長梗秦艽酮對吉西他濱耐藥肺癌H1975細胞的抑制作用及其機制研究

張　毅，徐小嫚，張　萌，何　平*

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長梗秦艽酮對吉西他濱耐藥肺癌H1975細胞的抑制作用及其機制研究

張毅a，徐小嫚b，張萌a，何平a*

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院 a.干診科，b. 第一呼吸內科，沈陽 110004

[摘要]目的探討天然化合物長梗秦艽酮對吉西他濱耐藥肺腺癌細胞H1975增殖、凋亡的影響及其可能機制。方法采用MTT比色法檢測長梗秦艽酮對H1975細胞增殖的影響；采用AnnexinV/PI流式細胞儀雙染法檢測長梗秦艽酮誘導H1975細胞凋亡；通過熒光電子顯微鏡觀察長梗秦艽酮誘導凋亡的細胞核形態(tài)變化；通過Western blot研究長梗秦艽酮發(fā)揮抑癌作用的靶蛋白及機制。結果長梗秦艽酮顯著抑制肺癌細胞H1975的增殖，且呈現明顯時間劑量依賴性；長梗秦艽酮可以誘導細胞凋亡；長梗秦艽酮處理使細胞出現染色質邊集、核碎裂等典型的細胞凋亡改變；長梗秦艽酮處理使Bcl-2表達降低，Bax表達升高。結論長梗秦艽酮可以抑制H1975細胞增殖，通過對Bcl-2和Bax的調節(jié)誘導細胞凋亡，是一種潛在的天然抗腫瘤藥物。

[關鍵詞]長梗秦艽酮；肺癌；增殖；凋亡

0　引言

近年來，中藥抗腫瘤作用越來越受到關注，大量中藥復方及天然單體成分在實驗和臨床研究中被證實具有顯著的抗腫瘤作用。長梗秦艽，多年生草本，是龍膽科龍膽屬植物，主要分布于我國西藏東部和南部地區(qū)，作為中草藥曾長期用于治療風濕性關節(jié)炎及肝膽疾病。長梗秦艽酮(waltonitone)是從長梗秦艽中分離得到的一個五環(huán)三萜化合物。有研究表明，長梗秦艽酮能夠抑制肝癌細胞的增殖，同時促進肝癌細胞的凋亡[1]。與此結果類似，我們之前發(fā)現，長梗秦艽酮能抑制肺癌A549細胞的增殖并可促進其凋亡[2-3]，提示長梗秦艽酮是一種潛在的抗腫瘤藥物。本研究旨在探討長梗秦艽酮對吉西他濱耐藥的肺癌H1975細胞中潛在的抑癌作用及其機制。

1　材料與方法

1.1材料與試劑人肺癌NCI-H1975細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；長梗秦艽酮(waltonitone)：上海中藥標準化研究中心，用DMSO配制成100 mmol/L貯存液于-20 ℃保存；RPMI-l640培養(yǎng)基：美國賽默飛公司；胎牛血清：美國Hyclone公司；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒：江蘇凱基生物技術股份有限公司；二甲基亞楓(DMSO)：美國Sigma公司；胰蛋白酶：美國sigma公司；Hoechst33342：美國Sigma公司；AnnexinV/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒：江蘇凱基生物技術股份有限公司；流式細胞儀：美國BD公司；蛋白裂解液：美國賽默飛公司；Bcl-2抗體:CST公司；Bax抗體：CST公司；GAPDH抗體：美國santa cruz公司。

1.2細胞培養(yǎng)H1975細胞用含10%胎牛血清的RPMI-l640培養(yǎng)基在37 ℃，飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3MTT 法檢測細胞增殖消化收集對數生長期細胞，每孔加入100 μL約3×103個細胞于96 孔板中，細胞培養(yǎng)過夜。實驗組分別加入不同濃度長梗秦艽酮溶液(10、20、30 μmol/L)作用5 d。對照組加入等量的DMSO溶液。每實驗組設3 個重復孔。培養(yǎng)結束前每孔加20 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去上清，每孔加150 μL DMSO，振蕩混勻后酶標儀檢測(波長570 nm)每孔光密度值(OD值)。實驗重復3 次。增殖抑制率按如下公式計算：抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值×100%。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡H1975細胞以5×105/孔接種于6 孔板中培養(yǎng)過夜，分別加入終濃度為30 μmol/L的長梗秦艽酮溶液，并設空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，用不含EDTA的胰酶消化收獲細胞。4 ℃、1 500 轉/min 離心5 min，收集細胞，冷PBS洗滌離心細胞2 次。用500 μL 1×Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1×106/mL。在細胞懸浮液中加入5 μL AnnexinV-FITC輕輕混勻，再加入5 μL PI后輕輕混勻避光孵育15 min。在1 h內用流式細胞儀檢測。結果用Cellquest專業(yè)軟件獲取分析數據。實驗重復3 次。

1.5熒光顯微鏡觀察H1975細胞核形態(tài)將H1975細胞5×105/孔接種于6 孔板中培養(yǎng)過夜，每組設3 個復孔，加入30 μmol/L的長梗秦艽酮溶液繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。PBS清洗2次，吹干，固定液(甲醇：冰乙酸=3∶1)固定15 min，PBS清洗后加入Hoechst 33342(濃度為5 mg/L)熒光染料1 mL，37 ℃避光孵育15 min，應用熒光顯微鏡觀察、照相。實驗重復3 次。

1.6Western Blot實驗H1975細胞以5×105/孔接種于6 孔板中培養(yǎng)過夜，每組設3 個復孔，加入30 μmol/L的長梗秦艽酮溶液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用蛋白裂解液提取細胞中的總蛋白，并用Bradford方法對蛋白進行定量。40 μg總蛋白在10%的SDS-PAGE凝膠中電泳分離并轉印到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉對膜封閉2 h，然后用相應的一抗4 ℃孵育過夜(Bcl-2 1∶1 000；Bax 1∶1 000；GAPDH 1∶1 000)。對應的二抗在37 ℃條件下孵育2 h，在膜上滴加ECL發(fā)光液，通過BioImaging Systems (UVP,Upland,CA,USA)系統(tǒng)進行發(fā)光。

1.7統(tǒng)計學分析實驗數據結果用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)或兩組之間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1長梗秦艽酮抑制H1975細胞的體外增殖MTT實驗結果顯示，隨著藥物濃度的加大，長梗秦艽酮對H1975細胞增殖的抑制作用明顯增加；而且隨著作用時間的增加，長梗秦艽酮對H1975細胞增殖的抑制也增強(圖1)。這些結果提示我們，長梗秦艽酮能夠抑制H1975細胞的增殖，且具有劑量和時間依賴性。

圖1　長梗秦艽酮對H1975細胞增殖的抑制作用

2.2長梗秦艽酮誘導H1975細胞凋亡在H1975細胞中加入30 μmol/L的長梗秦艽酮分別作用24和48 h后，通過AnnexinV/PI流式細胞儀雙染法測細胞凋亡的變化。結果表明，與對照組相比，長梗秦艽酮處理能顯著增加H1975細胞的凋亡，且隨著作用時間的增加，早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例都有所增加，說明長梗秦艽酮能誘導肺癌H1975細胞的凋亡(圖2)。

2.3長梗秦艽酮引起細胞凋亡的形態(tài)學變化H1975細胞用30 μmol/L濃度的長梗秦艽酮溶液作用后，用Hoechst 33342染料對細胞核進行染色，在熒光顯微鏡下觀察顯示，與空白對照相比，長梗秦艽酮作用于H1975細胞24、48 h后，細胞形態(tài)變化明顯。隨著藥物濃度增大，細胞數量減少，細胞核形態(tài)變化顯著，呈現核碎裂、染色質邊集等細胞凋亡改變(圖3)。

2.4長梗秦艽酮調節(jié)凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達H1975細胞用30 μmol/L濃度的長梗秦艽酮溶液作用48 h后，提取細胞中的總蛋白進行Western blot實驗。我們篩查了與細胞增殖、凋亡相關的一系列蛋白表達的變化。結果發(fā)現，長梗秦艽酮能夠抑制Bcl-2蛋白的表達，同時增加Bax蛋白的表達。如圖4所示，長梗秦艽酮溶液作用后Bcl-2蛋白的表達顯著下降而Bax蛋白表達顯著上升，提示長梗秦艽酮對H1975細胞的凋亡誘導可能是通過對Bcl-2與Bax蛋白的調節(jié)而實現的。

圖2　流式細胞術檢測長梗秦艽酮誘導H1975細胞凋亡

圖3　熒光顯微鏡觀察長梗秦艽酮引起細胞凋亡的形態(tài)學變化

圖4　長梗秦艽酮影響凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達

3　討論

肺癌是嚴重危害人類生命健康的疾病，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內每年仍在上升[4]。到目前為止,臨床上對于肺癌的治療仍然以手術切除為主，輔助以放療、化療及分子靶向治療等方法。但是由于肺癌對放化療及分子靶向治療容易產生耐受和抵抗性[5-6]，在過去的十幾年間，肺癌患者的生存質量和生存率并未得到很大提高。因此，發(fā)現新的治療肺癌的藥物，尤其是對放化療及分子靶向治療產生耐藥抵抗的肺癌具有治療作用的藥物正成為研究的熱點。近年來，中藥抗腫瘤的研究受到了廣泛的關注[7-10]，有多種具有抗腫瘤活性的中藥被發(fā)現，尤其是從中藥中提取的天然單體化合物。從中藥中提取的天然單體化合物可以通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用，其中包括抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的侵襲及轉移等機制[11-14]。近年來的研究發(fā)現，天然單體化合物在減少腫瘤細胞對放化療及分子靶向治療耐藥及抵抗性、增強藥物對腫瘤細胞的敏感性等方面也發(fā)揮著重要的作用[15-22]。

本研究選取的藥物長梗秦艽酮是從中藥長梗秦艽中提取的五環(huán)三萜類天然化合物，具有多種生物活性。近年來的研究表明，長梗秦艽酮具有明顯的抗腫瘤活性，對肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤有明顯的抑制作用[1-3]。但是，研究并不全面，尤其是對放化療及分子靶向治療耐藥腫瘤的作用及機制尚不明確。本研究通過MTT、流式細胞儀、熒光電子顯微鏡、Western blot等實驗方法研究長梗秦艽酮對吉西他濱耐藥的人肺腺癌細胞系H1975細胞的抑制作用及其機制。MTT實驗結果表明，長梗秦艽酮對H1975細胞具有增殖抑制作用，且有時間及劑量依賴性。流式細胞儀AnnexinV/PI雙染法及熒光電子顯微鏡結果表明，長梗秦艽酮可以誘導H1975細胞凋亡，提示長梗秦艽酮抑制H1975細胞的作用可能與誘導細胞凋亡有關。進一步研究發(fā)現，長梗秦艽酮能夠調節(jié)細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達，提示長梗秦艽酮可能通過Bcl-2和Bax促進肺癌H1975細胞凋亡。

綜上所述，從中藥中提取的天然單體化合物可以通過多靶點、多通路發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究結果可以為長梗秦艽酮在治療吉西他濱耐藥肺癌方面提供實驗依據，但仍需要進一步的動物體內實驗探討其體內抗腫瘤作用及臨床應用前景。

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收稿日期：2016-04-27

基金項目：遼寧省博士啟動基金項目(20121130)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607004

Waltonitone inhibits proliferation and induces apoptosis in gemcitabine-resistent H1975 lung cancer cells

ZHANG Yia,XU Xiao-manb,ZHANG Menga,HE Pinga*

(a.Department of Geriatrics Medicine,b.Department of Respiratory Medicine,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effects and the possible mechanisms of waltonitone on cell proliferation and apoptosis in lung cancer H1975 cells.MethodsMTT assay and Annexin V-FITC flow cytometry were used to measure the effects of waltonitone on cell proliferation and apoptosis.In addition,waltonitone-induced morphological changes were assessed by Hoechst 33342 staining under a fluorescence microscope.Finally,to explored the possible mechanisms by which waltonitone stimulated apoptosis we performed western blot to screening its potential targets.ResultsThe proliferation of H1975 cells was inhibited by waltonitone in a dose-and-time dependent manner.Flow cytometry analysis showed that waltonitone could induce H1975 cells apoptosis.Chromosome condensation and nuclear fragmentation were observed by Hoechst 33342 dying in treated H1975 cells.Waltonitone down-regulated Bcl-2 and up-regulated Bax in H1975 cells.ConclusionWaltonitone remarkably suppressed proliferation and greatly promoted apoptosis of H1975 cells possibly through regulation of Bcl-2 and Bax.

Key words：Waltonitone；Lung cancer；Proliferation；Apoptosis