基于穩(wěn)定同位素比率差異的西湖龍井茶產(chǎn)地溯源分析

王　潔，石元值，張群峰，倪　康，伊?xí)栽疲R立鋒，阮建云

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州　310008)

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基于穩(wěn)定同位素比率差異的西湖龍井茶產(chǎn)地溯源分析

王潔，石元值，張群峰，倪康，伊?xí)栽?，馬立鋒，阮建云

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州310008)

摘要：通過測定不同產(chǎn)區(qū)扁形茶穩(wěn)定同位素比率，借助化學(xué)計(jì)量學(xué)工具探索建立西湖龍井茶產(chǎn)地區(qū)分模型。從山東、四川、浙江、貴州等扁形茶主產(chǎn)區(qū)代表性取樣，采用穩(wěn)定同位素質(zhì)譜測定樣品中碳、氫、氧、氮、鍶、鉛、鎘穩(wěn)定同位素比率，對(duì)其進(jìn)行方差分析，采用逐步線性判別(FLDA)、決策樹C5.0和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法構(gòu)建模型進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地扁形茶中穩(wěn)定同位素比率表現(xiàn)出產(chǎn)地差異。δD、δ18O受陸地效應(yīng)和高程效應(yīng)影響較大，并且二者有較好的正相關(guān)關(guān)系，88Sr/86Sr比值隨地區(qū)緯度增加而增大，在不同產(chǎn)地扁形茶間差異尤為顯著。FLDA和BP-ANN模型對(duì)外部樣本的預(yù)測能力相對(duì)較差，分別為76%和84%；決策樹算法模型回代驗(yàn)證準(zhǔn)確率為91.35%，對(duì)外部樣本的預(yù)測準(zhǔn)確度達(dá)到92%。結(jié)果表明，在西湖龍井茶產(chǎn)地判別中，采用基于穩(wěn)定同位素比率的決策樹算法模型可取得較好的效果。

關(guān)鍵詞：西湖龍井茶；非西湖龍井扁形茶；穩(wěn)定性同位素比率；產(chǎn)地溯源

我國茶葉文化底蘊(yùn)深厚，地域特色和品質(zhì)特征明顯，是典型的地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[1]。西湖龍井茶是我國的十大名茶之一，具有1 200多年的歷史，產(chǎn)于浙江杭州西湖區(qū)，以色綠、香郁、味甘、形美的品質(zhì)特征成為杭州特產(chǎn)的金字招牌，譽(yù)響海內(nèi)外。同時(shí)假冒龍井等現(xiàn)象也隨之出現(xiàn)。當(dāng)?shù)卣疄榱吮Ｗo(hù)原產(chǎn)地茶，按生產(chǎn)者的種植面積發(fā)放標(biāo)識(shí)，但由于西湖龍井茶與其他扁茶的加工工藝完全一致，且有些非西湖龍井茶的產(chǎn)地距離西湖龍井茶產(chǎn)區(qū)并不遠(yuǎn)，感官品質(zhì)的差異也不大，目前仍沒有理想的方法鑒定西湖龍井茶的真?zhèn)巍ｉ_發(fā)一種能識(shí)別西湖龍井茶真?zhèn)蔚臋z測方法或模型對(duì)維護(hù)西湖龍井茶品牌，規(guī)范西湖龍井茶市場具有重要的意義。

茶樹是多年生經(jīng)濟(jì)作物，茶葉品質(zhì)與其產(chǎn)地的氣候條件及加工方法有密切關(guān)系，不同產(chǎn)地茶葉中穩(wěn)定同位素比率存在一定的差異性[2]。不同地區(qū)來源的動(dòng)植物體內(nèi)同位素組成受氣候、大氣成分、海拔、土壤、地形、水源及動(dòng)植物代謝類型等因素的影響發(fā)生分餾效應(yīng)[3-4]。如植物穩(wěn)定碳同位素組成(碳穩(wěn)定同位素比率δ13C)能夠記錄與植物生長過程相關(guān)聯(lián)的環(huán)境變化信息, 反映植物對(duì)環(huán)境變化的生理生態(tài)適應(yīng)特性[3-5]。同位素自然豐度的差異是不同地區(qū)各環(huán)境條件對(duì)生物同位素組成產(chǎn)生影響的綜合體現(xiàn)。穩(wěn)定同位素比率在判別農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源方面起到很大的作用，穩(wěn)定同位素質(zhì)譜(isotope ratio mass spectrometer, IRMS)已廣泛應(yīng)用于肉制品[6-7]、蜂蜜[8]、果汁[9]、大米[10]等眾多農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)地鑒別，利用分析O、H、C、N、S、Sr等的同位素指紋在不同地區(qū)農(nóng)產(chǎn)品中存在的特異性差異，為不同來源農(nóng)產(chǎn)品的識(shí)別以及名優(yōu)產(chǎn)品的真實(shí)性提供了有力的鑒別方式。當(dāng)前，通過數(shù)據(jù)模型來判別不同植物的產(chǎn)地來源成為關(guān)注的焦點(diǎn)，線性判別分析[11-12]、主成份-線性判別分析[1]、決策樹算法[13]已被應(yīng)用到不同大洲、國家、省份和小產(chǎn)區(qū)的茶葉產(chǎn)地溯源中，正確判別率較高。

本文以加工工藝一致的西湖龍井及非西湖龍井的其他不同產(chǎn)地扁形茶為研究對(duì)象，通過分析不同地區(qū)扁形茶中穩(wěn)定同位素比率差異實(shí)現(xiàn)產(chǎn)地溯源，建立西湖龍井茶真?zhèn)蔚漠a(chǎn)地區(qū)分模型，為西湖龍井茶的原產(chǎn)地保護(hù)提供鑒定基礎(chǔ)。

1　主要儀器與材料

1.1儀器

球磨機(jī)：MM301型號(hào)，德國Retsh公司；元素分析儀：Elementer vario PYRO cube，德國Elementer公司；同位素質(zhì)譜儀：Isoprime型號(hào)，英國Isoprime公司；微波消解儀：MARS6型號(hào)，美國CEM公司；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：Aurora型號(hào)，德國Bruker公司；高壓消解罐：德國Bruker公司。

1.2試劑

硝酸：優(yōu)級(jí)純，美國Thermo Fisher Scientific產(chǎn)品； Rh、In、Re混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 μg/mL，中國計(jì)量科學(xué)研究院提供；儀器調(diào)諧貯備液：10 μg/mL Be、Mg、Co、In、Ce、Tl調(diào)諧貯備液，德國Bruker公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)元素：國家有色金屬及電子材料分析測試中心提供。

1.3材料

樣品取自山東、四川、浙江、貴州四省，由各省份合作企業(yè)提供樣品。其中杭州西湖龍井茶產(chǎn)區(qū)35個(gè)樣品；浙江非西湖龍井茶產(chǎn)區(qū)20個(gè)樣品；外省扁形茶樣品49個(gè)，包括四川青川扁茶19個(gè)，貴州黎平扁茶15個(gè)，山東日照扁茶15個(gè)。茶葉樣品采取定點(diǎn)取樣方式獲得，樣品的采摘時(shí)間包括了春茶的早、中、晚三個(gè)時(shí)期，山東日照茶區(qū)采摘時(shí)間集中在4月15日至5月25日，其他茶區(qū)集中在4月1日至4月25日。采樣時(shí)，每一地區(qū)均選擇了第3批(早)、第6批(中)、第9批(晚)采摘的1芽1葉新梢，并根據(jù)龍井茶工藝制成茶葉樣品，每個(gè)時(shí)間段樣品數(shù)基本相等；由于當(dāng)前市場上的扁形茶樣品均以單品種為主，當(dāng)前主要的品種為龍井43及當(dāng)?shù)厝后w種，所以取樣時(shí)為了消除品種的影響，各地均選取了龍井43茶樹品種及當(dāng)?shù)厝后w種。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1樣品預(yù)處理

進(jìn)行穩(wěn)定同位素比率測定前，用球磨機(jī)對(duì)茶葉樣品進(jìn)行粉碎處理，震蕩頻率30 s-1，時(shí)間1 min，茶粉裝入2 mL離心管，待測。

2.2穩(wěn)定同位素檢測

2.2.1碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素比率檢測穩(wěn)定碳氮同位素比率檢測：稱取約2～4 mg待測樣，用錫杯包好后放置于元素分析儀樣品盤中，樣品中的碳元素和氮元素轉(zhuǎn)化為純凈的CO2和N2通過氦載氣流經(jīng)阱，通過吸附解吸附得到分離純化，然后進(jìn)入同位素質(zhì)譜儀。利用 IAEA-N1、 IAEA-N3和USGS24 、USGS41、IAEA-S-1、NBS123等對(duì)標(biāo)準(zhǔn)氣體進(jìn)行校正，在分析過程中， 每12個(gè)樣品穿插一個(gè)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)樣進(jìn)行校正。儀器長期標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2‰。具體條件:元素分析儀氦氣吹掃流量為230 mL/min，氧化爐和還原爐溫度分別為1 120 ℃、850 ℃，進(jìn)入質(zhì)譜儀氦載氣流量為100 mL/min。

氫氧穩(wěn)定同位素比率檢測：稱取約3 mg待測樣，用銀杯包好后放置于元素分析儀樣品盤中，樣品在1 400 ℃的條件下在玻璃碳管中高溫裂解反應(yīng)形成H2和CO，通過水阱和CO2捕集阱純化，通過吸附解吸附阱分離。在分析過程中，采用國際上通用的平衡時(shí)間，利用國際標(biāo)樣IAEA-CH7，IAEA-600，IAEA-601和IAEA-602[14]等采用2點(diǎn)校正的方式對(duì)測試樣品進(jìn)行校正。氦氣流量為125 mL/min。

穩(wěn)定同位素比率計(jì)算公式：

δ‰=[(R樣品/R標(biāo)準(zhǔn))-1]*1 000

R樣品：所測樣品中重同位素與輕同位素豐度比，即13C/12C，15N/14N，18O/16O， D/1H。

R標(biāo)準(zhǔn)：國際標(biāo)準(zhǔn)樣中，δ15N的參照標(biāo)準(zhǔn)為大氣，δ13C以國際標(biāo)準(zhǔn)的V-PDB為基準(zhǔn)，δ18O和δD以平均海洋水為基準(zhǔn)(SMOW)。

2.2.2鍶、鉛等重穩(wěn)定同位素比率檢測樣品中的鍶、鉛等重穩(wěn)定同位素微波消解后用ICP-MS測定，測定中設(shè)2個(gè)空白樣，并以2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣，用2個(gè)加內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行質(zhì)控。樣品消解罐(聚四氟乙烯罐)使用前經(jīng)硝酸浸泡后放入微波消解儀進(jìn)行清洗(15 min升至150 ℃保持15 min)，后超純水清洗，晾干待用。稱取0.3 g經(jīng)球磨機(jī)磨碎的樣品于高壓消解罐中，加入5 mL 70% HNO3加蓋靜置1 h。將靜置后的樣品放入微波消解儀進(jìn)行消解，消解程序參數(shù)為5 min升至120 ℃保持5 min，5 min升至140 ℃保持10 min，5 min升至180 ℃保持10 min，冷卻后取出，緩慢打開罐蓋排氣，將高壓消解罐置于控溫電熱板上140 ℃趕酸，將消化液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，超純水定容至刻度，混勻備用。ICP-MS的工作參數(shù)為：射頻功率1 400 W，冷卻氣流速18 L/min，輔助氣流速1.65 L/min，霧化器流速0.95 L/min，鞘氣流速0.25 L/min，采樣高度6.5 mm，泵穩(wěn)定時(shí)間30 s。

內(nèi)標(biāo)溶液：一定體積的1 000 mg/L Rh、In、Re混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用1% HNO3稀釋為1 mg/L，由內(nèi)標(biāo)管在線引入質(zhì)譜儀。

儀器調(diào)諧貯備液：10 μg/mL Be、Mg、Co、In、Ce、Tl調(diào)諧貯備液用1% HNO3稀釋為1 mg/L，備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：標(biāo)準(zhǔn)元素用1%稀硝酸逐級(jí)稀釋為1，2，4，6，8 μg/L。在ICP-MS的工作條件下采集空白溶液(1% HNO3)和標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，由儀器自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3數(shù)據(jù)分析

使用SPSS19.0進(jìn)行差異顯著性分析和逐步線性判別分析，Clementine12.0進(jìn)行決策樹C5.0和BP-ANN算法建模，SigmaPlot12.5作圖。

3　結(jié)果與分析

3.1穩(wěn)定同位素組成的地域差異

不同地域扁形茶C、H、O、N穩(wěn)定同位素比率示于圖1。不同產(chǎn)區(qū)扁形茶中的δ13C、δ15N、δD、δ18O值表現(xiàn)出了一定的區(qū)域差異性。不同產(chǎn)區(qū)扁茶中的δ13C值在-28.02‰～-23.61‰之間，其中山東日照茶顯著高于浙江非西湖龍井茶與貴州黎平茶，后者又顯著高于西湖龍井茶與四川青川茶(圖1a)。δ15N值在-1.60‰～7.68‰之間，其中以貴州黎平茶最高，西湖龍井茶次之，山東日照茶、四川青川茶與浙江非西湖龍井茶中最低(圖1b)。δ15N值主要受到土壤含氮量的影響[15]，由于不同茶園間的施肥等管理水平的差異，攜帶的當(dāng)?shù)丨h(huán)境差異可能會(huì)被不同的施肥等農(nóng)業(yè)栽培措施所干擾[16]。δD值在-66.57‰～-45.10‰之間，其中以山東日照、西湖龍井茶最高，其次是浙江非西湖龍井茶與貴州黎平茶，四川青川茶最低(圖1c)。δ18O值在17.76‰～26.94‰之間，與δD的分布趨勢基本類似(圖1d)，表現(xiàn)出了沿海地區(qū)高，內(nèi)陸地區(qū)低的趨勢。通過對(duì)δD值與δ18O值做相關(guān)性分析(圖2)，各產(chǎn)區(qū)的δD值與δ18O值表現(xiàn)出顯著正相關(guān)(R2=0.348 1，n=104)。 相關(guān)性經(jīng)CPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件雙側(cè)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示在0.01水平上顯著相關(guān)。

SDRZ——山東日照；SCQC——四川青川；XHLJ——浙江西湖；ZJLJ——浙江非西湖龍井；GZLP——貴州黎平圖1　不同地域扁形茶C、H、O、N穩(wěn)定同位素比率SDRZ——Rizhao, Shandong; SCQC——Qingchuan, Sichuan; XHLJ——West Lake Longjing tea; ZJLJ——Zhejiang Longjing not West Lake; GZLP——Liping, GuizhouFig.1　The values of δ13C, δ15N, δD, δ18O in the teas from different producing areas

圖2　δD(‰)與δ18O(‰)的相關(guān)性分析Fig.2　Correlation analysis of δD and δ18O

3.2鍶、鉛、鎘等穩(wěn)定同位素比率地域差異

不同產(chǎn)區(qū)扁茶中的鎘、鉛、鍶等重穩(wěn)定同位素比率表現(xiàn)出了不同的分布趨勢，但均以山東日照扁茶為最高。其中111Cd/113Cd值在0.077 0‰～0.625 0‰之間，以西湖龍井茶中的變異最大，但不同產(chǎn)區(qū)扁茶間的差異并不顯著 (圖3a)。而206Pb/207Pb值與207Pb/208Pb值的變幅均很小，范圍分別為1.15‰～1.19‰、0.41‰～0.43‰，其中西湖龍井茶顯著低于其他產(chǎn)區(qū)的扁形茶，其他產(chǎn)區(qū)扁形茶間則沒有顯著性差異(圖3b、3c)。不同產(chǎn)區(qū)扁形茶中的88Sr/86Sr比值有顯著差異，比值在5.40‰～8.72‰之間。其中以山東日照茶、四川青川茶中最高，西湖龍井茶及浙江非西湖龍井扁茶次之，貴州黎平茶最低(圖3d)。已有研究表明，鍶在自然界中有四種天然穩(wěn)定同位素，分別為88Sr、86Sr、87Sr、84Sr，其中只有87Sr具有放射性，自然界88Sr/86Sr、86Sr/84Sr的比值是不變的，通常88Sr/86Sr作為87Sr/86Sr比值分析質(zhì)量歧視值的矯正值[17]。

3.3基于穩(wěn)定性同位素的扁形茶產(chǎn)地判別分析

基于上述五個(gè)產(chǎn)地扁形茶中穩(wěn)定同位素比率所表現(xiàn)出的產(chǎn)地分布差異特征，比較了三種不同類型判別模型進(jìn)行扁形茶產(chǎn)地判別的效果。

SDRZ——山東日照；SCQC——四川青川；XHLJ——浙江西湖；ZJLJ——浙江非西湖龍井；GZLP——貴州黎平圖3　不同地域扁形茶111Cd/113Cd、206Pb/207Pb、207Pb/208Pb與88Sr/86Sr的同位素比率SDRZ——Rizhao, Shandong; SCQC—— Qingchuan, Sichuan; XHLJ—— West Lake Longjing tea; ZJLJ——Zhejiang Longjing Not West Lake; GZLP——Liping, GuizhouFig.3　The isotopic ratios of 111Cd/113Cd, 206Pb/207Pb, 207Pb/208Pb and 88Sr/86Sr in the teas from different producing areas

3.3.1逐步線性判別分析 采用FLDA方法將樣本按地區(qū)分組建模，根據(jù)Wilks’Lambda統(tǒng)計(jì)量，當(dāng)被加入的變量F值大于等于3.84時(shí)，該變量進(jìn)入函數(shù)，當(dāng)被加入的變量F值小于等于2.71時(shí)，該變量被移出函數(shù)，最終篩選出對(duì)模型貢獻(xiàn)較大的變量，剔除無效變量，篩選到206Pb/207Pb、207Pb/208Pb、88Sr/86Sr、δ13C、δ15N、δD、δ18O七個(gè)貢獻(xiàn)較大的自變量建立判別模型，Wilks’Lambda值較小且典則相關(guān)系數(shù)接近于1，說明模型穩(wěn)定、可信。模型如下：

Y(SDRZ)=-6.214 7+1.259 6206Pb/207Pb+1.038207Pb/208Pb+2.04388Sr/86Sr+1.174 7δ13C -0.939 1δ15N +0.158 2δD+2.582 6δ18O

Y(SCQC)=-3.748 7-0.118 3206Pb/207Pb-0.090 7207Pb/208Pb+1.359 788Sr/86Sr -0.535 4δ13C -0.582 6δ15N -2.389 6δD+0.718 5δ18O

Y(XHLJ)=-2.129 4-0.996 9206Pb/207Pb-0.837 8207Pb/208Pb-0.338 888Sr/86Sr -1.041 5δ13C+0.947 9δ15N-0.26δD+0.596 3δ18O

Y(ZJLJ)=-2.792 1+0.385 1206Pb/207Pb+0.970 1207Pb/208Pb-0.525 888Sr/86Sr+0.716 7δ13C-1.616 7δ15N +1.124 4δD-1.209 1δ18O

Y(GZLP)=-6.644 8+0.479 9206Pb/207Pb-0.333 4207Pb/208Pb-2.780 688Sr/86Sr+0.575δ13C+1.579 8δ15N +1.879 1δD-2.937 5δ18O

提取到四個(gè)判別函數(shù)(discriminant function, DF)：

DF1=0.165 6206Pb/207Pb+0.258207Pb/208Pb+0.665 688Sr/86Sr+0.099 9δ13C-0.430 5δ15N-0.387 7δD+0.659 9δ18O

DF2=0.617 1206Pb/207Pb+0.529 2207Pb/208Pb-0.20488Sr/86Sr+0.675 1δ13C-0.346 8δ15N+0.764δD-0.417 2δ18O

DF3=-0.053 2206Pb/207Pb-0.155 7207Pb/208Pb+0.026 388Sr/86Sr-0.018 2δ13C+0.418 6δ15N+0.383 6δD+0.552 3δ18O

DF4=0.485 6206Pb/207Pb-0.225 1207Pb/208Pb+0.240 488Sr/86Sr+0.165 4δ13C+0.667 5δ15N-0.590 6δD+0.195 4δ18O

DF1、DF2、DF3和DF4方差貢獻(xiàn)率分別為52.86%、24.50%、17.64%、5.00%，以前三個(gè)判別函數(shù)得分做圖(圖4)。各地樣本分布較為集中，西湖龍井茶與山東日照茶、四川青川茶、貴州黎平茶樣品基本可以進(jìn)行區(qū)分，但與浙江非西湖龍井扁茶有一定程度的交叉。經(jīng)過回代檢驗(yàn)和交叉驗(yàn)證，判別分析結(jié)果列于表1，西湖龍井茶與山東日照、貴州黎平及四川青川的扁茶區(qū)分度較好，回代檢驗(yàn)準(zhǔn)確率大于84%，交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率大于73%，外部驗(yàn)證準(zhǔn)確率大于80%。但西湖龍井茶與浙江非西湖龍井的正確區(qū)分度相對(duì)偏低。

SDRZ——山東日照；SCQC——四川青川；XHLJ——浙江西湖；ZJLJ——浙江非西湖龍井；GZLP——貴州黎平圖4　不同產(chǎn)區(qū)扁形茶前三個(gè)典型判別函數(shù)的得分散點(diǎn)圖SDRZ——Rizhao, Shandong; SCQC—— Qingchuan, Sichuan; XHLJ—— West Lake Longjing tea; ZJLJ——Zhejiang Longjing not West Lake; GZLP——Liping, GuizhouFig.4　Score plot of the first three canonical discriminant functions (DF1, DF2 and DF3) performed to flatten-shaped teas produced from five producing areas

3.3.2決策樹C5.0分析決策樹是當(dāng)前最主要的預(yù)測技術(shù)。其基本原理是采用自上而下的單向遞歸,在決策樹的內(nèi)部分支點(diǎn)進(jìn)行屬性值的比較并判斷需要向下進(jìn)入的分支，在決策樹的末端節(jié)點(diǎn)得到結(jié)論，最終從一組無規(guī)則的事例推理出決策樹表示形式。因此,從起始端到末端節(jié)點(diǎn)就對(duì)應(yīng)著一條合理規(guī)則 ,整棵樹就對(duì)應(yīng)著一組表達(dá)式規(guī)則。為優(yōu)化模型，選取70%樣本作為訓(xùn)練集，另外30%樣本作為驗(yàn)證集，基于驗(yàn)證集估計(jì)的模型預(yù)測準(zhǔn)確性為84.62%。通過對(duì)不同產(chǎn)區(qū)扁形茶的穩(wěn)定同位素比率進(jìn)行決策樹分析(表2)，發(fā)現(xiàn)該模型比上述逐步線性判別分析法的正確判別率有所提高，西湖龍井茶與山東日照、貴州黎平及四川青川的扁茶區(qū)分度較好，回代檢驗(yàn)正確判別率達(dá)91%以上，外部驗(yàn)證準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。西湖龍井茶與浙江非西湖龍井的正確區(qū)分度有所提高。

3.3.3神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中使用較為廣泛的反向傳播算法(back-propagation, BP)對(duì)樣本進(jìn)行產(chǎn)地鑒別。建模過程中使用試錯(cuò)法(Trail-and-Erro)確定隱藏節(jié)點(diǎn)數(shù)，確定隱藏層數(shù)為5時(shí)樣本的正確判別率較高。最終選擇5個(gè)隱藏層、350次迭代進(jìn)行建模。為預(yù)防過度訓(xùn)練，模型選取70%樣本作為訓(xùn)練集，另外30%樣本作為驗(yàn)證集，對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，基于驗(yàn)證集估計(jì)的模型預(yù)測準(zhǔn)確性為85.58%。通過對(duì)不同產(chǎn)區(qū)扁形茶的穩(wěn)定同位素比率進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析(表3)，發(fā)現(xiàn)該模型在區(qū)分西湖龍井茶與山東日照、貴州黎平及四川青川等地的扁茶區(qū)分度介于決策樹判別分析與逐步線性判別分析法之間，回代檢驗(yàn)正確判別率達(dá)84%以上，外部驗(yàn)證準(zhǔn)確率達(dá)76%。西湖龍井茶與浙江非西湖龍井的正確判別率與決策樹判別分析相近。

表3　基于穩(wěn)定同位素的不同產(chǎn)地扁形茶神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)判別分析Table 3　Classification with neural network discriminant analysis of tea samples from different regions based on the stable isotope ratioes

4　討論

不同產(chǎn)地茶葉中穩(wěn)定同位素比率有一定地域特征，結(jié)果表明，山東地區(qū)扁形茶中碳、氫、氧、鍶同位素比率均高于其他三省。已有研究表明[18]，同種植物中δ13C值取決于光照強(qiáng)度、溫度和土壤含水量。δ13C值隨著溫度和年降水量的減少而變大[19-20]，隨著濕潤指數(shù)的增加δ13C值減小[21]。土壤水分可獲得性與δ13C值相關(guān)[22]，山東地區(qū)年降水量顯然要小于浙江四川和貴州三省，且有冰凍期，導(dǎo)致茶樹獲得土壤水分的能力較低，茶樹不定期的生活在相對(duì)干旱的條件下，從而使得葉片氣孔導(dǎo)度降低，δ13C值增加。四川、貴州年平均降水量和濕潤指數(shù)雖然高于浙江，但因其取樣地點(diǎn)海拔較高，產(chǎn)茶地區(qū)年平均氣溫低于浙江產(chǎn)茶區(qū)，導(dǎo)致其δ13C值高于浙江。

在施肥相同的情況下，C3植物氮同位素組成與降水量明顯負(fù)相關(guān)[23-24]，與溫度正相關(guān)[25]，隨海拔高度的增加, 植物和土壤的氮同位素有偏負(fù)的趨勢[26]。圖1b的結(jié)果并不符合這一規(guī)律，施肥的影響掩蓋了氣候?qū)Ζ?5N值的影響。合成氮肥中δ15N值幾乎為0，而有機(jī)氮肥中δ15N值較高，所以在施用有機(jī)肥較多的取樣地區(qū)，其δ15N值會(huì)較高[27-29]。

δ18O、δD值隨緯度的增加而減小(水汽在由低緯向高緯輸送的過程中，由于溫度逐漸降低而發(fā)生凝結(jié)降水，使得剩余水汽以及隨后降水中的δ18O逐漸降低，出現(xiàn)緯度效應(yīng)[30])，由海岸向內(nèi)陸方向呈遞減趨勢，氣溫越低重同位素含量越低，海拔高度增加δ18O、δD值減小[31](水汽在輸送的過程中，隨著海拔的增加，也導(dǎo)致降水中的重穩(wěn)定同位素逐漸發(fā)生貧化，從而使得以后降水中的δ18O 降低，出現(xiàn)高程效應(yīng)[30])，由圖1c，圖1d所示結(jié)果可見，山東樣品δ18O及δD值高于另外三省，其陸地效應(yīng)和高程效應(yīng)起了主要作用，而緯度效應(yīng)并不明顯——近海低海拔的山東和浙江兩省樣品表現(xiàn)出了較高值，川貴內(nèi)陸高海拔地區(qū)的樣品同位素比率較低。單獨(dú)觀察另外三省樣品，緯度效應(yīng)依然較為明顯，低緯度貴州樣品δ18O、δD值高于取樣緯度相似的四川與浙江兩省。δ18O與δD兩者表現(xiàn)出顯著正相關(guān)(圖2，R2=0.348 1)，在以后的分析測試中可以只測其中一個(gè)指標(biāo)，以減少樣本分析時(shí)間與成本。

本研究結(jié)果表明，重穩(wěn)定同位素鉛、鍶、鎘具有一定的地域特征，特別是88Sr/86Sr，地域特征非常顯著，具有明顯的緯度特征，隨著緯度的增加鍶(88Sr/86Sr)同位素比率增大。鍶同位素比率是判別動(dòng)植物產(chǎn)地來源的有效指標(biāo)，尤其是對(duì)于氣候條件比較接近，其他同位素指標(biāo)差異不明顯時(shí)，能發(fā)揮重要作用[32]。降水中Sr隨著離海洋距離的增加，海源成分降低，其他來源的影響增加，浙江與山東地處沿海地帶且海拔較低，相對(duì)于川貴地區(qū)受到海源Sr和季風(fēng)的影響較多。不同地區(qū)成土母質(zhì)以及成土母質(zhì)的形成年代對(duì)88Sr/86Sr值大小起到?jīng)Q定性作用，同時(shí)海洋因素對(duì)其起到輔助作用。

5　結(jié)論

西湖龍井、浙江非西湖龍井扁形茶、山東日照茶、四川青川茶和貴州黎平茶之間穩(wěn)定同位素比率存在明顯差異，具有一定的地域特征，并且可以通過FLDA、決策樹算法和BP-ANN算法模型在一定程度上區(qū)別各地扁形茶?；诓煌a(chǎn)區(qū)扁形茶的穩(wěn)定同位素比率特異性結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)工具可以有效對(duì)扁形茶產(chǎn)地進(jìn)行溯源。其中決策樹算法模型回代驗(yàn)證準(zhǔn)確率為91.35%，對(duì)外部樣本的預(yù)測準(zhǔn)確度達(dá)到92%，在三種溯源模型中最適于扁形茶產(chǎn)地溯源。

通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，增加測定元素種類可以使準(zhǔn)確率增加，后續(xù)研究中將增加變量個(gè)數(shù)，運(yùn)用更多變量對(duì)不同省份扁形茶進(jìn)行判別，并且嘗試進(jìn)行小范圍內(nèi)扁形茶產(chǎn)地判別。

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收稿日期：2016-02-29;修回日期：2016-04-19

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203046)；中國農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS-03)

作者簡介：王潔(1988—)，女，山東淄博人，碩士，主要從事茶葉離子組學(xué)研究 通信作者：阮建云，E-mail: jruan@tricaas.com;石元值,E-mail: shiyz@tricaas.com

中圖分類號(hào)：TL99

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-7512(2016)03-0129-11

doi：10.7538/tws.2016.29.03.0129

Geographical Tracing of the West Lake Longjing Tea Based on the Stable Isotope Ratios

WANG Jie, SHI Yuan-zhi, ZHANG Qun-feng, NI Kang, YI Xiao-yun,MA Li-feng, RUAN Jian-yun

(TeaResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310008,China)

Abstract:The West Lake Longjing tea is a famous specialty with long history in Zhengjiang province and its price is higher than any other flatten-shaped tea. However, traders tend to sell counterfeit West Lake Longjing tea in the market to acquire higher economic values. Otherwise, plants from different geographical locations have distinct isotope ratio, which form the element fingerprints due to the variation of climate and soil properties. Thus, it is necessary to do the geographical tracing of the West Lake Longjing tea based on the stable isotope ratios. In this study, we collected the flatten-shaped tea samples from the Hangzhou, Shaoxing and Lishui of Zhejiang, Qingchuan of Sichuan, Liping of Guizhou and Rizhao of Shandong where the flatten-shaped tea were widely produced. And the stable isotope ratios (C, H, O, N, Cd, Pb, Sr ) in the flatten-shaped tea samples were also assayed. Differences of the stable isotope ratios in the flatten-shaped tea from different producing areas were obtained by the variance analysis. The comparision of the stable isotope ratio values of West Lake Longjing tea and other flatten-shaped tea producing from different areas were completed. Fisher linear discriminant analysis (FLDA), decision tree and back propagation artificial neural network (BP-ANN) were used to establish the origin recognition model. The stable isotope ratios in flatten-shaped tea produced from different areas showed the difference followed with the different producing areas. For the δD and δ18O in samples, maybe influenced by the land effect and the elevation effect; a positive correlation was found between δD and δ18O; The ratio of88Sr/86Sr was increased following the latitude’s increasing of the four provinces. Compared the recognition ability among those models of FLDA, decision tree and BP-ANN, all the recognition ability were above 76%. As applied by external validation samples, decision tree model was suitable for geographical origin traceability of different regions, while the accuracy rate was 92%. So the decision tree model was more suitable for geographical tracing of West Lake Longjing tea.

Key words：West Lake Longjing tea; not West Lake Longjing flatten-shaped tea; stable isotope ratios; geographical tracing