結(jié)直腸癌中Girdin和Akt1蛋白的表達(dá)及臨床意義

許欣　姚冬穎

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結(jié)直腸癌中Girdin和Akt1蛋白的表達(dá)及臨床意義

許欣姚冬穎

目的檢測(cè)Girdin和Akt1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，分析其與臨床病理特征的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)135例結(jié)直腸癌組織和40例正常結(jié)直腸組織中Girdin和Akt1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果Girdin和Akt1在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為38.5%和51.1%，均明顯高于正常結(jié)直腸組織中的15.0%和20.0%(P<0.05)。Girdin和Akt1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別比、腫瘤大小、組織分級(jí)無關(guān)(P>0.05)，而與結(jié)直腸癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)(P<0.05)。Girdin和Akt1的表達(dá)在結(jié)直腸癌中呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論Girdin和Akt1可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，聯(lián)合檢測(cè)其表達(dá)情況有助于判斷結(jié)直腸癌的惡性程度和預(yù)后。

結(jié)直腸腫瘤；Girdin；Akt1；免疫組化

目前，我國(guó)臨床常見的消化道惡性腫瘤是結(jié)直腸癌，近幾十年來人群發(fā)病率迅速上升，最新研究報(bào)道腸癌死亡率也呈逐年上升趨勢(shì)并引起廣泛關(guān)注，嚴(yán)重威脅人類健康生活，化療作為癌癥的主要治療手段之一，減輕患者的癥狀，提高患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的壽命，是治療的主要目的，提高患者的生活質(zhì)量更具有切身好處。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，尋找腫瘤標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)而變得尤為重要[1]。Girdin是新近發(fā)現(xiàn)的一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，Akt1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，二者均與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。本研究試圖通過免疫組化染色的方法檢測(cè)Girdin和Akt1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討其與臨床病理特征的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的診斷、預(yù)后判斷和治療方面提供客觀的參考指標(biāo)。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2014年1～12月河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院手術(shù)切除的石蠟存檔的結(jié)直腸癌標(biāo)本共135例，所有結(jié)直腸癌病例臨床及病理資料均完整，術(shù)前均未接受任何放療、化療、內(nèi)分泌抗腫瘤治療等。從病理資料庫(kù)獲取臨床參數(shù)資料，男73例，女62例；年齡29～73歲，中位年齡49歲；腫瘤直徑<4 cm者54例，≥4 cm者81例；組織分級(jí)遵從WHO組織分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其中高至中分化79例，低分化56例；癌組織未侵及漿膜層44例，癌組織侵及漿膜層91例；淋巴結(jié)無癌組織轉(zhuǎn)移76例，淋巴結(jié)有癌組織轉(zhuǎn)移59例。另外選取正常組織對(duì)照組40例，組織標(biāo)本為取自距離癌組織邊緣5 cm以上的正常結(jié)直腸組織。均常規(guī)取材組織標(biāo)本，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.2方法采用免疫組化EnVision兩步法進(jìn)行Girdin及 Akt1表達(dá)定位及半定量分析，全程免疫組化染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，兔抗人Girdin多克隆抗體(稀釋度1∶400)，購(gòu)自于美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗人Akt1多克隆抗體(工作液)及即用型免疫組化廣譜試劑盒，均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。陰性對(duì)照用PBS代替一抗作，陽(yáng)性對(duì)照為試劑公司提供的陽(yáng)性切片。組織標(biāo)本經(jīng)連續(xù)切片、置烤箱烤干，常規(guī)二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫蠟至水，3%過氧化氫用蒸餾水新鮮配置，室溫下處理阻斷內(nèi)源性過氧化物酶15 min，蒸餾水洗2 min，微波修復(fù)抗原10 min，滴加一抗，每張切片滴加50 μl，4℃濕盒過夜，次日PBS洗5 min,共3次，每張切片分別滴加二抗50 μl，孵育30 min在37℃恒溫箱內(nèi)，PBS洗切片，每次5 min共3次，滴加新鮮配置DAB顯色劑，顯微鏡下控制染色，水充分沖洗以終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染、脫水、透明，中性樹脂封片。

1.3結(jié)果判斷 所有切片均觀察5個(gè)高倍視野，其中每個(gè)高倍視野共計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞。Girdin蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)，采用半定量積分法，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和著色強(qiáng)度判斷結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比：0分為≤5%，1分為6%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%；染色深度：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，兩者相乘：≤4分為陰性，>4分為陽(yáng)性[2]。Akt1蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比：0分為陰性，1分為1%～33%，2分為34%～66%，3分為>66%；染色深度：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，兩者相乘：<6分為陰性，≥6分為陽(yáng)性[3]。以上切片判定的結(jié)果，全部由病理科兩位高年資，且富有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生在雙盲情況下，認(rèn)真觀察評(píng)分確定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)關(guān)系采用Spearman法分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Girdin和Akt1在結(jié)直腸癌和正常胃組織中的表達(dá)Girdin蛋白在結(jié)直腸癌組織中主要表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞核，正常結(jié)直腸組織中僅少數(shù)微弱表達(dá)，135例結(jié)直腸癌中有52例表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率38.5%，明顯高于在正常結(jié)直腸組織中的陽(yáng)性表達(dá)率(15.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Akt1蛋白在結(jié)直腸癌組織中主要表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，正常結(jié)直腸組織中僅少數(shù)微弱表達(dá)于細(xì)胞膜，135例結(jié)直腸癌中有69例表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率51.1%，明顯高于在正常結(jié)直腸組織中的陽(yáng)性表達(dá)率(20.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2，表1、2。

圖1　結(jié)直腸癌中Girdin(+)(EnVision法×200)

圖2　在結(jié)直腸癌中Akt1(+)(EnVision法×200)

表1　結(jié)直腸癌和正常胃組織中Girdin和Akt1的表達(dá)　例(%)

2.2Girdin和Akt1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系綜合免疫組化染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床病理資料統(tǒng)計(jì)分析顯示，Girdin蛋白的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Girdin的陽(yáng)性率高于無轉(zhuǎn)移組，Girdin蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小、組織分級(jí)無明顯相關(guān)性。Akt1蛋白的表達(dá)與生物學(xué)特性的關(guān)系與Girdin蛋白一致，也只與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者的年齡、腫瘤大小、組織分級(jí)無明顯相關(guān)性。見表2。

2.3Girdin和Akt1在結(jié)直腸癌中表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，135例結(jié)直腸癌中，Girdin和Akt1蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.287，P=0.001)。見表3。

表2　結(jié)直腸癌中Girdin和Akt1的表達(dá)與臨床病理特性的關(guān)系　例

表3　結(jié)直腸癌中Girdin和Akt1表達(dá)的相關(guān)性　例

3　討論

腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和治療具有重要意義，隨著對(duì)惡性腫瘤在分子水平上的研究越來越深入，多種新型腫瘤標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)及分子靶向治療，在腫瘤治療方面的作用越來越重要。

Girdin蛋白定位于人類染色體2p16.1，由1870個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量220～250 kDa。Girdin通過參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架連接等途徑，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。Girdin蛋白能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，血管新生和自我吞噬等的調(diào)節(jié)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)[4,5]。已有報(bào)道，Girdin蛋白在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[6]。Shibata等[7]研究發(fā)現(xiàn)，由于Girdin 基因被沉默后，食道鱗癌細(xì)胞株KYSE其細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性明顯降低。免疫組化染色結(jié)果表明，在食道鱗癌患者中，Girdin 蛋白的表達(dá)在生存期明顯較長(zhǎng)患者的表達(dá)是明顯低于生存期短暫的患者。進(jìn)一步證明Girdin蛋白的表達(dá)與食道鱗癌細(xì)胞的侵襲性有明顯相關(guān)性，Girdin蛋白可能是食道鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后和治療的新的觀察指標(biāo)。國(guó)內(nèi)丁耘峰等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Girdin蛋白在正常乳腺組織和單純導(dǎo)管上皮增生組織中的表達(dá)低于乳腺癌，且與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及TNM分期有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中，Girdin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常黏膜組織，且隨浸潤(rùn)深度的增加和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生而增高，說明其與結(jié)直腸癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程有關(guān)，這與Jun等[9]的研究結(jié)果一致。提示Girdin蛋白高表達(dá)參與了腫瘤的形成和惡性演進(jìn)過程，可以作為腫瘤生物學(xué)行為的判斷指標(biāo)。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物與蛋白激酶A和C具有高度同源性，所以又稱蛋白激酶B(protein kinase)。Akt基因3個(gè)亞型Akt1、Akt2、Akt3的功能研究發(fā)現(xiàn)，均參與下游底物活化，其中Akt2最為主要，Akt1、Akt2、Akt3三個(gè)亞型的結(jié)構(gòu)同源，它們的功能也大部分相同，但是又各自具有不同的特征。Akt1在組織中分布廣泛，也是PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的主要作用靶點(diǎn)，作為細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子，Akt1在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中，活化釋放細(xì)胞存活信號(hào)，通過磷酸化激活，抑制其下游的多種作用底物，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的基本條件之一是血管的生成，P13K/Akt參與腫瘤血管生成的調(diào)控，促進(jìn)腫瘤血管的生成，并促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)療法以及放射療法的抵抗性[10,11]。有研究發(fā)現(xiàn)Akt1基因在人胃癌中表達(dá)增加，并在胃癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[12]，在肺癌中也發(fā)現(xiàn)Akt1異常表達(dá)和活性改變[13]。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，Akt1蛋白的表達(dá)，在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，并且其Akt1蛋白的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，血管的侵犯以及臨床病理分期等具有密切相關(guān)性，Akt1蛋白的表達(dá)在侵及漿膜層明顯高于未侵及漿膜層的表達(dá)，Akt1蛋白的表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)。提示Akt1過度表達(dá)可能與結(jié)直腸惡性腫瘤的形成有關(guān)，且增強(qiáng)了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

Girdin具有調(diào)控P13K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用，研究中還發(fā)現(xiàn)與Akt信號(hào)通路的關(guān)系密切。Girdin是一個(gè)極其重要的靶蛋白，在PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游，Girdin也是一個(gè)絡(luò)氨酸磷酸化蛋白，Girdin可以與Akt結(jié)合，并且磷酸化，并使其激活，繼而進(jìn)一步激活P13K-Akt通路，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。與此同時(shí)，腫瘤細(xì)胞中Girdin蛋白的高表達(dá)，也可以顯著增強(qiáng)Akt結(jié)構(gòu)中的位點(diǎn)，包括Thr-308和Ser-473位點(diǎn)的磷酸化，從而Akt的活性被進(jìn)一步增強(qiáng)，進(jìn)而最終增強(qiáng)PI3K/Akt信號(hào)通路下游的靶蛋白的磷酸化?？傊?，Girdin蛋白在P13K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[14,15]。我們研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中Girdin與Akt蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了二者相

互作用促進(jìn)了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，在結(jié)直腸癌中Girdin和Akt1的蛋白表達(dá)均呈高表達(dá)，也呈正相關(guān)，并且越來越多的證據(jù)表明，Girdin和Akt1的蛋白異常是人類發(fā)生惡性腫瘤最常見的分子事件之一，它們可以作為生物標(biāo)志物。Girdin和Akt1的蛋白活化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移，且參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲等惡性生物學(xué)行為。開發(fā)Girdin和Akt1靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物，檢測(cè)兩者在腫瘤患者血液中的水平，作為一種預(yù)后評(píng)估，為早期發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤，早期預(yù)防惡性腫瘤，以及對(duì)臨床合理治療惡性腫瘤也有重要意義，提供了一種新的方向和思路。

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Expression and clinical significance of Girdin and Akt1 in colorectal carcinoma

XUXin,YAODongying.

Desect1mentofPathology,XingtaiPeople’sHospital,Hebei,Xingtai054001,China

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of Girdin and Akt1 in colorectal carcinoma tissues,and to explore their correlation with clinicopathological features.MethodsThe expression levels of Girdin and Akt1protein were detected by immunohistochemistry (EnVision two-step method) in 135 cases of colorectal carcinoma tissues and 40 cases of normal colorectal tissues.ResultsThe positive expression rates of Girdin and Akt1 in colorectal carcinoma tissues were 38.5% and 51.1%,respectively, which were significantly higher than those (15.0% and 20.0%) in normal colorectal tissues (P<0.05). The expression levels of Girdin and Akt1 in colorectal carcinoma tissues were not correlated to patient's age, sex, tumor size and histolgical classification (P>0.05),however, which were closely related with the depth of infiltration and lymph node metastasis of colorectal carcinoma(P<0.05). Moreover the expression levels of of Girdin were positively correlated to those of Akt1 in colorectal carcinoma.ConclusionGirdin and Akt1 may be involved in the pathogenesis,development and metastasis of colorectal carcinoma. The combination detection of Girdin with Akt1 is helpful to evaluate the malignant degree and prognosis of colorectal carcinoma.

colorectal neoplasms;Girdin;Akt1;immunohistochemistry

2015-12-08)

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.15.005

054001河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院病理科

R 735.3

A

1002-7386(2016)15-2259-04