超低溫冷凍同種異體骨與骨制備的骨組織庫建立及臨床應(yīng)用*

龔旭 潘劍成賀立新 聶利 楊文超 蔣華生 梁健銘

論著·經(jīng)驗交流

超低溫冷凍同種異體骨與骨制備的骨組織庫建立及臨床應(yīng)用*

龔旭 潘劍成*賀立新 聶利 楊文超 蔣華生 梁健銘

目的建立現(xiàn)代骨組織庫，觀察系列冷凍干燥同種骨移植的臨床效果。方法采用深低溫冷凍法、真空冷凍干燥和輻照滅菌法進(jìn)行保存，臨床應(yīng)用異體骨時，根據(jù)患者的需要和骨組織庫的記錄資料合理選擇，運(yùn)用于骨缺損填充、脊柱和關(guān)節(jié)融合手術(shù)89例。結(jié)果 術(shù)后隨訪6～24月，89例未見明顯排斥反應(yīng)，療效滿意。結(jié)論 冷凍干燥同種異體骨制備的松皮質(zhì)填充骨、頸腰椎融合器等系列使用安全，保存和運(yùn)輸方便，用于修復(fù)骨缺損及脊柱融合等，是一種有效的方法。

骨組織庫；冷凍干燥法；同種異體骨；骨移植；臨床應(yīng)用

臨床中脊柱病變需融合或因損傷、疾病引起骨缺損，尤其是脊柱椎間隙融合及其大塊骨缺損者靠病人自身修復(fù)相當(dāng)困難，這就需要植骨來進(jìn)行融合及填補(bǔ)骨缺損。骨組織庫的建立能提供替代自體骨的移植材料，因此骨組織庫已成為現(xiàn)代骨科的必備設(shè)施。自2012年7月始，本院骨組織庫在實驗研究和傳統(tǒng)同種骨移植技術(shù)的基礎(chǔ)上，同上級醫(yī)院合作，參考國內(nèi)外的先進(jìn)方法，建立了以深度低溫、真空冷凍干燥、真空包裝和輻照滅菌為核心技術(shù)的現(xiàn)代骨組織庫，2013年1月開始將同種異體骨頸腰椎融合器、同種異體填充骨臨床應(yīng)用于骨缺損、脊柱和關(guān)節(jié)融合手術(shù)89例，現(xiàn)將系列冷凍干燥同種異體骨的制備及應(yīng)用報告如下：

1 材料與方法

1.1 凍干同種異體骨制備相關(guān)

1.1.1 骨來源獲取及其儲存方法

骨材料來自合法取得的捐獻(xiàn)供體，無菌手術(shù)切除的骨組織及創(chuàng)傷截肢后的骨骼，如股骨頸骨折患者被置換下來的股骨頭、椎管后路減壓術(shù)切除的椎板和棘突、開胸術(shù)切下來的肋骨、開顱減壓術(shù)切下來的顱骨及關(guān)節(jié)置換取下的髕骨、能夠提供較多骨量的有外傷性截肢無污染的肢體骨；死亡4～8小時以內(nèi)的捐獻(xiàn)供體。在無菌條件下取骨，供體血清學(xué)檢驗指標(biāo)按國內(nèi)獻(xiàn)血要求：HIV、HbsAg、HCV和梅毒血清反應(yīng)陰性；年齡男性＜55歲，女性＜50歲；尸體骨取材時間常溫下不超過8小時，4℃以下不超過24小時，骨組織取材時建立供體記錄及組織獲取登記表，連同供體血清檢驗化驗單長期保存，并建立供體與臨床應(yīng)用一體的電子檔案以備隨訪。

1.1.2 深度冷凍

骨材料以3層無菌單包裹，注明供體編號和日期，隨即放入-80℃冰箱內(nèi)保存1個月以上即可應(yīng)用，低溫冷凍可以降低骨的抗原性，儲存時間越長，抗原性越低。儲骨前及植骨前須作細(xì)菌培養(yǎng)，如無細(xì)菌生長方可儲存或作為植骨材料。

1.1.3 真空冷凍干燥及其型號加工

骨材料切成各種規(guī)格后經(jīng)清除軟組織，清除血液和骨髓組織，物理脫脂等處理，進(jìn)一步降低抗原性。為便于使用、保存和運(yùn)輸，需進(jìn)行真空冷凍干燥處理，使含水量降到5%以內(nèi)，真空100u、溫度-38℃、時間3～5天，在該狀態(tài)下由冰直接升華脫水。后期經(jīng)靜態(tài)壓力及壓力扭轉(zhuǎn)測試等生物力學(xué)檢測。

1.1.4 輻照滅菌

凍干骨經(jīng)3層無菌真空包裝，送解放軍第三軍醫(yī)大進(jìn)行輻照滅菌。

1.1.5 保存和運(yùn)輸

系列凍干同種骨植入材料在常溫下可保存2年，4℃下可保存5年。

1.2 凍干同種異體骨的產(chǎn)品系列

松質(zhì)骨條：用于各種骨缺損的填充，促進(jìn)骨折愈合。關(guān)節(jié)和脊柱融合，椎體內(nèi)植骨，人工關(guān)節(jié)翻修植骨等。皮松質(zhì)骨條：用途同上。皮松質(zhì)混合骨粒：用途同上。脊柱頸腰椎融合器：用于頸、腰椎的椎間植骨融合。髂骨塊：有不同大小規(guī)格，用于胸腰椎的椎間植骨融合，后路和側(cè)方植骨融合，四肢骨缺損的連接植骨，髖臼造蓋等。

1.3 凍干同種骨的檢驗

一般檢驗包括外觀、含水量、pH值及無菌檢測，生物性能檢驗包括急性全身毒性、細(xì)胞毒性、遺傳毒性、皮內(nèi)刺激、過敏試驗、熱原試驗及溶血試驗等。

2 結(jié)果

自2013年1月～2015年1月，應(yīng)用冷凍同種異體骨進(jìn)行骨移植共89例，其中臨床應(yīng)用松質(zhì)骨條、松皮質(zhì)骨粒等填充骨，用于纖維結(jié)構(gòu)不良、骨囊腫等骨缺損、髖臼翻修、脊柱骨折復(fù)位后椎體內(nèi)植骨、脊柱小關(guān)節(jié)植骨等54例；頸椎同種異體骨融合器臨床應(yīng)用各種頸椎融合20例；腰椎同種異體骨融合器臨床應(yīng)用各種腰椎融合15例。患者術(shù)后無明顯排異反應(yīng)，切口均一期愈合，術(shù)后隨訪6～24月，均無異常感覺和反應(yīng)，患者基本恢復(fù)正常的工作與生活，療效滿意。其中采用影像學(xué)方法和臨床功能評分評價35例使用同種異體骨椎間融合器患者的融合情況和臨床療效。隨訪術(shù)后1～3月隨訪患者骨痂生長明顯，椎間隙高度無明顯變化，6個月至1年患者均骨性融合。

圖1 男，47歲，外傷性C5/6椎間盤突出癥，圖a圖b分別為術(shù)后隨訪片

圖2 男，57歲，L5椎體滑脫，長期吸煙。圖a圖b分別為術(shù)后隨訪片

圖3 VAS評分術(shù)后1、3、6個月末次隨訪均較術(shù)前改善

圖4ODI評分對比圖，術(shù)后1、3、6個月、末次隨訪均較術(shù)前改善

3 討論

儲存異體骨的方法有多種，如硫柳汞、酒精、凍干、脫鈣、脫蛋白、低溫冷凍等，這些方法各有優(yōu)缺點。其中深低溫冷凍保存異體骨，對其生物力學(xué)特性影響最小，溫度越低，影響越小[1]。Parish[2]認(rèn)為，骨組織在免疫中其抗原屬于低度，并且骨的抗原對冷凍極為敏感，因此經(jīng)過低溫冷凍可使本來就不高的抗原性進(jìn)一步降低，極低度的抗原性無需免疫抑制處理，骨的相容性好[3]。同時冷凍使大多數(shù)酶的活性處于靜止?fàn)顟B(tài)，不致失活，當(dāng)復(fù)溫植入體內(nèi)，即可以誘導(dǎo)骨生成[4]。-80℃低溫冷凍異體骨既能保持骨組織的形態(tài)和酶的特性，還可以起殺菌作用，能長期保持骨的無菌狀態(tài)，此法操作簡單，能長期無菌狀態(tài)下保存，應(yīng)用方便，易于推廣。經(jīng)過深低溫冷凍保存的異體骨，骨的生成誘導(dǎo)能力強(qiáng)，對骨的生物力學(xué)特性影響最小，仍保留骨較強(qiáng)的抗扭、抗彎強(qiáng)度，既能作充填物，又可起支架作用[5,6]。因此低溫冷凍是目前最受歡迎的一種方法。目前，本院骨庫用低溫冷凍法（-80℃）只儲存去除軟組織的異體骨。對于部分韌帶、關(guān)節(jié)軟骨（后期用于重建、軟骨移植）的儲存方法及其應(yīng)用，還在臨床研究之中。

本院合作研制的同種異體骨椎間融合器應(yīng)用于頸腰椎不穩(wěn)定、頸腰椎滑脫和頸腰椎間盤疾病等保守治療無效者，以其良好的成骨活性和臨床效果得到了越來越多的關(guān)注，獲得廣泛的認(rèn)可有著極佳的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

同種異體骨椎間融合器的優(yōu)點可以簡單概括為[7]：融合器結(jié)構(gòu)更符合正常椎間隙形態(tài)；彈性模量接近正常人體骨骼；對影像學(xué)檢查影響??；可完全吸收；良好的成骨活性；成本低廉。

雖然同種異體骨椎間融合器在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出了良好的效果，目前仍沒有充足的證據(jù)表明異體骨融合器比其他融合器有明顯的優(yōu)勢，同時由于異體骨融合器投入使用的時間相對較短，缺乏充足的長期隨訪資料來判斷其遠(yuǎn)期效果。同種異體骨在融合過程中的病理學(xué)變化和影像學(xué)表現(xiàn)都與金屬或合成材料融合器不同，值得深入研究。因此，仍需要深入研究同種異體骨椎間融合器的最佳適應(yīng)癥和遠(yuǎn)期效果，以期為臨床決策提供充足的證據(jù)。

總之，應(yīng)用同種異體骨來修復(fù)骨缺損及脊柱融合等方面，是一種可行有效的好方法，隨著現(xiàn)代骨科的發(fā)展，骨組織庫將成為一項必備設(shè)備，而同種異體骨移植的應(yīng)用是一種可靠材料和方法。

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[7] 潘劍成，龔旭，羅飛.同種異體骨椎間融合器的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2015，29（3）:15-19.

Preparation of banking osteoarticular w ith frozen dried bone allograft and clinicalapp lication

Gong Xu,Pan Jiancheng,He Lixig,et al.Department of Orthopaedics and Arthrodesis,the 181 Hospital of PLA, Guilin Guangxi,541002,China

Objective To establish human bone tissue bank base onmodern technique and to observe the clinical result of frozen dried boneallografting.M ethods The preparativeand preservationmethod include deep refrigeration,vacuum freeze drying and radiation sterilization.Thekind of frozen dried boneallograftswereused in 89 casesofbone transplantation included bone defect,spine fusion and joint fusion base on require of patientsand recordmaterialof Tissuebank. Results The caseshad no distinguishable immunologic rejection in all89 casesw ith satisfactory results.Conclusion The frozen dried bone allograft is safety in clinicaluseand it isa perfectsubstitution of bone autograft.

Bone tissuebank;Freeze drying;Allograft;Bone transplantation;Clinicalapplication

R687.3

B

龔旭（1974-）男，博士，副主任醫(yī)師。研究方向:脊柱關(guān)節(jié)。

*[通訊作者]潘劍成（1964-）男，本科，副主任醫(yī)師。研究方向:脊柱外科。

2015-05-11）

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.01.011

swgk2015-05-00096

桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃（合同編號：20140120-3-3）

解放軍第181中心醫(yī)院脊柱骨病關(guān)節(jié)外科，廣西桂林541002