血漿NF-κB和IL-8在急性百草枯中毒腎損傷中的作用及褪黑素對(duì)其影響的研究

王鑫　孫桂芹　周強(qiáng)　李兵　李愛軍　陳寧

?

血漿NF-κB和IL-8在急性百草枯中毒腎損傷中的作用及褪黑素對(duì)其影響的研究

王鑫孫桂芹周強(qiáng)李兵李愛軍陳寧

目的觀察急性百草枯中毒大鼠血漿中核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)含量水平的變化，以及褪黑素的影響，探討急性百草枯中毒導(dǎo)致腎損傷的機(jī)制。方法選取126只成年健康SD(Sprague Dawley)大鼠(雌雄各半)隨機(jī)分為對(duì)照組、染毒組、治療組，染毒組和治療組分別給予20%百草枯溶液25 mg/kg，腹腔內(nèi)一次性注射。治療組大鼠腹腔內(nèi)每天1次注射褪黑素10 mg/kg，對(duì)照組和染毒組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液腹腔內(nèi)注射。于1、3、7、14、21、28、35 d留取尿液，用免疫比濁法測(cè)3組24 h尿蛋白定量；每組各取6只，乙醚麻醉下，由腹主動(dòng)脈采血，觀察比較血漿中NF-κB、IL-8含量的變化。結(jié)果與對(duì)照組比較，染毒組血漿NF-κB水平在1 d時(shí)顯著升高，3 d達(dá)到高峰，各時(shí)段明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。染毒組IL-8水平從1 d開始升高，與對(duì)照組比較，1～35 d差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療組NF-κB水平較染毒組降低，各時(shí)間段與染毒組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對(duì)照組比較，1～35 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療組IL-8水平明顯受到了抑制，與染毒組比較，1～7 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，14～35 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，1～21 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，28～35 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論NF-κB、IL-8在急性百草枯中毒大鼠血漿中的含量發(fā)生改變，它們可能參與了百草枯導(dǎo)致腎臟損傷的過程；應(yīng)用褪黑素治療，改變了血漿中NF-κB、IL-8含量的變化，可能與褪黑素較強(qiáng)的抗氧化、抑制炎性介質(zhì)的釋放等功能有密切關(guān)系。

百草枯中毒；NF-κB；IL-8；腎損傷；褪黑素

百草枯(paraquat,PQ)是一種非選擇性、高效、接觸性除草劑，目前，在世界范圍內(nèi)廣泛使用。隨著其在我國農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用，PQ中毒也日趨增多。PQ除草效果好，但它對(duì)人畜具有很強(qiáng)毒性，因自服或誤服引起急性中毒屢有發(fā)生。我國雖無PQ中毒的正式統(tǒng)計(jì)資料，但根據(jù)諸多文獻(xiàn)報(bào)道，PQ中毒已成為最常見的農(nóng)藥中毒之一，在有些地區(qū)已成為繼有機(jī)磷農(nóng)藥中毒之后排第二位、死亡絕對(duì)數(shù)占第一位的農(nóng)藥中毒類型[1]。由于其發(fā)病機(jī)制還不十分清楚，也無特效解毒藥物，因此PQ中毒所引起的機(jī)體病理生理變化成為當(dāng)前急診中毒治療學(xué)研究的熱點(diǎn)。PQ進(jìn)入體內(nèi)后，以原形從腎臟排出，所以腎功能的健全對(duì)體內(nèi)PQ的清除至關(guān)重要[2]。但是，在急性PQ中毒中，腎損傷的具體機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過觀察急性PQ中毒大鼠模型的腎組織病理學(xué)改變，通過測(cè)定大鼠尿蛋白的含量和外周血中NF-κB、IL-8的變化，以及褪黑素(melatonin,MT)對(duì)其的影響，探討急性PQ中毒導(dǎo)致腎損傷的機(jī)制以及MT對(duì)其的治療作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及試劑清潔級(jí)成年健康(sprague dawley，SD)大鼠126只(雌雄各半)，體重250～300 g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(冀)2011-0004。 20% PQ溶液(英國先正達(dá)股份有限公司生產(chǎn))，MT購自美國Sigma公司，Rat NF-κB ELISA、Rat IL-8 ELISA試劑盒均由美國Rapidbio(R&B)公司生產(chǎn)。芬蘭Orion公司尿蛋白診斷試劑盒。代謝籠、日本7060C全自動(dòng)生化分析儀、電熱恒溫水溫箱、-80℃超低溫冰箱、離心機(jī)均由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院急診科提供。

1.2動(dòng)物分組及模型制備將126只SD大鼠分成對(duì)照組、染毒組和治療組，每組42只。染毒組及治療組一次性腹腔內(nèi)注射PQ 25 mg/kg,建立中毒模型，對(duì)照組注射等量0.9%氯化鈉溶液。隨后，治療組腹腔內(nèi)注射MT 10 mg/kg,1次/d，對(duì)照組及染毒組大鼠腹腔內(nèi)注射等量0.9%氯化鈉溶液，直至留取標(biāo)本。

1.3取材及樣品制備3組大鼠在第1、3、7、14、21、28、35天，清晨空腹，各取出6只，行乙醚麻醉后，開腹，留取腎組織標(biāo)本，行光鏡觀察組織結(jié)構(gòu)的病理變化；分別從腹主動(dòng)脈采集非抗凝血1 ml，低溫下3 000 r/min離心15 min，取上清液，分別裝于干燥的EP管中，存放于-80℃低溫冰箱冷凍。用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血漿NF-κB、IL-8含量的變化。在各時(shí)間點(diǎn)收集24 h尿液，取10 ml,3 000 r/min離心10 min,取上清液-20℃保存,用免疫比濁法測(cè)定24 h蛋白含量。

1.4酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)上清液中NF-κB、IL-8含量嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書操作。在室溫下，將試劑盒放于操作臺(tái)上，準(zhǔn)備聚苯乙稀ELISA板，各孔中加入0.1 ml標(biāo)準(zhǔn)品、0.1 ml樣本、加入0.05 ml Anti-rat NF-κB Biotin、Anti-rat IL-8 Biotin輕輕晃動(dòng)30 s，搖勻，封閉板孔，37℃孵育3 h,包被液棄去，然后用洗滌液反復(fù)洗板3～5次。在各反應(yīng)孔中，加入稀釋的新鮮酶標(biāo)抗體0.1 ml，輕輕搖勻30 s，37℃孵育0.5 h，棄掉液體，再用洗滌液反復(fù)洗板3～5次。于各反應(yīng)孔中，依次加入顯色劑A及顯色劑B，輕輕搖勻30 s，在37℃避光條件下，放置15 min,最后加入終止液0.1 ml,充分搖勻30 s。于波長450 nm處測(cè)各孔的吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)各孔樣本的吸光度值計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品含量。

2　結(jié)果

2.1急性PQ中毒大鼠腎組織結(jié)構(gòu)的病理改變

2.1.1對(duì)照組：光鏡下觀察腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰完整，腎間質(zhì)和血管周圍無充血及炎細(xì)胞浸潤。

2.1.2染毒組：大體標(biāo)本可見，腎臟體積增大，呈暗紅色，表面有點(diǎn)片狀瘀斑和(或)出血點(diǎn)。光鏡下可見腎小球內(nèi)紅細(xì)胞增多，腎間質(zhì)有不同程度的充血、水腫伴有小灶狀和(或)大片狀炎性細(xì)胞浸潤。腎小管：染毒1 d，腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)空泡變性、水腫，部分管腔變窄，上皮細(xì)胞有脫落壞死現(xiàn)象； 7 d，腎小管上皮細(xì)胞重度水腫，核破裂、溶解、胞漿脫失，大量上皮細(xì)胞可見壞死并脫落入管腔，管腔有不同程度的堵塞； 28 d以后腎小管上皮細(xì)胞水腫減輕，可見管腔壞死物逐漸減少、消失。見圖1。

2.1.3治療組：經(jīng)MT干預(yù)后，腎組織結(jié)構(gòu)的病理損傷明顯減輕。染毒后1 d，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)輕度水腫。7 d，上皮細(xì)胞雖有壞死、脫落，但管腔內(nèi)壞死物較染毒組明顯減少。見圖2。

圖1 染毒組7d(HE×400)圖2 治療組7d(HE×400)

2.2急性PQ中毒大鼠尿液蛋白含量測(cè)定對(duì)照組大鼠尿液中有少量蛋白。染毒組1 d，尿液中就出現(xiàn)大量蛋白，逐漸升高，7 d達(dá)到高峰，然后逐漸下降，各時(shí)間段與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)過MT治療后，中毒大鼠尿液中蛋白含量較染毒組減少,與染毒組比較，3～28 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，1 d和35 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較所有時(shí)段差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。見表1。

組別1d3d7d14d21d28d35d對(duì)照組6.26±0.767.35±0.547.57±0.826.17±0.617.71±0.397.49±0.646.98±0.36染毒組35.36±0.98#48.45±0.85#56.67±0.42#52.68±0.92#49.65±0.74#35.37±0.34#26.41±0.51#治療組18.52±0.56*△25.58±0.64#△32.64±0.72#△30.25±0.79#△25.28±0.73#△17.55±0.47*△14.89±0.65*☆

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與染毒組比較，△P<0.05,☆P<0.01

2.3急性PQ中毒大鼠血漿中NF-κB、IL-8含量水平的變化

指標(biāo)1d3d7d14d21d28d35dNF-κB 對(duì)照組0.50±0.030.53±0.070.50±0.070.58±0.100.60±0.110.52±0.080.44±0.12 染毒組5.60±0.21*6.14±0.43*5.83±0.31*4.91±0.28*3.05±0.56*2.63±0.41*2.16±0.40* 治療組3.95±0.31*#4.51±0.53*#3.86±0.42*#2.65±0.31*#1.95±0.21*#1.85±0.25*#1.63±0.09*#IL-8 對(duì)照組0.45±0.060.43±0.040.52±0.050.49±0.070.50±0.070.46±0.120.40±0.08 染毒組3.98±0.08*4.08±0.16*3.60±0.38*3.18±0.45*2.70±0.44*2.26±0.35*1.98±0.24* 治療組2.25±0.07*△2.34±0.08*△1.89±0.15*△1.53±0.13*#1.39±0.21*#1.25±0.17#0.94±0.14#

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與染毒組比較，#P<0.05,△P<0.01

2.3.1NF-κB水平變化：染毒組NF-κB水平在1 d顯著升高，3 d達(dá)到高峰，此后逐漸下降，各時(shí)段與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療組，NF-κB水平較染毒組降低，各時(shí)間段與染毒組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對(duì)照組比較1～35 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

2.3.2IL-8水平變化：染毒組IL-8水平從1 d就開始升高，3 d達(dá)到高峰，此后維持在較高水平，與對(duì)照組比較，1～35 d差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療組，MT抑制了IL-8的水平升高，與染毒組比較，水平明顯降低，1～7 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，14～35 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，IL-8的水平仍較高，1～21 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，28～35 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3　討論

PQ商品名為克蕪蹤、一掃光，分子式C12H14N2·2Cl，化學(xué)名稱為1，1’-二甲基-4，4’-聯(lián)吡啶陽離子鹽。PQ中毒可累及全身多個(gè)臟器，嚴(yán)重時(shí)可引起多臟器功能衰竭。PQ在體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)尚未完全清楚，多根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)認(rèn)知[3]。進(jìn)入體內(nèi)的PQ與血漿蛋白結(jié)合很少，在腎小管內(nèi)幾乎不被重吸收，以原形從腎臟排出。因此腎功能的健全對(duì)清除已吸收的PQ至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)觀察了急性PQ中毒大鼠腎臟的病理結(jié)構(gòu)改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎小球體積增大、紅細(xì)胞增多，腎間質(zhì)有小灶狀或大片狀炎細(xì)胞浸潤、充血、水腫，腎小管上皮細(xì)胞有不同程度的變性、水腫、壞死、脫落，腎小管管腔堵塞、變窄，同時(shí)有大量蛋白尿出現(xiàn)，均提示PQ可引起腎損害。但腎損傷的發(fā)生機(jī)制還不十分清楚，多數(shù)國內(nèi)外研究認(rèn)為，PQ導(dǎo)致的腎損害與其聯(lián)吡啶陽離子的氧化、還原反應(yīng)有關(guān)[4]。PQ進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)經(jīng)單電子還原，生成聯(lián)吡啶陽離子和超氧陰離子(O2-)，PQ的氧化還原過程導(dǎo)致高活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)激增，大量氧自由基可以導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷的一系列連鎖反應(yīng)，如DNA損傷、酶抑制、細(xì)胞凋亡等。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)染毒大鼠腎臟中NF-κB和IL-8的水平明顯提高，推測(cè)它們可能參與了腎組織損傷的過程。

NF-κB是當(dāng)前研究最多的核轉(zhuǎn)錄因子，它是1986年由 Sen 等[5]在成熟的大鼠漿細(xì)胞核和B淋巴細(xì)胞提取物中發(fā)現(xiàn)的一類、具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞核蛋白因子。它被稱為氧化應(yīng)激敏感型轉(zhuǎn)錄因子，可在多種細(xì)胞中被氧自由基、細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1等)激活，它通過信號(hào)傳導(dǎo)通路參與多種前炎性因子/趨化因子、生長因子和粘附分子的表達(dá)，調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)的釋放、細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)等多種病理生理過程[6]。本研究結(jié)果顯示，血漿中NF-κB水平在染毒1 d 即開始升高，3 d達(dá)到高峰，以后逐漸下降。升高的原因可能是：(1)PQ中毒后產(chǎn)生大量的氧自由基可以激活NF-κB；(2)在PQ中毒初期，已有研究報(bào)道，大鼠腎組織中有多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1等的表達(dá)增加，而這些細(xì)胞因子可能參與了NF-κB的活化[7]。同時(shí)，我們的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，血漿IL-8含量水平的增高與NF-κB的激活幾乎是同步的，這是因?yàn)檠趸瘧?yīng)激激活了NF-κB，進(jìn)而啟動(dòng)了炎性細(xì)胞因子IL-8的活化，從而導(dǎo)致一系列炎性反應(yīng)。由此推測(cè)，NF-κB對(duì)急性PQ中毒腎損傷起了放大作用。

目前，PQ中毒的治療仍處于探索階段，迄今尚無特效解毒藥物。由于氧化損傷參與了 PQ 中毒腎損傷的過程，因此抗氧化劑是當(dāng)前PQ中毒最重要的治療藥物。本實(shí)驗(yàn)采用了MT對(duì)PQ染毒大鼠進(jìn)行治療。MT是一種由松果體分泌的一種吲哚胺類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能[8]。據(jù)報(bào)道,MT是目前已知作用最強(qiáng)的內(nèi)源性抗氧化劑，除直接抑制和清除氧自由基外，還能增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶的作用，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等[9]。本研究發(fā)現(xiàn)MT治療組大鼠腎組織病理改變明顯減輕，尿中蛋白含量明顯減少，血漿中NF-κB及IL-8含量水平顯著低于染毒組，這表明MT可通過清除氧自由基抑制NF-κB的激活，減少IL-8的過度產(chǎn)生，達(dá)到減輕腎損傷的作用。因此抑制自由基產(chǎn)生及NF-κB活化的措施可能是治療 PQ中毒的一個(gè)新途徑。

1中國醫(yī)師協(xié)會(huì)急診醫(yī)師分會(huì).急性百草枯中毒診治專家共識(shí)(2013).中國急救醫(yī)學(xué),2013,33:484-489.

2Chang X,Lu W,Dou T,et al.Paraquat inhibits cell viability via enhanced oxidative stress and apoptosis in human neural progenitor cell.Chem Biol Interact,2013,206:248-255.

3李壽彭，韓繼媛，孫鵬，等.硫辛酸對(duì)急性百草枯中毒肺泡表面活性物質(zhì)的影響.中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2013,22: 1213-1218.

4Tian ZG,Ji Y,Yan WJ,et al.Methylene blue protects against paraquat-induced acute lung injury in rats.Int Immunopharmacol,2013，17：309-313.

5Sen R,Singh H,Baltimore D,et al.A nuclear factor that binds to a conserved sequence motif in transcriptional control elements of immunoglobulin genes.Nature,1986,31:154-158.

6Lu T,Burdelya LG,Swiatkowski SM,et al.Secrete transforming growth factor beta2 activates NF-kappaB,blocks apoptosis,and is essential for the survival of some tumor cells.Proc Natl Acad Sci USA,2004,101:7112-7117.

7Li D,Xu LY,Chang ZJ,et al.Effect of thalidomide in a mouse model of paraquat-induced acute lung injury and the underlying mechanisms.Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi,2013,31:178-183.

8徐玉生，李星辰，金偉林，等．褪黑素對(duì)大鼠急性脊髓損傷后不同時(shí)期IL-10表達(dá)的影響．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2013，48:193-197．

9丁可，李桃，王漢東，等.褪黑素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的抗氧化應(yīng)激作用及機(jī)制研究.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2015,14:433-439.

2015-10-23)

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.15.016

056001河北省邯鄲市中心醫(yī)院急診科

R 595.5

A

1002-7386(2016)15-2296-03