茶葉基因工程研究進(jìn)展

沈金萍（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院茶學(xué)系，廣州 510642）

茶葉基因工程研究進(jìn)展

沈金萍
（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院茶學(xué)系，廣州 510642）

基因工程目前在各行業(yè)已得到廣泛的應(yīng)用，在茶學(xué)領(lǐng)域中起步較晚，但應(yīng)用前景廣闊。本文介紹了基因工程技術(shù)和茶葉中的生物活性物質(zhì)及其功能。簡(jiǎn)述了在茶樹(shù)育種中應(yīng)用基因工程改良茶樹(shù)品種或提高茶葉品質(zhì)的情況和發(fā)展前景，以及利用基因工程降低茶葉中咖啡堿的情況。

茶樹(shù)育種；基因工程；茶葉；應(yīng)用

中國(guó)是茶的故鄉(xiāng)，也是世界茶葉生產(chǎn)、消費(fèi)和出口大國(guó)，有綠茶、紅茶、黑茶、黃茶、白茶、青茶等六大茶類(lèi)。茶是世界三大飲料之一，而中國(guó)是世界茶產(chǎn)量第一大國(guó)、出口第二大國(guó)。茶學(xué)是我國(guó)一門(mén)較成熟的傳統(tǒng)學(xué)科，然而隨著科技日新月異的高速發(fā)展，傳統(tǒng)茶葉生產(chǎn)技術(shù)在質(zhì)量、產(chǎn)量、新產(chǎn)品研發(fā)及綜合利用等方面顯得十分乏力，必須進(jìn)行技術(shù)創(chuàng)新。目前基因工程在各行業(yè)已得到廣泛的應(yīng)用，在茶學(xué)領(lǐng)域起步較晚，但大大推動(dòng)了茶學(xué)領(lǐng)域的研究，在茶學(xué)上展現(xiàn)了廣闊的前景，有望解決傳統(tǒng)茶葉面臨的許多難題。例如，利用基因工程來(lái)提高茶葉品質(zhì)、進(jìn)行茶樹(shù)抗病蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因育種等。

1 基因工程技術(shù)的簡(jiǎn)介

基因工程是在分子水平上對(duì)DNA進(jìn)行操作的技術(shù)，是采用類(lèi)似工程設(shè)計(jì)的方法，按照人類(lèi)的特殊需要，將具有遺傳性的目的基因（DNA片段）在離體條件下進(jìn)行剪切、組合、拼接（需要工具酶），在將人工重組的基因（重組NDA），通過(guò)載體（微生物質(zhì)粒、噬菌體和病毒）導(dǎo)入受體細(xì)胞，進(jìn)行無(wú)性繁殖（克?。?，并使目的基因在受體細(xì)胞中高速表達(dá)，產(chǎn)生出人類(lèi)所需要的產(chǎn)品或組建成新的生物類(lèi)型?；蚬こ碳夹g(shù)在茶業(yè)上的應(yīng)用較滯后，目前還處于基因組NDA提純和鑒定階段，其應(yīng)用主要包括：RAPD分子標(biāo)記技術(shù)、茶樹(shù)基因的分離和克隆、茶樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)能直接反映出茶品種基因組DNA間的差異。目前在茶研究中應(yīng)用比較多的是RAPD、AFLP。目前，一些與茶葉品質(zhì)密切相關(guān)的基因已被克隆。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在茶研究中起步較晚。據(jù)報(bào)道，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt基因、lntron GUS基因和NPT1基因轉(zhuǎn)入茶樹(shù)中，獲得了Gus瞬間表達(dá)。通過(guò)對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)茶樹(shù)轉(zhuǎn)化研究，報(bào)道了茶樹(shù)較為適宜的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。然而由于茶樹(shù)原生質(zhì)體培養(yǎng)尚處在研究階段，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前難以取得更大的進(jìn)展，還沒(méi)有轉(zhuǎn)基因茶樹(shù)的報(bào)道?；蚬こ淘诓鑼W(xué)中的應(yīng)用主要包括：DNA分子標(biāo)記技術(shù)、基因的分離和克隆及轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

2 茶葉中的生物活性物質(zhì)及其功能

在大眾日益關(guān)心自身健康的同時(shí)，許多健康食品也應(yīng)運(yùn)而生，其中茶可說(shuō)是最佳的健康食品。近年來(lái)，由于科技進(jìn)步及科學(xué)家們亟欲解開(kāi)茶的生理功效之謎，進(jìn)行了各項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，甚至臨床實(shí)驗(yàn)，皆證實(shí)茶葉確實(shí)具有多種保健及預(yù)防疾病之功效。茶葉中的功效成分主要有維生素類(lèi)、茶多糖、茶氨酸、茶多酚、生物堿、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)等。茶葉的主要保健功能有：

（1）清除自由基、抗氧化功能。茶葉中的抗氧成分主要是維生素C和茶多酚中的兒茶素。

（2）抗衰老功能。茶葉中的茶多酚（起主要作用的是兒茶素）不但自身能夠清除過(guò)剩的自由基，抑制機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，降低細(xì)胞內(nèi)LPO的含量，延緩心肌細(xì)胞LF的形成，而且還能提高細(xì)胞的GSH-Px 和SOD活性。因而，茶多酚具有抗衰功能。

（3）抗癌、抗腫瘤、抗突變功能。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)茶葉抗癌、抗腫瘤、抗突變的研究，均取得了很大進(jìn)展?，F(xiàn)已表明，茶多酚中的兒茶素（尤其是酯型兒茶素）和茶色素均有明顯的抗癌、抗腫瘤、抗突變功能。

（4）抗輻射功能。一種說(shuō)法是，茶多酚（起主要作用的是兒茶素）和維生素C等抗輻射功能的途徑之一就是通過(guò)提高GSH-Px和SOD的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。另一種說(shuō)法是，茶多酚、茶多糖、維生素C等組分的協(xié)調(diào)作用可以吸收放射性物質(zhì)，并使之通過(guò)糞便排出體外，從而實(shí)現(xiàn)抗輻射功能。

3 利用基因工程改良茶樹(shù)品種

基因工程的研究在茶樹(shù)上還處于起步階段，基因的克隆是第一步。Kato等從茶葉中成功克隆了咖啡堿合成酶基因的cDNA。利用這項(xiàng)科研成果，將來(lái)有可能通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出不含咖啡堿合成酶的茶樹(shù)。茶功能成分如茶多酚、生物堿、茶氨酸、茶多糖等都是茶樹(shù)的次生代謝產(chǎn)物。對(duì)茶樹(shù)次生代謝的研究已逐步從生理生化水平向分子生物學(xué)水平發(fā)展。目前已在茶樹(shù)上分離和克隆了一些與茶葉天然生理活性物質(zhì)合成及茶葉品質(zhì)相關(guān)的基因和基因片段。但已有的研究也表明，這些次生代謝產(chǎn)物并非由單一基因控制，往往涉及生化代謝途徑中眾多相關(guān)因子，而這些因子關(guān)聯(lián)著眾多基因，亟待用基因芯片技術(shù)進(jìn)行研究。

目前，RAPD、AFLP技術(shù)已在茶樹(shù)遺傳育種研究中得到廣泛應(yīng)用，用以進(jìn)行親子鑒定研究、品種識(shí)別、連鎖遺傳圖譜構(gòu)建以及茶樹(shù)品種資源的評(píng)價(jià)等。AFLP （ Amplified Fragment Length Polymorphism）是從RAPD技術(shù)發(fā)展來(lái)的一種較先進(jìn)的分子標(biāo)記技術(shù)，其特點(diǎn)是把RFLP和PCR結(jié)合了起來(lái)。AFLP技術(shù)既具有RAPD自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單，不受時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境等因素干擾的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又克服了RAPD標(biāo)記只作為顯性標(biāo)記的缺點(diǎn)，可提供更多的共顯性標(biāo)記。這項(xiàng)技術(shù)在茶樹(shù)育種研究上已開(kāi)始應(yīng)用，為進(jìn)一步克隆和轉(zhuǎn)移這些目的基因奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。農(nóng)殘是制約我國(guó)茶葉出口的主要因素，特別是2000年7月1日歐盟實(shí)施農(nóng)殘新標(biāo)準(zhǔn)后，問(wèn)題更加嚴(yán)重，茶葉降殘就成為了我國(guó)茶葉科研急需解決的一大難題。要達(dá)到茶葉降殘的目的，除采取常規(guī)的技術(shù)和管理措施外，我們可以運(yùn)用基因工程技術(shù)將抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入茶樹(shù)之中，使茶樹(shù)自身具有抵抗蟲(chóng)害的能力，以減少每年因蟲(chóng)害造成的損失和施用農(nóng)藥的巨大開(kāi)支。另外通過(guò)基因工程技術(shù)研究確定兒茶素和茶氨酸等茶葉保健功能成分的目的基因，并將其轉(zhuǎn)入某些工程菌，然后，采用發(fā)酵工程技術(shù)高效生產(chǎn)。這種基因工程和發(fā)酵工程等生物工程技術(shù)的綜合研究，將為茶葉保健功能成分的開(kāi)發(fā)利用開(kāi)辟輝煌的前景。

4 應(yīng)用基因工程降低茶葉中的咖啡堿

咖啡堿（1，3，7-三甲基黃嘌呤）是茶葉中嘌呤堿的主體成分，攝入過(guò)量的咖啡堿會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生短期的負(fù)面作用，也限制了以保健和治療為目的茶和茶制品的攝入劑量。近20年來(lái)，國(guó)內(nèi)外系統(tǒng)研究了茶葉脫除咖啡堿技術(shù)，開(kāi)發(fā)了溶劑萃取法、熱水脫除法、超臨界CO2萃取法等理化方法，并開(kāi)始培育低咖啡堿茶樹(shù)品種等，尤其是通過(guò)基因工程創(chuàng)造低咖啡堿茶葉新材料的分子育種呼之欲出。

由于基因工程育種可以按人們的設(shè)想定向地、有目的地改變植物的基因型，且較常規(guī)育種用時(shí)少，因此自1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株以來(lái)，植物基因工程研究得到了蓬勃發(fā)展。一個(gè)完整的植物基因工程理論和技術(shù)體系已基本建立。利用基因工程的方法可以在短時(shí)間內(nèi)培育低咖啡堿的茶樹(shù)，而且不會(huì)影響轉(zhuǎn)基因植株的其它生化成分?？Х葔A的生物合成途徑已基本清楚，但是對(duì)于茶樹(shù)來(lái)說(shuō)，茶樹(shù)基因工程尚處于起步階段，其遺傳轉(zhuǎn)化受到茶多酚的自毒作用和殺菌作用的嚴(yán)重干擾，目前這方面的研究還鮮有報(bào)道。茶樹(shù)咖啡堿合成酶基因cDNA的克隆，為可以利用反義RNA技術(shù)和雙鏈RNA技術(shù)抑制咖啡堿合成酶基因的表達(dá)和培育低咖啡堿茶樹(shù)奠定了基礎(chǔ)。與理化處理方法不同的是，遺傳操作有希望直接解決茶葉的咖啡堿含量問(wèn)題，但傳統(tǒng)育種又受到基因型缺乏的限制，應(yīng)用基因工程方法培育低咖啡堿茶樹(shù)是解決茶葉咖啡堿含量問(wèn)題的根本途徑。但至今尚沒(méi)有成功的報(bào)道，茶樹(shù)的高效遺傳轉(zhuǎn)化將成為首要解決的瓶頸問(wèn)題。此外，采用人工誘導(dǎo)突變（如EMS、紫外線、中子、X射線等處理）創(chuàng)造低咖啡堿突變體，結(jié)合生化標(biāo)記和分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行輔助育種，是解決茶葉咖啡堿問(wèn)題的另一個(gè)重要策略。

5 展望

我國(guó)是茶葉的發(fā)源地，是世界產(chǎn)茶大國(guó)，但與世界茶葉先進(jìn)水平相比，仍有很大的差距。我們要充分利用世界生物技術(shù)迅猛發(fā)展的契機(jī)，重視茶葉生物技術(shù)研究，利用基因工程，不斷探索基因工程在茶樹(shù)育種中改良茶樹(shù)品種或提高茶葉品質(zhì)的應(yīng)用，促進(jìn)我國(guó)傳統(tǒng)茶業(yè)的改革及產(chǎn)業(yè)化，實(shí)現(xiàn)我國(guó)茶業(yè)“高產(chǎn)高質(zhì)高效低耗”的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，鞏固和提高我國(guó)茶葉的國(guó)際地位及市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

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