法在多數(shù)材料超低溫保存中獲得成功。對于含水量較高的愈傷組織，采用將材料進行脫水預(yù)處理，然后迅速投入液氮。這樣細(xì)胞經(jīng)過脫水處理后細(xì)胞內(nèi)部含水量大大降低，原生質(zhì)的濃度大大提高，提高愈傷組織的冷凍處理后的恢復(fù)成活率[23]。用一種保護劑PVS2[其組成為：30%（W/V）甘油+15%（W/V）乙二醇+15%（W/V）DMSO+0.4 mol/L蔗糖]對材料進行處理后再迅速投入到液氮中，細(xì)胞經(jīng)過保護劑處理后可以避免細(xì)胞胞內(nèi)外形成冰晶，而形成玻璃化狀態(tài)，這種方法成活率高[24]，但是很容易脫水過度，影響成活率，采取與逐級冷凍法結(jié)合處理來提高恢復(fù)率。當(dāng)材料較多時，可以先采用褐藻酸鈣將材料進行包埋，然后用高蔗糖濃度的培養(yǎng)基脫水預(yù)處理，再用干燥的硅膠進行脫水處理，再迅速投入到液氮中[25]。為了保證成活率，經(jīng)常結(jié)合幾種冷凍降溫方法合并使用。

4 馬鈴薯莖尖超低溫冷凍脫毒法的關(guān)鍵操作步驟

馬鈴薯莖尖超低溫冷凍脫毒方法一般按照選擇材料、切取莖尖、預(yù)培養(yǎng)、預(yù)處理、超低溫冷凍、解凍、恢復(fù)培養(yǎng)、脫毒效果檢測、組織培養(yǎng)擴繁這幾個步驟來獲得再生植株，經(jīng)過病毒檢測后，無毒植株用于生產(chǎn)脫毒馬鈴薯種薯（圖2）。

4.1 選擇材料

馬鈴薯不同部位的組織經(jīng)過超低溫冷凍處理后細(xì)胞的存活力有明顯差異。一般細(xì)胞體積小、細(xì)胞質(zhì)較濃、液泡少的分生組織細(xì)胞會比液泡大的成熟的分化細(xì)胞再生能力強、成苗率也高[26]。研究發(fā)現(xiàn)選擇馬鈴薯莖尖分生組織作為處理對象，可以提高成苗率，有利于獲得脫毒苗[5]。

4.2 預(yù)培養(yǎng)材料

材料通過預(yù)培養(yǎng)使得細(xì)胞適度脫水，減少細(xì)胞內(nèi)自由水含量，可以提高細(xì)胞的抗冷凍能力[18]，從而提高成活率。目前最常用的預(yù)培養(yǎng)方式是在培養(yǎng)基中添加一些使細(xì)胞脫水的保護性物質(zhì)，可以選用蔗糖、二甲基亞砜、甘露醇等。在高濃度保護性物質(zhì)處理之前選用0～5 ℃的低溫馴化，可以明顯提高成活率[27]。

馬鈴薯莖尖可以切取2～3 mm大小，然后放在0.3 mol·L-1高蔗糖濃度的預(yù)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)一天，光照16 h，光照強度2 000 lx。高濃度的蔗糖可增加培養(yǎng)基的滲透壓，使得馬鈴薯莖尖組織的細(xì)胞脫水，從而減少細(xì)胞內(nèi)自由水的含量。

4.3 保護劑處理

常用的抗冷凍保護劑是能夠穿透細(xì)胞膜的化合物DMSO和各種糖類物質(zhì)，通過促進細(xì)胞膜對水分的通透性，降低細(xì)胞內(nèi)水分冰點溫度，避免胞內(nèi)外冰晶形成，保護細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)[28]。保護劑的選擇是超低溫處理成功的關(guān)鍵因素，好的保護劑應(yīng)該滿足對細(xì)胞毒性小、易溶于水、解凍后容易從細(xì)胞中清洗掉等要求。目前常用Sakai于1990年創(chuàng)立的按照一定配方合成的多種保護劑復(fù)合液，被稱為植物材料玻璃化溶液（plant vitrification solution，PVS）[24]。

將預(yù)培養(yǎng)一天后的馬鈴薯莖尖加載到PVS2溶液中，其中PVS2液的成分為：MS+30%（W/V）甘油+15%（W/V）乙二醇+15%（W/V）二甲基亞砜（DMSO）+0.4 mol·L-1蔗糖[24]。具體方法是用移液管吸取15 μL的PVS2溶液加在0.03 mm厚的1.0 cm×4.0 cm的鋁箔上，然后將預(yù)培養(yǎng)后的馬鈴薯莖尖裝載到PVS2液滴中，室溫25 ℃下處理20 min，成活率可達(dá)90%[5]。

4.4 液氮冷凍處理

將包裹有馬鈴薯莖尖的鋁箔在液氮中蘸一下，然后把鋁箔條放入1.5 mL離心管中，再將離心管置于液氮中超低溫處理1 h。

4.5 解凍洗滌

對超低溫處理后的材料需要馬上進行解凍，常用的解凍方法有兩種：一是快速解凍法，適合于大多數(shù)材料，具體做法是將液氮中冷凍1小時后的材料放于25～40 ℃的水浴鍋中進行解凍1～3 min完全融化后取出材料，避免水浴溫度對細(xì)胞的熱傷害以及保護劑對細(xì)胞的毒害作用。另一種是慢速解凍法，適用于經(jīng)過低溫馴化或者經(jīng)過脫水處理的材料，把液氮處理1 h后的材料在0 ℃下慢速解凍30 min左右。

解凍后的材料一般都需要立刻洗滌，為了除去細(xì)胞內(nèi)含的高濃度保護劑，避免對恢復(fù)培養(yǎng)的影響。最常用的洗滌方法是室溫下用含1～2 mol·L-1蔗糖濃度的培養(yǎng)基洗滌10 min左右[29]。

在無菌超凈工作臺中，將液氮處理1 h后的包裹馬鈴薯莖尖鋁箔條從離心管中取出，然后迅速放入加有1.2 mol·L-1蔗糖濃度的液體MS培養(yǎng)基中洗滌2～3次，每次10 min[28]。

4.6 恢復(fù)培養(yǎng)

經(jīng)過洗滌后的材料需要立即轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)將材料先培養(yǎng)在黑暗或弱光下一段時間后，再在正常光照下有利于形成再生植株[28]。

將洗滌后的馬鈴薯莖尖在無菌超凈工作臺中取出，用無菌紙吸去殘留在材料表面的洗滌培養(yǎng)基，接種到固體恢復(fù)培養(yǎng)基（MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 GA3）上進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件選擇先黑暗培養(yǎng)7 d，再在弱光1 000 lx下培養(yǎng)7 d，然后正常光照2 000 lx培養(yǎng)。當(dāng)分化出根芽后轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上，1個月就可獲得完整植株，統(tǒng)計成活率[11]。

4.7 病毒檢測

對再生馬鈴薯試管苗用酶聯(lián)免疫法進行病毒檢測[30]，只有不帶病毒的組培苗才可以進行組織培養(yǎng)擴繁，用于生產(chǎn)無毒馬鈴薯種薯。

5 馬鈴薯莖尖超低溫脫毒技術(shù)發(fā)展前景展望

傳統(tǒng)脫毒方法如莖尖分生組織培養(yǎng)進行脫毒依據(jù)的原理是莖尖分生組織不含有病毒，獲得脫毒苗的成功率與切取莖尖分生組織的大小是成反比的[30-31]，所以采用莖尖分生組織培養(yǎng)進行脫毒時，要求切取0.2～0.5 mm大小的帶有1～2個葉原基的莖尖分生組織，切取莖尖越小操作越困難，對莖尖損傷程度也越嚴(yán)重，越容易褐變，越易發(fā)生變異，獲得再生植株也越困難，使得這種方法的成活率和脫毒率都不高，并且所用周期較長，一般需要2～3個月的時間才可以得到完整植株。而利用超低溫冷凍法進行脫毒時所剝?nèi)〉那o尖一般比較大，為1～3 mm，就有如下優(yōu)點：操作較容易、過程比較簡單且成活率較高、需要的時間周期較短，一般需要1個月左右的時間即可得到成活的試管苗。莖尖超低溫冷凍處理為脫毒開辟了一條嶄新的途徑，已發(fā)展成為一項新的生物技術(shù)，將逐步替代傳統(tǒng)的脫毒方法[32]。

該方法今后主要從如下方面發(fā)展，篩選出針對脫出馬鈴薯特定病毒的操作技術(shù)體系，如前所述，同樣在脫除馬鈴薯Y病毒（PVY）的研究中，Wang的脫除率為91%～95%，王子成的研究結(jié)果是脫毒率為83%，脫毒效率有明顯差異，今后需要針對超低溫脫毒方法的具體操作過程中涉及的冷凍保護劑配方、處理時間、處理條件等方面進行深入研究，篩選出適合脫除每一種常見馬鈴薯病毒需要的保護劑配方以及處理條件，得到最優(yōu)的技術(shù)體系。

通過研究的不斷深入，超低溫冷凍脫毒技術(shù)可以更好更高效地用在馬鈴薯病毒脫毒方面，為解決馬鈴薯病毒病危害提供全新的高效途徑。

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