白蘭花萜類合成酶基因McHMGR保守區(qū)的克隆及其表達分析

林　浥，俞　瀅，陳　丹，陳　靜，姚雪倩，陳桂信，葉乃興（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/福州茉莉花茶科技與全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)聯(lián)合研究中心，福建福州 350002）

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白蘭花萜類合成酶基因McHMGR保守區(qū)的克隆及其表達分析

林浥，俞瀅，陳丹，陳靜，姚雪倩，陳桂信，葉乃興*
（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/福州茉莉花茶科技與全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)聯(lián)合研究中心，福建福州 350002）

以白蘭（Michelia alba DC.）花瓣為材料，采用RT-PCR方法，克隆得到白蘭花萜類代謝途徑中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（McHMGR）的保守區(qū)，該cDNA保守區(qū)長為421bp，編碼128個氨基酸。序列分析結(jié)果表明，該基因編碼的氨基酸序列與同屬植物樂昌含笑的HMGR具有99%的同源性。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測McHMGR在白蘭開花過程中四個時期的的表達量變化，結(jié)果表明，表達量在盛花期最高，花芽期最低。

白蘭；香氣；3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶；實時熒光定量PCR

白蘭（Michelia alba DC.）屬木蘭科（Magnoliaceae）含笑屬（Miche原lia L.）常綠喬木，別稱白玉蘭、白蘭花、白緬花、緬桂花，其花香濃郁持久。白蘭花是茶用香花，可用于窨制白蘭花茶，也可以作為配料加工茉莉花茶，以加重底香、增強鮮靈度［1］。前人已對白蘭花香氣成分進行了研究，表明白蘭花揮發(fā)性成分中含量較高的有芳樟醇、甲基異丁子香酚、順-羅勒烯、9，12，15-三烯十八醇、亞油酸甲醋、苯乙醇等化合物［2］，其中主要為萜類物質(zhì)，目前已從白蘭花中共鑒定出31種萜類化合物［3］。白蘭花具有止咳、化濁等藥理功能，這可能與芳樟醇抗菌等功能有關(guān)［4］。萜類代謝途徑包括甲羥戊酸途徑（MVA）和2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（MEP）。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）是甲羥戊酸途徑中第一個限速酶，對于白蘭花香氣物質(zhì)的形成具有重要的作用［5］。已在巴西橡膠、馬鈴薯、鐵皮石斛、茶樹、茉莉花等植物中分離得到HMGR基因［6-10］。

目前從分子生物學(xué)角度對白蘭花香氣形成機理的研究尚未見報道，本研究采用RT-PCR技術(shù)成功克隆得到白蘭花香氣形成的萜類代謝途徑上HMGR基因的保守區(qū)序列，命名為McHMGR，并采用實時熒光定量PCR技術(shù)分析McHMGR在白蘭花不同開放時期的相對表達量變化。擬通過本研究，為McHMGR基因全長cDNA的獲得及其功能驗證奠定基礎(chǔ)，闡明白蘭花香氣形成的分子機制，以期為生產(chǎn)上白蘭花茶的窨制和白蘭花打底窨制茉莉花茶時間的合理運用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

本實驗以白蘭花花瓣為供試材料，取自福建農(nóng)林大學(xué)主干道旁白蘭樹。于2015年7月下旬起，根據(jù)花被片張開程度將分4個發(fā)育時期（花芽期：花蕾綠色，苞片未張開；大花蕾期：花蕾白色，苞片已脫落，花瓣與花柱夾角呈0°；初花期：花被片微微張開，花瓣與花柱夾角呈30°；盛花期：白蘭花全面盛開，花瓣與花柱夾角呈90°，花被片遇觸碰脫落）采摘花瓣，稱取0.1g，用錫箔紙包裹后放入液氮速凍，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2白蘭花花瓣總RNA的提取

采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取白蘭花總RNA，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。

1.3McHMGR保守區(qū)的克隆

參照鄭鴻昌［11］合成和純化cDNA第一鏈。從GenBank下載已登錄的不同植物的HMGR基因序列，根據(jù)已報道的人參（Panax ginseng）、荔枝（Litchi chinensis）、茉莉花（Jasminum sambac（L.）Ait）等植物的HMGR基因序列，使用primer primer5軟件根據(jù)比對序列的保守區(qū)設(shè)計引物McHMGR-F、McHMGR-R（表1）。PCR擴增采用TransTaq DNA Polymerase HiFi Fidelity（北京全式金生物技術(shù)有限公司）體系，參照試劑盒說明書；程序為95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物純化回收參照TIANgel Midi Purification Kit試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說明書進行，連接克隆載體pMD18-T，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行驗證，測序（上海鉑尚生物技術(shù)有限公司）。

表1　引物序列

1.4McHMGR保守區(qū)的生物信息學(xué)分析

利用BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行氨基酸序列同源性比對；利用MEGA5.2軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹。

1.5McHMGR實時熒光定量PCR表達分析

分別提取處于花芽期、大花蕾期、初花期、盛花期四個時期的白蘭花瓣總RNA，按照TransScript Reverse Transcriptase試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）說明書合成白蘭花第一鏈cDNA。根據(jù)McHMGR保守區(qū)序列設(shè)計熒光定量 PCR引物McHMGR-RT-F，McHMGR-RT-R（表1），以白蘭花18s-rRNA基因為內(nèi)參，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，采用GoTaq? qPCR Master Mix（北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司）進行McHMGR熒光定量PCR分析（BIO-RAD icycler realtime quantity PCR儀）。試驗數(shù)據(jù)釆用2-△△Ct法進行定量分析。

2　結(jié)果與分析

2.1McHMGR保守區(qū)序列的克隆以及生物信息學(xué)分析

通過RT-PCR技術(shù)獲得白蘭花HMGR基因的保守區(qū)序列，該序列長為421bp，編碼128個氨基酸。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對，結(jié)果表明，該序列推導(dǎo)出該基因編碼的氨基酸序列與樂昌含笑（Michelia chapensis）相似性達99%，與野生大豆（G.sija Sleb.et Zucc.）、魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）、小羊蒜（Paris fargesii）相似性分別為91%、89%、88%。初步判斷該序列為白蘭花HMGR基因的保守區(qū)片段，將該基因命名為McHMGR。

利用MEGA5.2軟件對McHMGR氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖1），構(gòu)建方法為鄰近連接法（Neighbor-Joining，NJ）。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，所獲得到的McHMGR與同為木蘭科含笑屬樂昌含笑（Michelia chapensis）的HMGR基因?qū)儆谕环种ВM一步確定該序列為白蘭花的HMGR基因片段。

2.2McHMGR實時熒光定量PCR表達分析

采用實時熒光定量PCR技術(shù)，以白蘭花的18s-rRNA為內(nèi)參基因檢測McHMGR在白蘭花發(fā)育4個時期的表達量變化情況。結(jié)果表明（圖1），該基因在花芽期表達量最低，隨著白蘭花的開放程度的增加呈上調(diào)趨勢，在大花蕾期間表達量迅速上調(diào)，盛花期時達到最高水平。

圖1　McHMGR核酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2　McHMGR氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進化樹

圖3　白蘭花開放過程中McHMGR基因表達分析

3　討論

植物花朵的香氣成分是一類具有較低分子量的揮發(fā)性分子，主要由萜類、苯類/苯丙素類、脂肪酸衍生物和一些含氮或硫化合物等組成［12，13］。植物類異戊二烯包括單萜、倍半萜、二萜等，是一組結(jié)構(gòu)迥異的化合物家族［14］。HMGR是MAV途徑中第一個關(guān)鍵限速酶。本實驗從白蘭花花瓣中克隆得到McHMGR保守區(qū)cDNA 421bp，編碼128個氨基酸。McHMGR推導(dǎo)出的氨基酸序列與其同屬植物樂昌含笑（Michelia chapensis）的相似度最高，達99%，與野生大豆（G.sija Sleb. et Zucc.）、魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）、小羊蒜（Paris fargesii）相似性分別為91%、89%、88%。初步判定其為白蘭花的HMGR基因。通過系統(tǒng)進化樹分析表明，其與同屬的植物樂昌含笑的HMGR屬于同一分支，進一步證明該片段為白蘭花HMGR基因的片段。

萜類物質(zhì)的代謝和植物的生長發(fā)育以及形態(tài)發(fā)生存在一定的相關(guān)性。陳大華認(rèn)為，特異的HMGR編碼基因成員的表達參與花的發(fā)育［15］。白蘭花為“體質(zhì)花”，在開花前就已經(jīng)積累了大量的香氣前體物質(zhì)，在整個開放過程中香氣含量都很高且變化幅度很?。?6］，本實驗通過實時熒光定量PCR技術(shù)對McHMGR基因在白蘭花開放過程中的相對表達量動態(tài)進行分析，結(jié)果表明，該基因在花芽期表達量最低，盛花期表達量達到最高，隨著白蘭花的開放程度總體呈上調(diào)趨勢，但花芽期與大花蕾期間上調(diào)最快，大花蕾期與初花期間基因表達量趨于穩(wěn)定，初花期與盛花期間上調(diào)幅度較小。這與前人的研究結(jié)果一致，證明白蘭花開放的過程中香氣的釋放和McHMGR表達量存在一定程度的關(guān)聯(lián)。McHMGR的基因表達特異性為白蘭花窨茶或打底熏制茉莉花茶不用“養(yǎng)花”提供了分子機制研究依據(jù)。郭素枝［17，18］等研究表明，白蘭花初花期香氣成分含量最高；而熒光定量結(jié)果顯示，McHMGR在盛花期相對表達量最高，在大花蕾期之后持續(xù)高表達，這可能與下游的調(diào)控基因萜類合成酶基因的表達量有關(guān)，需進一步研究。

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葉乃興（1963-），男，教授，主要從事茶學(xué)與茉莉資源利用研究。E-mail：ynxtea@126.com。

福建省自然科學(xué)基金（2016J01110）；福州市科技計劃項目（2015-PT-93）

林浥（1996-），女，本科生，主要從事茶樹遺傳育種與生物技術(shù)研究。