抗菌肽的研究進(jìn)展

胡　凌，林星宇，盧　鵬，陳有才，張　軍，胡衛(wèi)杰，武　剛

（1.四川省自貢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川　自貢　643000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院；3.西南交通大學(xué)）

抗菌肽的研究進(jìn)展

胡凌1，林星宇2，盧鵬3，陳有才1，張軍1，胡衛(wèi)杰1，武剛1

（1.四川省自貢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川自貢643000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院；3.西南交通大學(xué)）

1　概述

隨著傳統(tǒng)抗生素的大量使用，藥物殘留和菌株耐藥性等問(wèn)題變得越來(lái)越嚴(yán)重，尋找新型抗生素替代品已迫在眉睫。抗菌肽以其獨(dú)特的抗菌機(jī)制及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，引起了學(xué)界的廣泛關(guān)注，學(xué)者們普遍認(rèn)為其在替代傳統(tǒng)抗生素、減少菌株耐藥性等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。1972年，Boman等首先從果蠅中發(fā)現(xiàn)了抗菌肽。1974年，Boman等又從天蠶蛾蛹的血液淋巴中發(fā)現(xiàn)了具有抗菌活性的多肽；1980年，Huhmark等從惜古比天蠶蛹中分離到3種抗菌多肽，后來(lái)將其發(fā)現(xiàn)的抗菌肽命名為Cecropin（天蠶素）；1981年，Steiner等在Nature上發(fā)表了CecropinA和CecropinB的氨基酸序列，這被認(rèn)為是第一個(gè)真正意義上的抗菌肽。此后，抗菌肽被分離、純化和鑒定的種類數(shù)量越來(lái)越多，至今已有兩千多種抗菌肽及其類似物被發(fā)現(xiàn)。

抗菌肽（antibacterialpeptides）又被稱為抗微生物肽（antimicrobialpeptides，AMPs），是一類具有抗微生物活性的小分子多肽，動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌都能產(chǎn)生，一般由12～50個(gè)氨基酸組成，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。AMPs首先是作為抗生素替代品被人們所知的，相比于傳統(tǒng)抗生素，細(xì)菌對(duì)AMPs不易產(chǎn)生抗性、耐藥性。因?yàn)锳MPs主要通過(guò)與細(xì)胞膜相互作用來(lái)殺菌而不是抑菌，而傳統(tǒng)抗生素一般是抑菌而不是殺菌。且AMPs的抗菌機(jī)制除了破壞細(xì)胞膜外，還能進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)去抑制一系列的生理生化反應(yīng)；有些AMPs兼具破壞膜完整性和抑制生理生化反應(yīng)的雙重作用機(jī)制。值得注意的是，AMPs的本質(zhì)是多肽，因此其生物活性與其理化性質(zhì)密切相關(guān)，相關(guān)理化因素的改變將會(huì)導(dǎo)致AMPs生物活性的變化。

2　抗菌肽的分類

AMPs的來(lái)源廣泛、數(shù)量眾多，因而AMPs的分類方法多種多樣，下面介紹幾種目前常用的分類方法。人們依據(jù)AMPs的來(lái)源不同，將其分為哺乳動(dòng)物AMPs、昆蟲AMPs、水生動(dòng)物AMPs、兩棲類AMPs、禽類AMPs、植物AMPs、真菌AMPs和細(xì)菌AMPs等。依據(jù)合成形式的不同，將其分為核糖體合成的AMPs和非核糖體合成的AMPs。依據(jù)所帶電荷的不同，又可分為陽(yáng)離子AMPs和陰離子AMPs。

依據(jù)AMPs的二級(jí)結(jié)構(gòu)不同，將其分為α-螺旋型AMPs、β-折疊型AMPs、環(huán)形結(jié)構(gòu)AMPs和富含某些氨基酸殘基的AMPs。

3　抗菌肽的作用機(jī)理

3.1抗菌肽的抗菌機(jī)制

由于AMPs大多都帶正電荷，其首先通過(guò)靜電引力與細(xì)胞膜上的負(fù)電荷區(qū)域相互作用，再經(jīng)一系列的過(guò)程最終在細(xì)胞膜上形成孔洞或者進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到殺死細(xì)菌的作用。無(wú)論如何，AMPs與細(xì)胞膜之間相互作用是其發(fā)揮抗菌機(jī)制的第一步。有些AMPs還能穿透胞膜到細(xì)胞內(nèi)，作用于DNA、RNA、酶和蛋白質(zhì)等分子，除了直接抑制細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的合成，還可以抑制細(xì)胞的呼吸作用和細(xì)胞壁的合成。

3.2抗菌肽的抗病毒機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)，AMPs不僅能夠殺死細(xì)菌，而且還能抑制病毒，這為抗病毒藥物的研發(fā)提供了新的途徑。其抑制病毒的機(jī)理為：①直接與病毒衣殼蛋白相互作用，阻斷病毒的吸附侵入；②抑制病毒基因表達(dá)和病毒蛋白合成，從而抑制病毒的復(fù)制；③上調(diào)干擾素和趨化因子的表達(dá)，刺激宿主細(xì)胞的抗病毒免疫系統(tǒng)從而間接發(fā)揮其抗病毒活性。

3.3抗菌肽的抗真菌機(jī)制

AMPs對(duì)真菌也有一定的殺傷作用，其作用機(jī)理為：①妨礙真菌細(xì)胞壁的正常合成，從而殺死真菌；②與細(xì)胞內(nèi)線粒體及核酸等細(xì)胞器相互作用，比如其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致ATP外流，從而導(dǎo)致真菌死亡；③胞膜攻擊作用，與抗菌機(jī)制相似，其可以破壞真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使得重要內(nèi)容物外漏，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這也是AMPs殺傷真菌細(xì)胞的最基本的作用機(jī)制。

3.4抗菌肽的抗腫瘤機(jī)制

AMPs除了能對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌等有抑制作用外，還具有抑制或者殺滅腫瘤的作用，這一發(fā)現(xiàn)引起了學(xué)者們的關(guān)注，對(duì)其作用機(jī)制的研究也越來(lái)越多。目前，發(fā)現(xiàn)的作用機(jī)制有：①通過(guò)攻擊腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而在其細(xì)胞膜上形成孔道，引起細(xì)胞內(nèi)容物大量滲出，最終使腫瘤細(xì)胞不能維持滲透壓而死亡；②破壞腫瘤細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，主要使腫瘤細(xì)胞染色體DNA斷裂，從而達(dá)到破壞細(xì)胞骨架的目的；③通過(guò)線粒體途徑和死亡受體途徑等誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

4　抗菌肽的基因工程研究

AMPs以其獨(dú)特的抗菌機(jī)制及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在替代傳統(tǒng)抗生素、減少菌株耐藥性等方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。但AMPs的獲得途徑有限，限制了AMPs產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。因此利用基因工程技術(shù)來(lái)獲得AMPs具有重要意義，其不僅可使生產(chǎn)AMPs的成本降低、還可以使其產(chǎn)量提高。但由于AMPs為具有生物學(xué)活性的小分子多肽，因而其容易被蛋白酶降解，且其表達(dá)產(chǎn)物通常會(huì)殺傷宿主，這使得利用基因工程技術(shù)來(lái)獲得AMPs較為困難。為解決這些問(wèn)題，科學(xué)家們做了許多的探索，最終找到了一些途徑來(lái)避免這些問(wèn)題的發(fā)生。比如可通過(guò)融合表達(dá)的方式來(lái)獲得AMPs以避免其對(duì)宿主的傷害，或者用真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)替代原核表達(dá)系統(tǒng)保證AMPs的順利表達(dá)。目前，一般使用原核表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)來(lái)獲得AMPs。

5　抗菌肽在畜牧業(yè)中的應(yīng)用

5.1抗菌肽在飼料添加劑中的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，在飼料添加劑中使用AMPs能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。此后，學(xué)者們對(duì)此進(jìn)行了大量的試驗(yàn)。汪以真等研究發(fā)現(xiàn)，重組豬乳鐵蛋白（rPLF）不僅對(duì)豬腸道微生物菌群有類似于抗生素的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)其還能促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)。馬衛(wèi)明等研究發(fā)現(xiàn)，豬小腸AMPs能夠使雛雞小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收增加，從而促進(jìn)雛雞的生長(zhǎng)發(fā)育。陳曉生等用CADYP飼喂肉鴨，發(fā)現(xiàn)CADYP能顯著提高肉鴨的日增重和凈肉率。綜上表明，AMPs用作飼料添加劑有良好的應(yīng)用前景。隨著AMPs的生產(chǎn)成本降低，在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用也將會(huì)越來(lái)越廣泛。

5.2抗菌肽在疫病防治中的作用

大量研究表明，AMPs具有廣譜的抗菌活性，可在一定程度上減少抗生素的臨床用量，減少耐藥菌株的出現(xiàn)。陳曉生等比較了蠶抗菌肽-AD制劑與金霉素對(duì)鴨腸道菌群（大腸桿菌和乳酸菌）的影響情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMPs對(duì)這兩種細(xì)菌都有明顯的抑制作用，而金霉素只對(duì)乳酸菌有顯著抑制作用，對(duì)大腸桿菌抑制作用并不顯著，初步證明AMPs調(diào)節(jié)雛鴨腸道菌群平衡能力優(yōu)于金霉素。馬衛(wèi)明等研究發(fā)現(xiàn)，豬小腸AMPs對(duì)多種致病菌均有不同程度的抑制作用，其殺菌率由59.5%～98.5%不等。汪以真等比較了7種 AMPs（cecropinP1、cecropinA、magainin2、defensin1、bactenecin、lactoferricin和indolicidin）與4種抗生素（鹽酸金霉素、去甲萬(wàn)古霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素）體外對(duì)大腸桿菌K88、大腸桿菌（ATCC25922）、豬霍亂沙門氏菌（ATCC50020）、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌（ATCC25923）的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)AMPs對(duì)幾種革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌有不同程度的抗菌效果，盡管抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果要好于AMPs，但某些AMPs對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果優(yōu)于抗生素。馬曉艷等研究發(fā)現(xiàn)，新疆家蠶抗菌肽（CecropinXJ）對(duì)革蘭氏陽(yáng)性球菌的生長(zhǎng)有抑制作用，而對(duì)大腸桿菌抑制作用不明顯。其抑菌效果雖沒(méi)有抗生素抑菌效果好，但可與抗生素聯(lián)合使用來(lái)減少耐藥性。王芳等的體外抑菌試驗(yàn)表明，Nisin在普通肉湯和牛奶中對(duì)奶牛乳房炎的主要致病菌金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌均有良好的抑制作用，且對(duì)青霉素耐藥的菌株也具有較好的抑制作用。

6　面臨的問(wèn)題

隨著AMPs在臨床上的應(yīng)用，必將為生物醫(yī)藥領(lǐng)域帶來(lái)一場(chǎng)新的革命。但如果要將AMPs藥物全面推向市場(chǎng)可能還要面臨許多的挑戰(zhàn)，還需解決以下幾個(gè)問(wèn)題。

6.1抗菌肽的安全性問(wèn)題

目前，我們?nèi)鄙貯MPs藥效動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)（包括潛在的免疫毒性）等方面的研究數(shù)據(jù)；異源性的AMPs應(yīng)用于動(dòng)物或在人類全身用藥時(shí)可能會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)；許多天然AMPs都有溶血作用，不利于AMPs的藥物開(kāi)發(fā)。因此，如何在保持AMPs生物學(xué)活性的同時(shí)，降低其細(xì)胞毒性是急需解決的問(wèn)題之一。

6.2抗菌肽的體內(nèi)穩(wěn)定性問(wèn)題

AMPs雖具有一定的熱穩(wěn)定性，但其一級(jí)結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)堿性氨基酸殘基（如賴氨酸、精氨酸），因而容易被蛋白酶降解，從而限制了AMPs作為藥物在體內(nèi)的使用。因此，如何使AMPs在體內(nèi)避免被蛋白酶降解也是需要解決的問(wèn)題，這直接關(guān)系到AMPs藥物的應(yīng)用效果。

6.3抗菌肽的耐藥性問(wèn)題

從進(jìn)化的觀點(diǎn)來(lái)看，既然有些細(xì)菌可以產(chǎn)生AMPs，因此其也必然存在逃避自身AMPs的作用機(jī)制。從生物學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，雖然AMPs對(duì)細(xì)菌有多種作用機(jī)制，但一般以細(xì)胞膜為其主要的作用靶點(diǎn)，進(jìn)而改變膜完整性或干擾胞內(nèi)生理生化反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)菌死亡。因此，細(xì)菌可以通過(guò)減弱與AMPs結(jié)合、降低AMPs有效濃度等方式產(chǎn)生對(duì)AMPs的耐受。研究證實(shí)，病原微生物可通過(guò)分泌蛋白酶降解胞外AMPs；降低細(xì)胞外膜負(fù)電荷從而減少與AMPs結(jié)合；修飾細(xì)胞外膜屏蔽AMPs；排出已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的AMPs；改變膜流動(dòng)性等方式來(lái)抵御AMPs的作用。□