青稞褐變籽粒中寄藏真菌多樣性及其致病性分析

潘 虎，達(dá)娃卓瑪，次 頓，王秋玲，李 穎，白軍平

(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測研究所，西藏 拉薩 850032)

青稞褐變籽粒中寄藏真菌多樣性及其致病性分析

潘 虎，達(dá)娃卓瑪，次 頓，王秋玲，李 穎，白軍平

(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測研究所，西藏 拉薩 850032)

【目的】研究青稞褐變籽粒中寄藏真菌的致病性。【方法】采用平板分離藏青2000、藏青320、藏青85和喜拉22等4個青稞品種中的寄藏真菌，同時采用孢子懸浮液回接方法對分離真菌進(jìn)行青稞籽粒致病性分析?！窘Y(jié)果】從4個品種的青稞籽粒中共分離得到86株真菌，真菌ITS區(qū)測序表明：寄藏真菌分屬于13屬19種，同時編號為22-1的菌株同源性僅為89 %，可能是一類真菌新種。對20種寄藏真菌進(jìn)行青稞種子致病性分析表明：根霉屬真菌(Rhizopussp. 2000-4)、鐮刀屬真菌(Fusariumsp. 2000-5)、赤霉屬真菌(Gibberellasp. 2000-7)、附球霉屬真菌(Epicoccumsp. 320-9)、曲霉屬(Aspergillussp. 85-7)和未知種屬真菌(Endophytic fungi 22-1)等6類真菌能夠顯著降低青稞種子的發(fā)芽率，同時可引起種子褐變及腐爛，是青稞籽粒中寄藏的主要致病真菌類型?！窘Y(jié)論】青稞褐變籽粒中存在多種致病能力較強(qiáng)的寄藏真菌。

寄藏真菌；褐變；藏青2000；藏青320；藏青85；喜拉22

【研究意義】青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook. f. ) 又稱裸大麥，是青藏高原地區(qū)重要的糧食作物，西藏青稞種植面積約占全國的57 %，年產(chǎn)量約100萬噸[1]。青稞富含β-葡聚糖和“生育三烯酚”，具有提高免疫力和抗腫瘤等作用[2]，越來越多的受到全世界的廣泛關(guān)注。但落后的小農(nóng)生產(chǎn)方式和簡陋的儲存條件導(dǎo)致西藏地區(qū)青稞籽粒中真菌污染較為嚴(yán)重，寄藏真菌主要引起青稞籽粒發(fā)生褐變，可降低種子發(fā)芽率和導(dǎo)致種苗喪失活力等，嚴(yán)重影響青稞品質(zhì)；同時，部分寄藏真菌產(chǎn)生的毒素可導(dǎo)致大骨節(jié)病、克山病、癌癥等重大疾病[3]，嚴(yán)重影響青稞質(zhì)量安全和西藏人民的身體健康。【前人研究進(jìn)展】目前，有關(guān)青稞內(nèi)生真菌的研究較少，僅2007年龔弘強(qiáng)等[4-5]對拉薩市尼木縣和林周縣青稞籽粒內(nèi)生真菌區(qū)系研究后指出Cladosporium、Alternaria和Phoma是優(yōu)勢種群，同時首次報(bào)道了從西藏地區(qū)青稞籽粒中分離得到燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum)，該菌產(chǎn)生的毒素可引起癌癥、大骨節(jié)病、克山病等人類疾病?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究對采集于西藏拉薩市尼木縣褐變青稞籽粒中的寄藏真菌進(jìn)行了分離和鑒定，同時探討了寄藏真菌對青稞籽粒的致病性影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確青稞褐變籽粒中寄藏真菌的種類及其致病能力強(qiáng)弱，為防治由寄藏真菌引起的青稞病害提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

青稞籽粒采集于2015年6月，為農(nóng)戶家儲藏的去年產(chǎn)青稞籽粒，采集品種為藏青2000、藏青320、藏青85和喜拉22，采集地點(diǎn)為拉薩市尼木縣尼木鄉(xiāng)日錯村、東嘎村和尼榮村一組，每個村采集4個品種的青稞籽粒各1份，共采集青稞籽粒樣品12份。采集的青稞籽粒用無菌塑料袋包裝后 - 20 ℃ 保存?zhèn)溆?。

1.2 方法

1.2.1 寄藏真菌的分離篩選[6]將3個地點(diǎn)的同一品種青稞籽粒樣品充分混合，隨機(jī)選取50粒發(fā)生褐變的青稞籽粒，用5 %的NaClO溶液侵泡種子3 min，無菌水沖洗3次，用無菌刀將籽?？v切為2半，將縱切籽粒均勻放置于PDA培養(yǎng)基上，每皿擺放5顆籽粒。28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后，觀察并詳細(xì)記載長出真菌菌落的麥粒數(shù)和菌落數(shù)，對分離得到的真菌進(jìn)行純化并在PDA斜面培養(yǎng)基上4 ℃保藏備用。

1.2.2 寄藏真菌的鑒定 ①形態(tài)學(xué)鑒定：真菌形態(tài)學(xué)鑒定參考《真菌鑒定手冊》[7]；②分子生物學(xué)鑒定：純培養(yǎng)物真菌使用TIANGEN公司真菌基因組抽提試劑盒提取總 DNA，然后用于目的基因的擴(kuò)增。真菌PCR擴(kuò)增采用通用引物 ITS1/ITS4[8]。擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取 2 μl PCR 產(chǎn)物， 1 % 瓊脂糖電泳進(jìn)行產(chǎn)物檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物送交北京億明復(fù)興生物科技有限公司測序，利用 BLAST 軟件將測定得到的基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對分析，獲取相近菌株的ITS區(qū)基因序列，然后用 CLUSTAL X 軟件進(jìn)行全序列比對，利用 MEGA 3.0中的鄰接法(Neighbor-Joining)建立目的基因的系統(tǒng)發(fā)育樹[9]。

1.2.3 寄藏真菌對青稞籽粒的致病性[10]將分離純化得到的真菌菌株在(25±2)℃ 12 h NUV光照12 h，黑暗交替條件下PDA平板培養(yǎng)7 d，然后分別配制成1×106個/mL孢子懸浮液備用。隨機(jī)挑選青稞健康籽粒50粒，經(jīng)1 %的NaClO溶液表面消毒干燥后，在無菌條件下用2 mL孢子懸浮液接種24 h，重復(fù)3次，并設(shè)置無菌水為對照。將接種過孢子懸浮液的種子等距離放置于培養(yǎng)皿中(皿中置3層濕濾紙)，每天在25 ℃光照8h，15 ℃黑暗16h條件下培養(yǎng)7 d，觀測種子發(fā)芽率，培養(yǎng)28 d后記錄青稞種子褐變率和腐爛率。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞籽粒寄藏真菌的物種多樣性

從4個青稞品種籽粒中共分離得到86株真菌，其中藏青2000分離得到25株真菌，藏青320分離得到26株真菌，藏青85分離得到23株真菌，喜拉22分離得到12株真菌。通過形態(tài)學(xué)初步鑒定后選取34株真菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，真菌ITS區(qū)測序結(jié)果表明：34株真菌分屬于13屬19種，分別為鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、微座孢屬(Microdochium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、青霉屬(Penicillium)、毛殼菌屬(Chaetomium)、附球霉屬(Epicoccum)、單端孢霉屬(Trichothecium)、根霉屬(Rhizopus)、射脈菌屬(Phlebia)、節(jié)菱孢屬(Arthrinium)和毛霉屬(Mucor)；同時有代表編號為22-1的菌株同源性僅為89 %，可能是一類真菌新種(表1)。青稞籽粒寄藏真菌物種多樣性較為豐富，但不同品種青稞籽粒中寄藏真菌種屬存在較大差異。

2.2 寄藏真菌對青稞籽粒的致病性分析

對經(jīng)過鑒定的20種寄藏真菌進(jìn)行青稞種子發(fā)芽率、褐變率和腐爛率等致病性分析表明：根霉屬真菌(Rhizopussp. 2000-4)、鐮刀屬真菌(Fusariumsp. 2000-5)、赤霉屬真菌(Gibberellasp. 2000-7)、附球霉屬真菌(Epicoccumsp.320-9)、曲霉屬(Aspergillussp. 85-7)和未知屬真菌(Endophytic fungi 22-1)等6類真菌能夠顯著降低青稞種子的發(fā)芽率，同時可引起種子褐變及腐爛，是青稞籽粒中的主要致病真菌類型，其中根霉屬真菌(Rhizopussp. 2000-4)可導(dǎo)致所有供試青稞主籽粒幾乎不萌發(fā)、籽粒褐變率達(dá)到70 %～80 %、腐爛率高達(dá)95 %以上，有待對根霉屬真菌(Rhizopussp. 2000-4)進(jìn)行更深入的研究(表2)。青稞籽粒中6種主要致病真菌有4種分離自藏青2000，有4種分離自藏青320，有1種分離自藏青85，有2種分離自喜拉22，其中根霉屬真菌(Rhizopussp. 2000-4)分離自藏青2000和藏青320，藏青2000是由藏青320與拉薩白青稞雜交的F1代和喜拉19與昆侖164雜交的F1代復(fù)合雜交選育的[11]，可能寄藏真菌在青稞籽粒中有一定的種傳性。藏青2000和藏青320作為西藏推廣面積較大的青稞品種，關(guān)系著西藏的糧食安全及人民的身體健康，然而其籽粒中寄藏真菌種類較多、致病性較強(qiáng)，同時還具有一定的種傳性，嚴(yán)重影響西藏地區(qū)的青稞質(zhì)量安全，對藏青2000和藏青320籽粒中的寄藏真菌有待進(jìn)一步加強(qiáng)防控措施研究。

表1 青稞籽粒中寄藏真菌的初步鑒定

表2 寄藏真菌對青稞籽粒發(fā)芽率、褐變率和腐爛率的影響

續(xù)表2 Continued table 2

菌株編號發(fā)芽率(%)褐變率(%)腐爛率(%)藏青2000藏青320藏青85喜拉22藏青2000藏青320藏青85喜拉22藏青2000藏青320藏青85喜拉2285-495.095.090.095.05.05.05.05.00.00.00.050.085-5100.085.090.095.00.050.050.00.050.00.00.00.085-6100.095.085.095.00.00.00.050.00.00.10.50.185-710.035.035.030.05.010.015.010.015.010.012.512.522-145.035.070.065.00.00.00.00.010.015.015.010.022-590.090.085.090.00.050.050.10.10.00.00.00.022-895.097.597.595.05.010.010.05.07.57.55.05.0

3 討 論

青稞是西藏地區(qū)的重要糧食作物，青稞的產(chǎn)量和品質(zhì)直接關(guān)系著西藏地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會穩(wěn)定。西藏地區(qū)傳統(tǒng)的青稞收獲方式使青稞從收割到入庫儲藏可在田間持續(xù)露曬一個多月，而西藏大部分產(chǎn)糧區(qū)溫度在10～27 ℃，非常容易導(dǎo)致病菌滋生。寄藏真菌容易導(dǎo)致青稞籽粒發(fā)生褐變，嚴(yán)重的可降低種子發(fā)芽率及產(chǎn)生真菌毒素，危害人畜安全。本文研究表明拉薩市尼木縣4個品種的青稞籽粒中寄藏真菌物種多樣性較為豐富，但不同品種青稞籽粒中寄藏真菌種屬存在較大差異，同時與內(nèi)地傳統(tǒng)麥類作物籽粒以Aspergillus、Penicillium、Alternaria和Fusarium等為主的優(yōu)勢菌群相比有一定差異[12-13]，這可能與青稞高寒生長環(huán)境及較長的生長周期有關(guān)。目前，有關(guān)青稞內(nèi)生真菌的研究較少，龔弘強(qiáng)等從西藏地區(qū)青稞籽粒中分離得到燕麥鐮孢(Fusariumavenaceum)，該菌產(chǎn)生的毒素可引起癌癥、大骨節(jié)病 、克山病等人類疾病，需要重點(diǎn)研究與防控。本文也從藏青2000和喜拉22 2個青稞品種中分離得到鐮刀屬真菌(Fusariumsp.)，同時對該屬真菌的致病性研究表明其對青稞種子具有較強(qiáng)的致病性，針對該屬真菌的致病機(jī)理及其防控措施有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

青稞褐變籽粒中存在較高的真菌多樣性，根霉屬真菌(Rhizopussp. 2000-4)、鐮刀屬真菌(Fusariumsp. 2000-5)、赤霉屬真菌(Gibberellasp. 2000-7)、附球霉屬真菌(Epicoccumsp. 320-9)、曲霉屬(Aspergillussp.85-7)和未知種屬真菌(Endophytic fungi 22-1)等6類真菌是青稞褐變籽粒中寄藏的主要致病真菌類型。

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Seed-borneFungiDiversityofBrowningHullessbarleyandItsPathogenicityAnalysis

PAN Hu， Da-wa Zhuoma， CI Dun， WANG Qiu-ling， LI Ying， BAI Jun-ping

(Institute of Agricultural Product Quality Standard and Testing Research, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Tibet Lhasa 850032,China)

【Objective】The pathogenicity of seed-borne funji isolated from browning hullessbarley were studied. 【Method】The seed-borne fungi were isolated from Zangqing No.2000, Zangqing No.320, Zangqing No.85 and Xila 22 using plate separation method. Meamwhile, the spore suspensions of the isolated fungi were inoculated to the hullessbarley seeds in order to find out the pathogenicity. 【Result】86 isolated fungi strains were belong to 13 genera 19 species, while the strain named 22-1 with only 89 % homology may be was a new genera of fungi.Rhizopussp. 2000-4,Fusariumsp. 2000-5,Gibberellasp. 2000-7,Epicoccumsp. 320-9,Aspergillussp. 85-7 and Endophytic fungi 22-1 were the main pathogenic fungi which can significantly reduced the genmination rate of hullessbarley seeds, caused seeds browning and decay.【Conclusion】There are many kinds of pathogenic ability seed-borne funji existed in the Browning Hullessbarley.

Seed-borne fungi; Browning; Zangqing No.2000; Zangqing No.320 ; Zangqing No.85 ;Xila No.22

1001-4829(2017)5-1078-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.016

2016-06-23

西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金(14-35)

潘 虎(1986-)，男，陜西漢中人，碩士，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究工作，Tel：0981-6863726，E-mail：ph2032007@126.com。

S435.123

A

(責(zé)任編輯 李 潔)