喜樹堿及其衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制與凋亡的研究

陳琴華，余　飛，李　鵬，朱　軍

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喜樹堿及其衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制與凋亡的研究

陳琴華，余飛，李鵬*，朱軍

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥物分析與篩選研究所，湖北 十堰 442008

[摘要]目的探討喜樹堿(CPT)及其衍生物10-羥基喜樹堿(HCPT)、7-乙基喜樹堿(SN22)、7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN38)在體外對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制與凋亡的影響。方法取對(duì)數(shù)期生長的HepG2細(xì)胞，分為對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組，將4種藥物配成濃度梯度0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的藥物溶液。將不同濃度的藥物溶液作用于肝癌細(xì)胞48 h，MTT法測(cè)定HepG2細(xì)胞的增殖情況,Anexin V-PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果MTT法顯示，4種藥物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖具有抑制作用，在一定范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈量效依賴關(guān)系，其中7-乙基-10-羥基喜樹堿抑制效果最好，10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿次之，喜樹堿抑制效果最差。不同濃度的喜樹堿及衍生物處理肝癌細(xì)胞HepG2，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著藥物濃度的變化，細(xì)胞凋亡也呈現(xiàn)梯度變化,結(jié)構(gòu)修飾后的SN38比SN22、HCPT及CPT作用更強(qiáng)。結(jié)論喜樹堿及衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2有抑制作用，并且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]喜樹堿；10-羥基喜樹堿；7-乙基喜樹堿；7-乙基-10-羥基喜樹堿；HepG2細(xì)胞

0　引言

肝細(xì)胞癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，早期發(fā)現(xiàn)困難，臨床病程短，進(jìn)展迅速，中位生存期僅3～6個(gè)月。治療上以手術(shù)切除為主，但多數(shù)患者確診時(shí)已喪失手術(shù)時(shí)機(jī)。非手術(shù)治療以肝動(dòng)脈栓塞化療為首選，經(jīng)皮肝穿瘤體內(nèi)冷凍、射頻、無水乙醇及抗癌藥物注射治療也有一定效果，針對(duì)肝癌常選用的化療藥物有順鉑、阿霉素、絲裂霉素、羥基喜樹堿等[1-3]。喜樹堿屬于萜類吲哚生物堿，由Wall等首次從我國特有物種喜樹的莖部分離純化得到。1985年，Hisang等發(fā)現(xiàn)，喜樹堿能通過特異性地阻斷拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(Topoisomerase Ⅰ，Topo Ⅰ)的合成抑制癌細(xì)胞增殖，區(qū)別于以往對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(Topoisomerase Ⅱ，Topo Ⅱ)為靶點(diǎn)進(jìn)行攻擊的抗癌藥物，因而備受關(guān)注。而后研究者們又通過對(duì)CPT環(huán)7、9、10、11位的結(jié)構(gòu)改造，獲得了拓?fù)涮婵怠⒁懒⑻婵?、勒托替康、羥基喜樹堿(HCPT)、9-氨基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、DB-67(7-t-butyldimethylsilyl-10-hydroxycamptothecin)等，其中拓?fù)涮婵岛虲PT-11、HCPT已用于臨床治療結(jié)腸癌、卵巢癌和小細(xì)胞肺癌[4-7]。目前提出的喜樹堿類可能的抗腫瘤機(jī)制包括細(xì)胞凋亡通路、信號(hào)通路、細(xì)胞周期和端粒損傷作用等[8-13]。本實(shí)驗(yàn)通過HepG2細(xì)胞株在喜樹堿及其衍生物7-乙基-喜樹堿、10-羥基-喜樹堿、7-乙基-10-羥基-喜樹堿的作用下，與對(duì)照組對(duì)比觀察其細(xì)胞的增殖抑制情況以及凋亡率，初步判斷藥物的抗癌療效，為臨床用藥提供基礎(chǔ)。

1　資料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑喜樹堿(西安匯林生物科技有限公司，含量：99.32%，批號(hào)：20130301)，10-羥基喜樹堿(西安匯林生物科技有限公司，含量:99.26%，批號(hào)：20130301)，7-乙基喜樹堿(西安匯林生物科技有限公司，含量：99.23%，批號(hào)：20130301)，7-乙基-10-羥基喜樹堿(西安匯林生物科技有限公司，含量：99.13%，批號(hào)：20130301)，DMEM(Gibco，USA)，新生牛血清FBS(杭州四季青公司)，四甲基偶氮唑(MTT,美國Sigma公司)，二甲基亞楓(DMSO，日本進(jìn)口)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning，USA)，Annexin V-PI試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.1.2儀器CKX-31倒置顯微鏡(Olympus)，CO2孵育箱(Therma)，MQX200型酶標(biāo)儀(BioTek)，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀(BDFACSCalibur)。

1.1.3細(xì)胞株HepG2細(xì)胞株購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，培養(yǎng)于含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將人體肝癌細(xì)胞HepG2用含10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，按常規(guī)方法消化、傳代，待細(xì)胞長至80%融合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行。將細(xì)胞分為對(duì)照組和給藥組，即喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿的不同濃度實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率取處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞加入胰蛋白酶消化，吹打制成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為104個(gè)/mL，以每孔體積200 μL接種于96孔培養(yǎng)板上。培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后更換含不同濃度喜樹堿以及衍生物的藥物培養(yǎng)基，對(duì)照組加等體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入180 μL新鮮DMEM培養(yǎng)液，每孔加5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，輕輕扣板于濾紙上，每孔加入DMSO溶液200 μL，置于搖床上振蕩3 min使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測(cè)各孔的光密度值(OD值)，然后計(jì)算不同濃度的喜樹堿以及衍生物對(duì)細(xì)胞的生長抑制情況，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100%，并計(jì)算IC50值。

1.2.3Anexin V-PI染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，消化吹打成單細(xì)胞懸液后用培養(yǎng)基稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，接種于6孔板內(nèi)，每孔2 mL，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直到細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞長至孔底面積70%或80%左右時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，加入含藥培養(yǎng)基，作用48 h后收集各組細(xì)胞。按試劑盒操作，將各組細(xì)胞離心，預(yù)冷PBS洗滌棄上清，殘?jiān)?xì)胞收集至流式管。每管加10 μL Annexin V和 5 μL PI，避光靜置15 min，加300 μL預(yù)冷PBS，振蕩混勻上機(jī)。

2　結(jié)果

2.1喜樹堿及其衍生物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿類藥物在作用48 h后均呈現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，不同藥物不同濃度細(xì)胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著作用濃度增加，抑制作用越明顯，增殖抑制作用的大小呈濃度依賴性(見圖1)。4種藥物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2抑制作用強(qiáng)弱依次為7-乙基-10-羥基喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、喜樹堿。7-乙基-10-羥基喜樹堿相同濃度時(shí)表現(xiàn)出最大的抑制作用，0.01 μmol/L時(shí)的抑制率為17.04%，1 μmol/L時(shí)的抑制率為59.91%，10 μmol/L時(shí)的抑制率增至70.50%；喜樹堿表現(xiàn)出最小的增殖抑制作用，0.1 μmol/L時(shí)的抑制率為3.82%，1 μmol/L時(shí)的抑制率增至36.21%，10 μmol/L時(shí)的抑制率增至43.33%。10-羥基喜樹堿與7-乙基喜樹堿藥物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用接近，但隨著濃度的增加，7-乙基喜樹堿的增殖抑制率較10-羥基喜樹堿升高更為明顯。4種藥物的IC50分別為1.859 1、3.363 3、6.265 9、8.523 3 μmol/L。

圖1　喜樹堿及衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制曲線圖

2.2喜樹堿及其衍生物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響運(yùn)用Annexin V-FITC/PI雙染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)觀察并計(jì)算喜樹堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率，得到藥物濃度-凋亡率圖，見圖2。喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡影響的結(jié)果顯示，對(duì)照組48 h后的凋亡率為8.93%。肝癌細(xì)胞HepG2在4種藥物作用下細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且不同藥物的凋亡率隨濃度的增加呈不同幅度升高，總體作用結(jié)果呈現(xiàn)濃度依賴性。說明喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿能促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡，其中7-乙基-10-羥基喜樹堿誘導(dǎo)效果最為明顯(見圖3)，喜樹堿最弱。

圖2　喜樹堿及衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的流式細(xì)胞圖

圖3　SN38濃度依賴性流式細(xì)胞凋亡率圖以及HCPT和SN22在10 μmol/L的流式凋亡圖

3　討論

喜樹堿主要是通過抑制腫瘤細(xì)胞中Topo Ⅰ的活性來發(fā)揮抗腫瘤作用。TopoⅠ是一種與DNA復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的細(xì)胞核內(nèi)酶。處于S期的細(xì)胞對(duì)喜堿類藥物誘導(dǎo)凋亡更為敏感，S期細(xì)胞易感原因與DNA復(fù)制有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞DNA在大量復(fù)制活躍時(shí)，TopoⅠ剪切DNA雙鏈形成的TopoⅠ-DNA可裂解復(fù)合物，喜樹堿能與其結(jié)合，形成CPT-TopoⅠ-DNA三元復(fù)合物，使可逆的可解離復(fù)合物轉(zhuǎn)變成不可逆的復(fù)合物，抑制由TopoⅠ介導(dǎo)的DNA裂解和重新連接反應(yīng)，最終引起DNA鏈斷裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14-16]。

本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了喜樹堿及其衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2具有較明顯的抑制作用。自喜樹堿被發(fā)現(xiàn)以來，一直具有良好的抗癌效果，到目前為止，經(jīng)過優(yōu)化結(jié)構(gòu)得到一系列的衍生物也在臨床上廣泛使用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，喜樹堿、10-羥基喜樹堿、7-乙基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿呈濃度依賴性顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，尤其是7-乙基-10-羥基喜樹堿在癌細(xì)胞增殖方面有很強(qiáng)的抑制作用。細(xì)胞凋亡情況顯示喜樹堿及其衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2有良好的凋亡誘導(dǎo)作用，與正常組比較，早期與晚期凋亡百分比均明顯提高，其中7-乙基-10-羥基喜樹堿誘導(dǎo)作用最佳。

綜上所述，喜樹堿以及衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2具有良好的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，具有良好的開發(fā)空間，有望給臨床用藥提供基礎(chǔ)。

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收稿日期：2015-08-25

基金項(xiàng)目：湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(D20152105)；十堰市科學(xué)技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目(15Y48)；湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2015CFB615)；湖北醫(yī)藥學(xué)院優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃(2014CXG04)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603004

Research on the effect of camptothecin and its derivatives on proliferation and apoptosis of liver cancer cell HepG2

CHEN Qin-hua,YU Fei,LI Peng*,ZHU Jun

(Desect1ment of Medical Experiment Center,Affiliated Dongfeng Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of camptothecin (CPT) and its derivatives 10-hydroxy camptothecin (HCPT),7-ethyl camptothecin (SN22),7-ethyl-10-hydroxy camptothecin (SN38) on inhibition of hepatoma cell line HepG2 and induction of its apoptosis.MethodsThe vegetative HepG2 cells of logarithmic phase were assigned as control group and experimental group.Four drugs were made to different concentrations,which were 0.01,0.1,1,10,100 μmol/L.Different concentrations of drug solutions were effected on HepG2 cells in 48 h,then MTT method was used to detect the proliferation of HepG2 cell and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry (FCM) using Anexin V-PI staining.ResultsThe results by MTT method showed four drugs had inhibitory effect on proliferation of HepG2 cells,moreover,the proliferation inhibition of HepG2 cells was enhanced gradually with the increase of drug concentrations in a certain scope drug concentrations,and the proliferation inhibition was dependent on drug concentration.The sequences of proliferation inhibition were SN38,HCPT,SN22,and CPT.With different concentrations of camptothecin and derivatives with HepG2 liver cancer cells,there were significant differences compared with control group,and as drug concentration changed,cell apoptosis also presents gradient change;structure modification of SN38 was stronger than SN22,CPT and HCPT function by FCM using AnexinV-PI staining.ConclusionCamptothecin and its derivatives can inhibit HepG2 cells and induce cell apoptosis.

Key words：Camptothecin; 10-hydroxy camptothecin; 7-ethyl camptothecin; 7-ethyl-10-hydroxy camptothecin; HepG2 cells