疏風(fēng)宣肺解毒方對流感病毒性肺炎小鼠基因表達(dá)譜的影響

劉琪，翟春濤，王建國，馬彥平，元海軍，楊琬芳，凌莎莎，智鵬，馮振宇

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024；2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山西太原030013）

疏風(fēng)宣肺解毒方對流感病毒性肺炎小鼠基因表達(dá)譜的影響

劉琪1，翟春濤1，王建國2，馬彥平1，元海軍1，楊琬芳1，凌莎莎1，智鵬1，馮振宇2

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024；2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山西太原030013）

目的：采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選疏風(fēng)宣肺解毒方治療流感病毒感染小鼠相關(guān)的差異表達(dá)基因，初步探討方藥治療流感的作用機(jī)制。方法：流感病毒肺適應(yīng)株FM1滴鼻感染小鼠，建立小鼠流感病毒性肺炎模型，方藥灌胃治療4 d，提取肺組織總RNA，與小鼠全基因表達(dá)譜芯片雜交后進(jìn)行檢測。對篩選得到的藥物治療過程中的差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果：基因芯片結(jié)果顯示，與模型組相比，給藥組表達(dá)量發(fā)生變化的基因中上調(diào)的有2 659條，下調(diào)的有2 216條。結(jié)論：疏風(fēng)宣肺解毒方作用涉及免疫學(xué)方面的分子功能為：胞內(nèi)信號級聯(lián)放大效應(yīng)，漿膜、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增生的調(diào)節(jié)，免疫防御及細(xì)胞程序性死亡等；主要調(diào)節(jié)的代謝途徑有：絲裂原活化蛋白激酶信號通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、腫瘤信號通路、toll樣受體信號通路、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子途徑、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用及趨化因子信號通路等。

基因芯片；疏風(fēng)宣肺解毒方；流感病毒

基因芯片技術(shù)是建立在基因探針、雜交測序技術(shù)上的一種快速高效的核酸序列分析方法，在分子生物學(xué)、人類基因?qū)W前瞻性研究中起著革命性的重大意義?；蛐酒呙芏鹊娘@微排陣，大批量地篩選基因和巨大的功能信息處理等特點(diǎn)，為研究十分復(fù)雜的生命現(xiàn)象及疾病等提供了一個(gè)先進(jìn)方法［1-2］。疏風(fēng)宣肺解毒方是山西省名老中醫(yī)、山西省實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)帶頭人王世民教授根據(jù)山西省的自然條件擬定的方藥。通過基因芯片實(shí)驗(yàn)檢測疏風(fēng)宣肺解毒方對流感病毒性肺炎小鼠基因表達(dá)譜的影響，將為進(jìn)一步研究方藥的作用靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 流感病毒流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株FM1由本實(shí)驗(yàn)室-75℃冰箱保存。復(fù)蘇后，于9日齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代3次后，測定血凝滴度為28。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物體質(zhì)量14~15 g的SPF雄性ICR小鼠，合格證號為0194691；小鼠及飼料均由北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司提供；實(shí)驗(yàn)動物潔凈柜中飼養(yǎng)，環(huán)境保持室溫（26±2）℃，相對濕度（50±10）%。

1.1.3 藥物疏風(fēng)宣肺解毒方由菊花、桑葉、杏仁、桔梗、連翹、柴胡等組成，顆粒劑，山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥房制備。陽性對照藥物為達(dá)菲（磷酸奧司他韋膠囊），75mg。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組與造模ICR小鼠40只，隨機(jī)分為4組，正常組（N）、模型組（M）、達(dá)菲對照組（C）、疏風(fēng)宣肺解毒方組（S），每組10只。將各組小鼠用乙醚輕度麻醉，正常組以0.05mL生理鹽水滴鼻，其余各組以0.05 mL的4LD50流感病毒FM1稀釋液滴鼻感染小鼠。感染后2 h灌胃給藥。N、M組灌服蒸餾水，C組灌服達(dá)菲2.5 g/mL/d。按照人與小鼠體表面積換算出給藥劑量。S組灌服疏風(fēng)宣肺解毒方藥。1次/d，0.2mL/次，連續(xù)給藥4 d。第5天禁食不禁水8 h，摘眼球放血致死，無菌摘取全肺，存于液氮中凍存，用于提取總RNA。

1.2.2 樣本RNA提取與純化取各組樣本約100 mg，液氮中快速研磨，加入1mL Trizol，移至預(yù)冷的EP管。4℃，12 000 rpm，離心15min，移出上清液，加入0.2mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置2min。12 000 rpm，離心15min，收集上清，加入等體積的異丙醇，室溫放置20min。4℃，15 000 rpm，離心10 min，棄上清液，加入1 mL 75% RNase-free乙醇洗滌。4℃，7 500 rpm，離心5min。棄上清液，干燥3min。再加入50μL RNase-free水溶解RNA。獲取各組樣本總RNA，經(jīng)紫外分光光度儀測定OD值，甲醛變性凝膠電泳檢測［3］。

1.2.3 芯片檢測采用晶芯小鼠27K全基因組表達(dá)譜芯片分別測定4組差異基因的表達(dá)情況，均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。應(yīng)用cRNA擴(kuò)增試劑盒將總RNA樣品放大，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，將熒光標(biāo)記的樣本加入雜交液，進(jìn)行基因芯片雜交檢測［4-5］。將芯片上的水分清除后，將芯片置于黑色的盒中保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理掃描雜交芯片，計(jì)算探針訊號在各組與M組的強(qiáng)度比值，I為訊號強(qiáng)度。篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)為：上調(diào)基因要求P值＜0.05，且log2比值＞1，下調(diào)基因要求P值＜0.05且log2比值＜-1。本研究利用NCBI數(shù)據(jù)庫、KEGG基因組信息數(shù)據(jù)庫等，對差異基因進(jìn)行GO功能富集分析和代謝途徑富集分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，顯著性比較選用單因素方差分析法，兩組間比較應(yīng)用LSD多重分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取

四組樣本提取總RNA的Ratio比值OD260/ OD280≥1.8，電泳檢查有清晰的RNA條帶，28 S和18 S比值在2/1以上，證明提取的RNA保持了良好的完整性，無降解，符合基因芯片的質(zhì)量檢測要求。

電泳圖中清晰地顯示28S及18S核醣體RNA的片段，可直觀顯示RNA樣品提取的質(zhì)量（見圖1）。如果樣品總RNA在提取過程中嚴(yán)重降解，則電泳圖上不會呈現(xiàn)清楚的兩個(gè)片段。

2.2 差異基因聚類分析

四組樣本經(jīng)基因芯片技術(shù)擴(kuò)增后，得到差異基因的聚類分析圖，每組都包括三個(gè)技術(shù)重復(fù)。經(jīng)軟件分析，S組與M組相比，共得到了數(shù)千條差異基因，包括上調(diào)的和下調(diào)的。如表1所示。

圖1 樣本RNA提取電泳圖

表1 各組差異基因數(shù)目

2.3 差異基因GO功能富集分析

對疏風(fēng)宣肺解毒方樣本組的差異基因進(jìn)行GO term節(jié)點(diǎn)富集分析，選取GO節(jié)點(diǎn)要求符合P＜0.05并且涉及的基因數(shù)不小于70。方藥治療組涉及到GO分子功能節(jié)點(diǎn)的有許多方面，包括生物、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。我們選取了疏風(fēng)宣肺解毒方調(diào)節(jié)的與免疫學(xué)相關(guān)的主要的分子功能，從表2中可以看出，包括：GO：0007242～intracellular signaling cascade（胞內(nèi)信號級聯(lián)放大效應(yīng)）、GO：0005886～plasmamembrane（漿膜）、GO：0006955～immune response（免疫應(yīng)答）、GO：0042127～regulation of cell proliferation（細(xì)胞增生）、GO：0006952～defense response（免疫防御作用）及GO：0042981～regulation of apoptosis（細(xì)胞程序性死亡）等。另外，GO：0043167～ion binding（離子結(jié)合作用）、GO：0000166～nucleotide binding（核苷酸結(jié)合作用）等方面的分子功能作用顯著，為方藥作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)，也為多個(gè)學(xué)科的交叉研究指明了方向。

表2 疏風(fēng)宣肺解毒方藥組差異基因的分子功能富集

2.4 差異基因的代謝途徑富集分析

在KEGG數(shù)據(jù)庫中，對疏風(fēng)宣肺解毒方組的差異基因調(diào)節(jié)的代謝通路進(jìn)一步分析，要求P＜0.01并且涉及的基因數(shù)不小于3，篩選處的差異基因主要調(diào)節(jié)的代謝途徑有：MAPK signaling pathway（絲裂原活化蛋白激酶信號通路）、Cytokine-cytokine receptor interaction（細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用）、Pathways in cancer（腫瘤信號通路）、Toll-like receptor signaling pathway（Toll樣受體信號通路）、Jak-STAT signaling pathway（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子途徑）、Natural killer cellmediated cytotoxicity（自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用）及Chemokine signaling pathway（趨化因子信號通路）等。差異基因的代謝途徑富集分析過程顯示P值較小，差異顯著，富集程度較高，結(jié)論比較可靠。

3 討論

將具有相似表達(dá)譜的樣品聚集成一類，也可以理解為檢測同一類樣本之間的重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)樣品各組能聚到一類，說明同一類樣本間的重復(fù)性較好［6］。

實(shí)驗(yàn)四組樣本中涉及到的所有基因組進(jìn)行基因本體論分析，表明分子功能方面涉及到基因組包括跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、受體激動機(jī)制等。細(xì)胞組分方面涉及到細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)膜等。生物學(xué)過程方面涉及到氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄等環(huán)節(jié)。然后，分別對疏風(fēng)宣肺解毒方與模型組比較的差異基因從GO term和pathway兩個(gè)角度進(jìn)行深入分析［7］。

疏風(fēng)宣肺解毒方對流感病毒感染小鼠的基因表達(dá)譜具有顯著的影響。對方藥組的差異基因進(jìn)行GO term節(jié)點(diǎn)富集分析，按照P＜10-4，且涉及的基因數(shù)分別為不小于70取GO節(jié)點(diǎn)，對疏風(fēng)宣肺方涉及免疫學(xué)方面的分子功能為：胞內(nèi)信號級聯(lián)放大效應(yīng)、漿膜、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增生的調(diào)節(jié)、免疫防御及細(xì)胞程序性死亡等。在KEGG數(shù)據(jù)庫中，對差異基因涉及的代謝通路進(jìn)行進(jìn)一步分析。代謝途徑P值較小，差異顯著，富集程度較高。從代謝路分析結(jié)果可知，其主要通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶信號通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、toll樣受體信號通路、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄、趨化因子信號通路等達(dá)到治療流感的作用。課題組將重點(diǎn)對與流感有關(guān)的相關(guān)信號通路的差異基因進(jìn)一步分析。

［1］劉嬌.應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究心血管活性藥物導(dǎo)致心肌損傷的機(jī)理［D］.武漢：華中科技大學(xué)，2011.

［2］軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物芯片研究進(jìn)展［J］.中國科學(xué)，2011，41（10）：790-795.

［3］Huihui Chen，Hui Sun，F(xiàn)uping You，etc.Activation of STAT6 by STING is critical for antiviral innate immunity［J］.Cell，2011，147：436-446.

［4］季旭明，程明，王世軍，等.大黃及其含藥血清指紋圖譜比較分析［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36（1）：69-71.

［5］Ying Yang，Xiaogang Shu，Dan Liu，etc.EPAC Nullmutation impairs learning and social interactions via aberrant regulation of miR-124 and Zif268 Translation［J］.Neuron，2012，73（2）：774-788.

［6］李昊，楊慧萍，魯小青.應(yīng)用基因芯片研究藤梨根對胃癌細(xì)胞的作用［J］.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，31（1）：45-52.

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（編輯：張世霞）

Effects of Shufeng Xuanfei Jiedu formula on whole genome expression profiles of pneumonia m ice infected w ith influenza virus

Liu Qi1，Zhai Chuntao1，Wang Jianguo2，Ma Yanping1，Yuan Haijun1，YangWanfang1，Ling Shasha1，Zhi Peng1，F(xiàn)eng Zhenyu2
（1.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan Shanxi 030024；2.Shanxi Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine，Taiyuan Shanxi030013）

Objective：To study the effects of Shufeng Xuanfei Jiedu Formula on whole expression profiles ofmice infected with influenza virus FM1by the gene chip technology，and analyze themechanism of the formula on gene level.Methods：Established the model of Pneumonia by nasal dropping influenza virus A in mice.Total RNA was extracted in each groups.Then gene chipswere used to screen these RNA samples.Calculated the probe signal intensity ratio in each group vs model group.Results：By Shufeng Xuanfei Jiedu formula group compared with themodel group，2 659 genes were upregulated，2 216 geneswere down-regulated.Conclusion：Themechanism of Shufeng Xuanfei Jiedu formula involves the immunology molecular function：intracellular signaling cascade，plasma membrane，immune response，regulation of cell proliferation，defense response，regulation of apoptosis，etc.The metabolic pathways regulated by Shufeng Xuefei Jiedu formula involve：MAPK signaling pathway，Cytokine-cytokine receptor interaction，pathways in cancer，Toll-like receptor signaling pathway，Jak-STATsignaling pathway，Naturalkiller cellmediated cytotoxicity，chemokine signaling pathway，etc.

gene chips；Shufeng Xuanfei Jiedu formula；influenza virus

R285

A

1671-0258（2016）06-0008-03

山西省基礎(chǔ)研究項(xiàng)目青年科技研究基金（2015021192）；山西省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會科研項(xiàng)目基金（2014098）

劉琪，講師，博士，E-mail：angel200644@126.com

馬彥平，教授，E-mail：sxtcm_wm@126.com