6株高產油微擬球藻的中試培養(yǎng)評價研究?

朱葆華，石紅萍，孫發(fā)強，韓吉昌，楊官品，潘克厚，3??

(中國海洋大學 1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，2.海洋生命學院，3.青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266003)

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6株高產油微擬球藻的中試培養(yǎng)評價研究?

朱葆華1，石紅萍1，孫發(fā)強1，韓吉昌1，楊官品2，潘克厚1，3??

(中國海洋大學 1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，2.海洋生命學院，3.青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266003)

摘要：用50 L密閉式吊袋光生物反應器，采用連續(xù)培養(yǎng)模式，對6株微擬球藻(Nannochloropsis oceanica)進行產油性能的中試篩選。從藻種的比生長速率、總脂含量、油脂產率，甘油三酯(TAG)含量和脂肪酸組成等方面評價藻種的產油性能。經(jīng)過10d的連續(xù)培養(yǎng)，篩選到2株生長速率快、油脂產率高的優(yōu)良能源微藻藻株：3-25和75B1，它們的總脂含量分別達到細胞干重的33.49%和29.36%；油脂產率分別為10.04和8.07mg·(L·d)-1；它們的C16與C18之和分別占到了總脂肪酸含量的72.71%和68.05%，且以飽和脂肪酸C16∶0及單不飽和脂肪酸C16∶1為主，適合生物柴油的生產。盡管藻株4-38的油脂產率較低，但其甘油三酯含量較高，C16和C18之和高達76.32%，其脂肪酸組成也非常適合生物柴油的生產。研究結果表明，3-25、75B1和4-38這3株微擬球藻有望作為生產生物柴油的候選藻株。

關鍵詞：生物柴油； 微擬球藻； 連續(xù)培養(yǎng)； 中試規(guī)模

引用格式：朱葆華，石紅萍，孫發(fā)強，等. 6株高產油微擬球藻的中試培養(yǎng)評價研究[J].中國海洋大學學報(自然科學版)，2016, 46(7)： 15-20.

ZHU Bao-Hua , SHI Hong-Ping, SUN Fa-Qiang，et al. Evaluation of sixN.oceanicastrains with high oil productivity in pilot scale [J].Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(7)： 15-20.

石化燃料的過度開采和使用導致能源危機加劇，尋找一種新型、可持續(xù)的綠色清潔能源已成為當今社會關注的焦點。生物柴油作為一種可再生、綠色環(huán)保的清潔能源已成為世界各國能源研究的熱點。

生產生物柴油的油脂大多來自植物油脂，在所有的油料作物中，微藻相對于傳統(tǒng)的油料作物具有明顯的優(yōu)勢，已成為第三代生物柴油生產的理想原料[1-2]。到目前為止，微藻生物柴油盡管已經(jīng)有幾十年的研究歷史[3]，但實現(xiàn)商業(yè)化生產還需要進行很大的努力，而微藻大規(guī)模培養(yǎng)高昂的成本是主要的瓶頸之一[4-6]。因此，生長速率快、抗逆性強、油脂產率高的優(yōu)良能源微藻藻種的篩選成為提高生物柴油產量、降低生產成本的重要突破點之一。

微擬球藻(Nannochloropsis.sp)屬大眼藻綱、微擬球藻屬，是一類球形或近似球形的單細胞真核生物，其細胞小(通常2～4μm)，形態(tài)簡單，具有很高的光合作用效率、生物量和總脂含量；它的脂肪酸組成主要以C16，C18和C20為主[7]，是生產生物柴油的理想原料，被公認為最具潛力進行商業(yè)化生產生物柴油的藻種之一[8]。

本研究采用一種封閉、連續(xù)培養(yǎng)方式的吊袋式反應器對6株誘變海洋微擬球藻(Nanochloropsisoceanica)進行中試培養(yǎng)，通過分析總脂含量、油脂產率、中性脂以及脂肪酸組成對它們進行篩選評價，為進一步進行大規(guī)模培養(yǎng)并獲得可規(guī)模化培養(yǎng)的優(yōu)良能源微藻藻株提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 藻種

6株微擬球藻(Nanochloropsisoceanica)來自中國海洋大學水產學院應用微藻生物學實驗室，KA2以精喹禾靈(Quizalofop-p-ethyl)作為篩選壓篩選獲得[9]，4-5、4-38、3-25、3-26、75B1通過甲基磺酸乙酯(Ethyl-methylsulfone, EMS)誘變，再通過平板涂布獲得單克隆藻株，在實驗室內證明這些藻株具有較大的比生長速率和較高的油脂產率。

1.2 微藻培養(yǎng)

中試培養(yǎng)篩選驗證在青島市中國海洋大學鰲山衛(wèi)實驗基地進行，中試培養(yǎng)時間為2014年10月8—17日，采用50 L的吊袋式反應器進行，工作原理如圖1所示：

(a：消毒海水和營養(yǎng)鹽注入口 Disinfection water and nutrient sprue;b：藻液流出口 Algal flow export;；c：通氣入口 Air inlet; d：藻液接種口和取樣口 Fluid of algal inoculation and sampling; e：蠕動泵 Peristaltic pump; f：培養(yǎng)基 Culture medium; g：營養(yǎng)液加入和藻液排出通道 Nutrient solution to join and algal liquid discharge channels; h：藻液收集缸 Algae fluid collection cylinder; i：砂濾器 Sand filter；j：海水高溫滅菌設備 Water high temperature sterilization equipment; m：鼓風機 Air blower.)

圖1吊袋式反應器簡圖

Fig.1Diagram of reactor with punching bag

通過加料口(a)每天將10 L新鮮培養(yǎng)液24h持續(xù)不斷的以恒定流速注入到反應器中，新鮮培養(yǎng)液由培養(yǎng)基(f)和經(jīng)過滅菌的海水按一定比例混合而成，海水先經(jīng)沙濾裝置(i)過濾后再經(jīng)海水高溫滅菌裝置(j)滅菌才進入到反應器內。反應器上端還有另一出口(b)，當培養(yǎng)的藻液液面達到(b)口時，每天有10 L藻液進入藻液收集缸(h)。反應器下端有通氣孔(c)和取樣孔兼接種口(d)，通氣孔處裝有氣體流量調節(jié)器，調節(jié)進入到反應器中的氣體流量(氣體流量為1000mL/min)，通入反應器的氣體經(jīng)紫外線殺菌后由鼓風機(m)提供。培養(yǎng)體系為一個密閉系統(tǒng)，保證培養(yǎng)過程始終處于無污染的狀態(tài)。

反應器吊袋為透明強力聚乙烯薄膜，具有耐高壓和韌度強等優(yōu)點，接種時控制藻種密度為1.7×107cell/mL、體積10L。培養(yǎng)條件，溫度(24±3)℃，光強(20～131)μmol·m-2·s-1全光照培養(yǎng)(白天為自然光，晚上采用人工光源)，每株微擬球藻設置3個平行。培養(yǎng)過程中，每天定時測定培養(yǎng)液的pH。

培養(yǎng)10d后，每個平行取2000mL 藻液，7000r/min、5min離心(Ependorf , Germany)收集，沉淀用50mL蒸餾水重懸洗鹽2次(離心條件同上)，通過真空冷凍干燥得到藻粉(稱重獲得生物量干重)，用于總脂、脂肪酸分析。

1.3 比生長速率測定

比生長速率通過公式u=(lnx2-lnx1)/(t2-t1)進行計算[10]。式中：u為比生長速率(d-1)；x1和x2分別為開始和結束時反應器中總細胞數(shù)量；t1和t2分別為培養(yǎng)開始和結束的時間。

1.4 總脂含量和油脂產率

總脂測量參考Bligh and Dyer[11]的方法，稱取50mg藻粉于干燥試管中，依次加入2mL 氯仿(CHCl3)和1mL 甲醇(CH3OH)，震蕩15min，5000r/min 離心10min，將提取液轉到新試管；重復上述操作，合并2次提取液，加入0.9%生理鹽水1.2mL，振蕩，靜置15min，吸取提取液中的氯仿層于預先稱重的新試管中，水浴鍋蒸干氯仿層稱重，計算總脂含量。

油脂產率計算公式：P=1 000C·B/D。式中：P表示每升藻液每天積累油脂的含量(mg·L-1·d-1)；C是藻細胞積累的油脂含量占藻粉干重的百分比(% of DW)；B表示微藻培養(yǎng)過程中的干重(g/L)，D表示培養(yǎng)時間(d)[12]。

1.5 甘油三酯(TAG)分析

甘油三酯分析采用薄層層析法[13-14]進行。上樣量為3μL，展層劑為正己烷∶乙醚∶甲酸體積比為70∶30∶1(v/ v/ v)。展層后將層析板置于通風櫥內吹干, 然后置于含有碘顆粒的燒杯中，37℃恒溫顯色5～10min，三酰甘油標準品為美國Sigma 產品(Glyceryl trioleate T7140-500MG)。

1.6 脂肪酸組成分析

脂肪酸組成采用氣相色譜法[15]。稱取15mg 藻粉至干燥試管中，加入 2mol/L的氫氧化鉀-甲醇(KOH-CH3OH)溶液2mL，充分混勻, 75℃水浴30min , 冷卻至室溫后加入3mol/L 鹽酸-甲醇(HCl-CH3OH)溶液2mL，振蕩1min，75℃水浴30min ,冷卻至室溫，加入正己烷(C6H14)0.1mL及少量蒸餾水促進分層, 充分振蕩, 離心后取正己烷層，上樣1μL進行氣相色譜分析。

氣相分析采用外標法，進樣量1μL，脂肪酸標準品為Sigma 公司產品(Supelco 37, USA)。儀器型號為HP 5890II，氫火焰離子化檢測器，毛細管柱型號為007-CW。程序升溫: 150℃保持1min，以15℃/min 升至200 ℃，再以2℃/min 升至250℃；汽化室溫度270℃；檢測器溫度270℃；載氣為高純氮氣，流速1.5mL/min。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Spss 20(美國IBM公司)進行單因素方差分析(LSD，Duncan)，并進行多重比較，顯著性水平為P<0.05；采用Microsoft office 2007的Excel繪圖。

2　結果與分析

2.1 比生長速率和生物量

培養(yǎng)過程中6株藻一直以平均0.2d-1的比生長速率迅速生長。藻株3-26的比生長速率為0.18d-1顯著小于其他5株(P<0.05)，4-38、3-25和75B1的比生長速率均為0.19d-1，3-5和KA2的比生長速率達到0.21d-1是6株藻中最大的(見表1)。

6株藻收獲時的生物量如表1所示，生物量分別為241、234、239、192、217和224mg/L，3-26的生物量顯著低于其他5個藻株(P<0.05)，其他5株藻之間生物量差異不顯著(P>0.05)，6株藻的生長趨勢與生物量的增加趨勢基本一致。

表1　6株微擬球藻的比生長速率、細胞密度、生物量、總脂含量和油脂產率

注：a、b、c、d、e分別表示方差分析差異程度，同一列中有相同字母的組之間差異不顯著(P>0.05)。

Note：Values in the same row with the same supersxripts are not significantly different(P>0.05).

2.2 總脂和油脂產率

總脂含量和油脂產率是衡量一株藻產油能力的重要指標。由表1可以看出，6株藻收獲時的總脂含量和油脂產率，藻株3-25的總脂含量和油脂產率分別達到33.49%和10.04mg·(L·d)-1，顯著高于其他5個藻株，是6株藻中最高的；75B1的總脂含量和油脂產率僅次于3-25，顯著高于其他4個藻株；4-38的總脂含量在6株藻中最低，其油脂產率僅高于3-26。

2.3 甘油三酯(TAG)分析

6株微擬球藻總脂中的甘油三酯(TAG)通過薄層層析法進行分析。由圖2可以看出，藻株4-38的甘油三酯(TAG)含量最高，75B1次之，3-5含量最少，而其他3株藻(3-25、3-26和KA2)的含量相當。

圖2　6株微擬球藻的薄層層析圖譜

2.4 6株微擬球藻脂肪酸分析結果

由表2可以看出，6株藻的主要脂肪酸組成為C16、C18和C20，其中C16 (C16∶0 和C16∶1)占到了總脂肪酸的56%以上，C16和C18之和占到了總脂肪酸含量的65.92%以上。藻株4-38的C16和C18之和高達76.32%，其次為藻株3-25，達到了72.18%；3-26、KA2和75B1三株藻的C16和C18之和沒有顯著差異，但75B1的C20∶5(EPA)含量最高，占總脂肪酸含量的22.39%。

3　討論

本實驗采用連續(xù)培養(yǎng)模式，相比批次培養(yǎng)模式具有如下優(yōu)點：結果可靠、可重復性強，生長速率和生物量可通過改變稀釋比例進行調節(jié)控制，并且可長期維持在較高水平[16]。連續(xù)式培養(yǎng)模式以一定的流速連續(xù)向培養(yǎng)系統(tǒng)內添加新鮮培養(yǎng)液，同時以相同的流速從培養(yǎng)體系中放出藻液，藻細胞的生長速度、代謝水平處于相對恒定的狀態(tài)，能夠穩(wěn)定、快速培養(yǎng)微藻產生相應的代謝產物[17-18]。

微藻細胞的油脂積累主要在指數(shù)生長期末期，生長速率越快，油脂積累越緩慢。在連續(xù)培養(yǎng)模式下，由于藻細胞始終處于指數(shù)生長狀態(tài)，油脂積累與實驗室理性狀態(tài)(6株藻的總脂含量在30.3%～34.6 %之間)相比有一定差距，所研究的6個藻株總脂含量仍達到了22.31%～33.49%(見表1)，相信通過改變培養(yǎng)模式，比如開放跑道池大規(guī)模培養(yǎng)，由于光照和溫度等條件的改變，最重要的是，在跑道池中培養(yǎng)，藻細胞可在一定時間內達到指數(shù)生長末期，它們的總脂含量一定會有所升高的。

表2　6株誘變微擬球藻的脂肪酸組成(占總脂肪酸的百分比)

注：a、b、c、d、e表示方差分析差異程度，同一行中有相同字母的組之間差異不顯著(P>0.05)。

Note：Values in the same row with the same superscrpts are not significantly different(P>0.05).

油脂產率是微藻培養(yǎng)過程中油脂產生數(shù)量的量度，用單位時間單位體積產生油脂的多少表示。由表1可以看出，藻株3-25的油脂產率為10.04mg·(L·d)-1，顯著高于其他5個藻株，其次為75B1，但這與實驗室通過柱狀反應器所得數(shù)據(jù)(藻株3-25的油脂產率為16.63mg·(L·d)-1相比仍有較大差距。一方面藻細胞始終處于指數(shù)生長狀態(tài)，不利于油脂積累，藻液不斷流出也不利于生物量的增加；另一方面，本實驗中，盡管晚上采用人工光源，一定程度上減少了呼吸作用對生物量的消耗，但白天采用自然光源，相對光照強度較低(20～131μmol·m-2·s-1)，仍是導致油脂產率較低的主要原因[19]。另外，氮限制、高鹽脅迫等[20-21]有利于油脂積累，在后續(xù)大規(guī)模培養(yǎng)過程中，可考慮在指數(shù)生長末期對藻細胞進行一定的脅迫，從而提高油脂產率[22-23]。

生物柴油是脂肪酸烷基酯的混合物，主要以甘油三酯(TAG)為底物通過酯交換反應(Transesterification)生成[24]。用于生產生物柴油的優(yōu)良藻株，不僅要有高的油脂產率，具有較高的中性脂含量(主要是甘油三酯，TAG)和適宜的脂肪酸組成也尤為重要。由圖2可以看出，藻株4-38的TAG含量最高，其次為75B1，3-5含量最少，而其他3株藻(3-25、3-26和KA2)的含量相當。

微藻的脂肪酸組成是衡量生物柴油質量的一個重要指標[25]，對生物柴油的燃燒性能產生重要影響[26]。另外，生物柴油的濁點僅由飽和脂肪酸的數(shù)量決定[27]，而低溫流動性則取決于不飽和脂肪酸。C16與C18含量之和(占總脂肪酸的百分含量)已經(jīng)被用來評價生物柴油的產率[28]。由表2可以看出，6株藻的C16與C18之和占到了總脂肪酸含量的65.92%以上，藻株4-38則高達76.32%，且主要以飽和脂肪酸(C16∶0) 與單不飽和脂肪酸(C16∶1)為主，其脂肪酸組成非常適合生物柴油的生產[29-30]。

結合油脂產率、中性脂和脂肪酸組成分析，3-25、75B1具有較好的生產生物柴油的潛力，

雖然4-38的油脂產率較低，但由于較高的甘油三酯含量以及優(yōu)良的、適合生產生物柴油的脂肪酸組成，有望在后續(xù)規(guī)?；囵B(yǎng)中通過改變培養(yǎng)條件大幅提高其油脂產率。另外，75B1的C20∶5(EPA)含量最高，占總脂肪酸含量的22.39%，還可以作為生產EPA的優(yōu)良藻株。

致謝：本實驗在青島即墨中國海洋大學鰲山衛(wèi)基地完成，對赫勇老師在實驗初期給予的大力幫助表示衷心感謝。

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責任編輯朱寶象

基金項目：? 國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目(2011CB200901；2011CB200904)；國家自然科學基金項目(31372518)資助

收稿日期：2015-04-08 ；

修訂日期：2015-05-29

作者簡介：朱葆華(1971-)，男，副教授，主要從事微藻生理、生化與分子生物學方面的研究。E-mail：zhubaohua@ouc.edu.cn ??通訊作者：E-mail：qdkhpan@126.com

中圖法分類號：Q948.12

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)07-015-06

DOI:10.16441/j.cnki.hdxb.20150136

Evaluation of SixN.oceanicaStrains with High Oil Productivity in Pilot Scale

ZHU Bao-Hua1, SHI Hong-Ping1, SUN Fa-Qiang1, HAN Ji-Chang1,YANG Guan-Pin2, PAN Ke-Hou1,3

(Ocean University of China, 1. The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education; 2. College of Marine Life Sciences; 3.Laboratory for Marine Fisheries and Aquaculture, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Qingdao 266003, China)

Abstract:Renewable energy as microalgal biodiesel has raised broad interest; it is characterized by higher lipid productivity per ground area than oleaginous agricultural crops and does not compete for arable land or bio-diversifies natural landscapes. Unfortunately, a great deal of developments must occur before such product reaches the marketplace. One of the key bottlenecks is the high cost of microalgal cultivation. For the successful commercialization of microalgae-based fuels, it is crucial to minimize culture cost and breed oil-rich microalgae. Therefore, it is imperative that the strain selected for large-scale cultivation produces the appropriate lipids suitable for biodiesel production in pilot scale. Selection criteria should be based on a number of factors including growth rate, lipid quantity and quality, strong adaptability to the change in environment and determination of preferred nutrients and nutrient uptake rate. Nannochloropsis have proved to be suitable as raw materials for commercial production due to their high biomass and oil content. In this study, six Nannochloropsis oceanica strains were screened for their oil productivity by continuous cultivation mode in pilot scale with 50 L inclosed punching bag - light bioreactors. Oil-producing characteri-stics were evaluated from several aspects such as specific growth rate, content of total lipids, oil productivity, triglyceride content and fatty acid composition. Two excellent strains (3-25 and 75B1) with rapid growth and high oil productivity were obtained by continuous cultivation for ten days. The content of total lipids and oil productivity of the two strains were 33.49% and 29.36%, and 10.04mg·L-1·d-1and 8.07mg·L-1·d-1, respectively. The C16 and C18 series contents of the two algal strains accounted for 72.71% to 68.05%, respectively, and were found to consist largely of the saturated fatty acid (SAFA) palmitic acid (C16∶0) and the monounsaturated fatty acid (MUFA) palmitoleic acid (C16∶1), which are ideal for biodiesel production. Strain 4-38 performed better than the other five; it contained higher amount of triacylglycerols and fatty acids (the C16 and C18 series contents reach up to 76.32%), which are used for biodiesel production. Our results showed that three strains among six are perspective to be used for biodiesel production, which will provide scientific basis for further cultivation and obtain excellent strains suitable for large scale culture to produce biodiesel.

Key words:biodiesel production; Nannochloropsis oceanica; continuous cultivation mode; pilot scale production

Supported by Major State Basic Research Development Program of China(2011CB200901；2011CB200904)； National Natural Science Foundation of China(31372518)