多主棒孢菌孢子及粗毒素懸液對(duì)黃瓜防御酶系活性的影響

高葦++王勇++張春祥

摘 要：本研究探討侵染黃瓜的多主棒孢菌孢子懸液和粗毒素提取液對(duì)黃瓜主要防御酶系活性的影響，從生理生化水平揭示多主棒孢菌毒素在病原致病過(guò)程中的作用機(jī)理。在室內(nèi)條件下測(cè)定多主棒孢菌孢子及其粗毒素懸液作用后，黃瓜植株體內(nèi)防御酶系過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性變化。結(jié)果表明：多主棒孢菌孢子和毒素懸液處理黃瓜葉片后，黃瓜植株體內(nèi)POD酶和PPO酶活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，粗毒素懸液作用下酶活力在24 h時(shí)可達(dá)到最大值；而在孢子懸浮液作用下酶活力在48 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后顯著降低，120 h后低于未處理的對(duì)照。在病原菌初期誘導(dǎo)作用下，SOD酶活性逐漸升高在72 h時(shí)達(dá)到最大；毒素接種黃瓜葉片后，SOD酶活性在48 h達(dá)到峰值，達(dá)到峰值后2個(gè)處理的SOD酶活性顯著降低但均高于對(duì)照。本研究證明多主棒孢菌粗毒素對(duì)黃瓜寄主防御酶活性與其病原真菌孢子的作用具有一定相似性，酶活性峰值增加比率相近，前者比后者增加峰出現(xiàn)早，毒素誘導(dǎo)作用后防御酶活性最終高于未接種處理，黃瓜對(duì)其侵染的抵抗力得以維持，而在孢子懸液的作用下寄主的抵抗力隨著其侵染的擴(kuò)展而降低。

關(guān)鍵詞： 多主棒孢菌；粗毒素；防御酶系；活性

中圖分類(lèi)號(hào)： S642.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.08.002

Abstract： The aim of this study is to explore the effects of spores and crude toxins of Corgnespora cassiicola on the activity of defensive enzymes of cucumber. It was revealed that the pathogenic mechanism of crude toxin of Corgnespora cassiicola in physiology and biochemistry level. The effects of spores and crude toxins of Corgnespora cassiicola on the activity of defensive enzymes （POD， PPO and SOD） of cucumber were detected under laboratory conditions. The resulted showed that the activity of POD and PPO enzymes first increased and then decreased. The activity of enzymes reached the maximum within 24 h under infected crude toxin；the activity of enzymes reached the peak value at 48 h after infecting conidia of Corgnespora cassiicola， then the value declined with increasing hours， and at finally it was lower than the treatment without infected. The activity of SOD enzymes reached the peak value at 72 h with infecting conidia of Corgnespora cassiicola， and at 48 h with infecting crude toxin of this pathogen. After this moment the values of SOD enzymes decreased significantly but still were higher than the value in control. The results of the study demonstrated that Corgnespora cassiicola crude toxin had similar effects on the defense-enzyme activity of cucumber as spores of this pathogen did， and changes of activity induced by crude toxin in cucumber seedlings was closely related to induced by spores. The resistant of cucumber was conducted with the crude toxin of Corgnespora cassiicola， but it was significantly decreased under the infection and extension of the spores of this pathogen.

Key words：Corynespora cassiicola；crude toxin；defensive enzymes； activity

黃瓜棒孢葉斑病，又名黃瓜靶斑病、黃瓜褐斑病，是一種世界性分布的病害，主要危害黃瓜葉片，在葉片上形成大量圓形或不規(guī)則的黃褐色病斑，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)能引起黃瓜枯萎、早衰[1]。目前，美國(guó)[2]、歐洲一些國(guó)家[3]、日本[4]、韓國(guó)[5]等很多國(guó)家均有該病發(fā)生和危害的報(bào)道。20世紀(jì)90年代該病僅在我國(guó)的遼寧、河南等黃瓜保護(hù)地上發(fā)生，至2005年在我國(guó)山東、河北、遼寧等多個(gè)省份均有發(fā)生報(bào)道，造成了嚴(yán)重的危害，上升為黃瓜生產(chǎn)中的主要病害[6]。黃瓜棒孢葉斑病的病原為多主棒孢（Corynespora cassiicola），是一種重要的植物病原真菌，寄主范圍極為廣泛[7]，可以產(chǎn)生寄主選擇性毒素[8]。通過(guò)對(duì)侵染橡膠葉片的多主棒孢毒素作用機(jī)理的研究，發(fā)現(xiàn)該毒素可以促進(jìn)寄主和病原菌之間的相互作用，誘導(dǎo)寄主感病[9-10]。目前，對(duì)于侵染黃瓜的多主棒孢病原菌的研究主要集中在病原學(xué)和防治手段的建立方面，而對(duì)于其病原致病機(jī)理、毒素活性的研究報(bào)道較少。本研究測(cè)定在多主棒孢菌孢子及其次生代謝產(chǎn)物毒素懸液作用下，黃瓜植株體內(nèi)防御酶系過(guò)氧化物酶（ POD）、多酚氧化酶（PPO），和超氧化物歧化酶（SOD）的活性變化，通過(guò)其活性變化的比較揭示多主棒孢菌毒素在病原致病過(guò)程中的作用機(jī)理，為進(jìn)一步研究黃瓜與多主棒孢菌互作關(guān)系，以及抗病育種工作的開(kāi)展提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）HG2：從天津武清區(qū)黃瓜棒孢葉斑病發(fā)病葉片上分離純化獲得，保存于天津市植物保護(hù)研究所種苗病害研究室。

1.2 方 法

1.2.1 多主棒孢菌孢子懸浮液的制備 將PDA斜面保存的多主棒孢菌HG2菌株在PDA平板上活化，然后在PDA培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，用滅菌的刮菌器刮下菌絲孢子，配成濃度為1×105 個(gè)·mL-1的孢子懸液備用。

1.2.2 多主棒孢菌粗毒素懸液的制備 將活化的HG2菌塊接種于150 mL改良的Czapek液體培養(yǎng)基中，每瓶接種5個(gè)菌塊，25 ℃恒溫，120 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)。將培養(yǎng)液通過(guò)雙層滅菌的濾紙過(guò)濾除去菌絲體，然后用0.22 μm的微孔濾膜加壓抽濾，獲得無(wú)菌濾液。將獲得的無(wú)菌濾液保存于-4 ℃冰箱備用。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 栽培黃瓜苗，在黃瓜植株長(zhǎng)出5片真葉時(shí)期，采用噴霧接種法在葉片上均勻地接種多主棒孢菌懸液和粗度素懸液。接種后保濕24 h，然后常規(guī)管理。每天觀察植物葉片上的發(fā)病情況和癥狀變化。自接種后0，1，3，5，7，10，15， 20，25，30 d分別取同一葉齡的葉片，裝入樣品袋中，放于-20 ℃冰箱中保存。每處理3次重復(fù)。

1.2.4 防御酶活性的測(cè)定 對(duì)1.2.3各處理中的黃瓜在自接種后0，1，3，5，7，10，15，20，25，30 d分別取同一葉齡的葉片，每處理3個(gè)重復(fù)，測(cè)定黃瓜葉片過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD） 3種防御酶的活性，3種酶液的提取及活性測(cè)定參考耿銳梅的方法[11]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，按照單因素隨機(jī)方差分析模型，采用Duncan氏新復(fù)極差法對(duì)同一時(shí)間不同處理的酶活變化進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多主棒孢菌孢子及粗毒素懸液對(duì)黃瓜葉片過(guò)氧化物酶（POD）活性的影響

多主棒孢菌孢子和毒素懸液處理黃瓜葉片后，引起黃瓜植株體內(nèi)POD酶的活性顯著增加（圖1）。經(jīng)多主棒孢孢子懸浮液處理后，黃瓜葉片產(chǎn)生POD酶活力在0～48 h內(nèi)顯著升高，在48 h時(shí)達(dá)到最大值57.93 U·g-1·min-1，48 h后隨著病原菌的繁殖、病斑的侵染擴(kuò)散，黃瓜葉片上的POD酶活性顯著降低，120 h后POD酶的活性顯著低于未接種處理的空白對(duì)照。經(jīng)毒素噴霧接種的處理，黃瓜植株體內(nèi)POD酶的活性也顯著升高，0～48 h內(nèi)POD酶活力升高的幅度顯著高于接種孢子懸液的處理，在24 h時(shí)達(dá)到最大值43.70 U·g-1·min-1，低于接種孢子懸浮液處理的POD酶活力的峰值，隨著毒素接種時(shí)間的延長(zhǎng)，24 h后POD酶活力顯著降低，但其始終高于未接種處理的對(duì)照。

2.2 多主棒孢菌孢子及粗毒素懸液對(duì)黃瓜葉片多酚氧化酶（PPO）活性的影響

多主棒孢菌孢子和毒素懸液處理黃瓜葉片后，引起黃瓜植株體內(nèi)PPO酶的活性顯著變化（圖2）。多主棒孢孢子懸浮液噴施的黃瓜葉片PPO酶活力在0～48 h內(nèi)呈現(xiàn)顯著的升高， 48 h時(shí)酶活力達(dá)到最大值669.33 U·g-1·min-1，48 h后PPO的酶活力顯著下降，到120 h后酶活力低于未處理的空白對(duì)照。毒素懸液處理的黃瓜葉片，在0～24 h內(nèi)PPO酶的活性顯著升高，24 h時(shí)達(dá)到最大631.27 U·g-1·min-1，略低于病原菌孢子懸浮液處理的黃瓜葉片內(nèi)的PPO酶活力的峰值，24 h后毒素懸液處理的黃瓜體內(nèi)PPO酶活力逐漸降低，但始終高于空白對(duì)照黃瓜葉片上PPO酶活力。

2.3 多主棒孢菌孢子及粗毒素懸液對(duì)黃瓜葉片超氧化物歧化酶（SOD）酶活性的影響

多主棒孢菌孢子和毒素懸液處理黃瓜葉片后，對(duì)黃瓜植株體內(nèi)的SOD酶活性具有顯著的影響（圖3），不同時(shí)間段測(cè)定的SOD酶活性均顯著高于未經(jīng)處理的對(duì)照葉片，說(shuō)明在病原及毒素的誘導(dǎo)下黃瓜植株對(duì)其脅迫產(chǎn)生一定的抗性應(yīng)答。在多主棒孢孢子懸浮液作用下，黃瓜植株體內(nèi)的SOD酶活性在0～72 h時(shí)內(nèi)出現(xiàn)緩慢上升，說(shuō)明在病原菌初期的誘導(dǎo)作用下，黃瓜對(duì)其侵染做出一定的應(yīng)答，在病原侵入繁殖的72 h時(shí)達(dá)到最大為58.20 U·g-1·min-1，而后隨著病原菌的大量繁殖與侵染面積的擴(kuò)大，其對(duì)病原脅迫的抵御力降低，表現(xiàn)在測(cè)定的SOD酶活性也逐漸降低。在毒素接種黃瓜葉片后，0～24 h內(nèi)黃瓜葉片對(duì)其脅迫的應(yīng)答較不敏感，SOD酶活性變化不顯著，而24～48 h后，黃瓜葉片對(duì)脅迫作出強(qiáng)烈應(yīng)答，毒素接種的葉片內(nèi)SOD酶活性顯著升高至48 h達(dá)到峰值為67.71 U·g-1·min-1，隨后SOD酶活性顯著降低但均高于對(duì)照。通過(guò)對(duì)病原孢子懸液和毒素懸液處理后黃瓜葉片內(nèi)SOD酶活性的比較發(fā)現(xiàn)，毒素對(duì)SOD酶活性的誘發(fā)作用顯著高于病原菌菌懸液，表現(xiàn)在毒素作用后SOD酶活性的峰值出現(xiàn)時(shí)間早于且高于菌懸液處理。

3 結(jié)論與討論

植物病原真菌寄主選擇性毒素對(duì)寄主植物具有特異性生理活性和專(zhuān)化性作用位點(diǎn)，可誘發(fā)寄主產(chǎn)生典型的病害癥狀[12]，該毒素可認(rèn)為是一種致病因子，對(duì)病害的發(fā)生起決定性作用，可以對(duì)寄主的生理生化代謝、酶系統(tǒng)活性及核酸代謝等產(chǎn)生顯著的影響[13]。目前已發(fā)現(xiàn)有隸屬于9個(gè)屬下的21種病原真菌可以產(chǎn)生寄主選擇性毒素[12]。寄主植物受到病原菌的侵染時(shí)，植物體內(nèi)發(fā)生復(fù)雜變化，其中：過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）可抵御逆境中過(guò)量的活性氧對(duì)寄主細(xì)胞膜的損害[14-15]；多酚氧化酶（PPO）是植物組織中的末端氧化酶，是抵御病原物入侵的重要防御酶[16]。而在此過(guò)程中，毒素因子對(duì)其相關(guān)代謝酶活性的影響是否存在一定作用，在誘發(fā)寄主植物感病中的作用方式是毒素致病機(jī)理研究的途徑之一[17-18]。

本研究對(duì)酚類(lèi)代謝相關(guān)酶如過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）及過(guò)氧化物代謝相關(guān)酶超氧化物歧化酶（SOD）在病原多主棒孢菌孢子懸浮液和毒素溶液分別處理作用下黃瓜葉片內(nèi)酶活性變化情況的測(cè)定，分析不同因素對(duì)黃瓜葉片脅迫力的大小，及黃瓜葉片對(duì)脅迫反應(yīng)的抵御能力，從而推測(cè)多主棒孢毒素的作用機(jī)理。

研究表明，寄主植物黃瓜在受到多主棒孢菌孢子懸液和毒素危害后，各處理黃瓜葉片中的過(guò)氧化物酶（ POD）、多酚氧化酶（PPO）及過(guò)氧化物代謝相關(guān)酶超氧化物歧化酶（SOD）的活性均呈現(xiàn)了顯著的升高，高于未接種處理的葉片，毒素處理的葉片酶活性高峰值的出現(xiàn)均比菌懸液處理的早出現(xiàn)24 h，說(shuō)明毒素懸液對(duì)寄主體內(nèi)酶活的激發(fā)作用強(qiáng)于菌懸液處理。而隨著病原菌的繁殖、侵染、擴(kuò)散，黃瓜本身對(duì)病原菌的抵御力降低，在大量病原菌的威脅下相應(yīng)的酶活性出現(xiàn)顯著的降低，低于對(duì)照未處理植株體內(nèi)的酶活性。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，多主棒孢菌孢子懸液和毒素對(duì)黃瓜葉片細(xì)胞POD、PPO和SOD活性的影響具有一定的相似性，說(shuō)明病原孢子和毒素在對(duì)寄主酶系統(tǒng)活性的影響中具有基本一致的作用，毒素可以代替病原菌開(kāi)展作用機(jī)理的研究。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)毒素對(duì)寄主植物的激發(fā)作用要強(qiáng)于菌懸液，毒素的產(chǎn)生可促進(jìn)病原菌的侵染。由于黃瓜棒孢葉斑病發(fā)病癥狀具有多樣性，寄主與病原間存在復(fù)雜的互作關(guān)系，要徹底了解多主棒孢菌及其毒素在病原致病過(guò)程中的作用機(jī)制，還需要更多的研究。

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