金葉銀杏半同胞子代無性系的葉色和色素含量變化及呈色機制分析

郁萬文， 祝遵凌， 曹福亮， 周春麗

(1. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210037； 2. 江蘇蘇林園林工程有限公司， 江蘇 宿遷 223600)

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金葉銀杏半同胞子代無性系的葉色和色素含量變化及呈色機制分析

郁萬文1,2， 祝遵凌1， 曹福亮1， 周春麗1

(1. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210037； 2. 江蘇蘇林園林工程有限公司， 江蘇 宿遷 223600)

對4月份至11月份金葉銀杏‘萬年金’(Ginkgobiloba‘Wannianjin’)32個半同胞子代無性系與親本的葉色差異進行比較；比較了不同色系葉片的色素含量和比值及葉色參數(shù)(L*、a*和b*)的變化，分析了葉色參數(shù)與葉片色素含量的相關(guān)性；并觀察了不同色系的葉綠體超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：32個半同胞子代無性系可被分為金黃、淺黃、草綠和藍綠4個色系。隨時間推移，草綠和藍綠色系葉片的總?cè)~綠素(Chl)、葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類胡蘿卜素(Car)含量均呈“雙峰型”變化趨勢，Car/Chl和Car/Chla比值的變幅均較小；而金黃和淺黃色系葉片的上述色素含量呈“升高—降低—升高”變化趨勢，Car/Chl和Car/Chla比值總體呈“迅速下降—相對穩(wěn)定—緩慢升高”的變化趨勢。各色系葉片的上述色素含量在夏季均不同程度下降，Car/Chlb比值變化差異較大，且金黃和淺黃色系的各色素含量均低于草綠和藍綠色系。隨時間推移，金黃和淺黃色系葉片的L*、a*和b*值以及草綠和藍綠色系葉片的L*和b*值均先降低后升高，后2個色系的a*值則先升高后下降；并且，前2個色系的L*和b*值總體上顯著高于后2個色系，而a*值則總體上低于后2個色系。金黃色系的Chla和Chl含量與L*和a*值顯著負相關(guān)，而其Car/Chl和Car/Chla比值則與L*、a*和b*值顯著或極顯著正相關(guān)；淺黃色系的Chlb含量與a*值顯著負相關(guān)，其Car/Chla比值與L*和b*值以及Car/Chlb比值與a*值均顯著正相關(guān)；草綠色系的Chla含量與L*值顯著負相關(guān)，其Car/Chla比值與L*和b*值以及Car/Chlb比值與a*值均顯著正相關(guān)；這3個色系葉片的其余指標間以及藍綠色系葉片的各指標間均無顯著相關(guān)性。觀察結(jié)果顯示：金黃和淺黃色系的葉綠體基粒片層發(fā)育不健全，基粒片層可見但排列較疏松，且無明顯垛疊，分布范圍小而稀疏；藍綠和草綠色系葉綠體的基粒類囊體垛疊層數(shù)均較多，基粒片層發(fā)達且排列緊致、整齊，分布范圍大而稠密。綜合分析結(jié)果表明：‘萬年金’4個色系半同胞子代無性系葉片的呈色差異和葉色變化由多種因素控制，其中，Car/Chl和Car/Chla比值高且葉綠體基粒片層發(fā)育不健全是葉片呈黃色的主要原因。

金葉銀杏; 葉色; 色素含量; 葉色參數(shù); 超微結(jié)構(gòu); 呈色機制

傳統(tǒng)的廣普性綠化植物色彩單一、綠化形式單調(diào)，而彩葉植物多數(shù)具有獨特的葉色，宜作為園林綠化植物的首選，在園林配置中的應(yīng)用也越來越廣。目前，人們已經(jīng)成功選育出金葉國槐(Sophorajaponicaf.flavi-rameus)、金葉榆(Ulmuspumila‘Jinye’)、金葉水杉(Metasequoiaglyptostroboides‘Gold Rush’)、金葉黃櫨(Cotinuscoggygria‘Golden Spirit’)、黃金榕(Ficusmicrocarpa‘Golden Leaves’)、金葉刺槐(Robinapseudoacaa‘Frilis’)、皇冠欒(Koelreuteriabipinnata‘Huangguan’)等多種金葉植物，并有針對性地開展了一系列繁育研究。然而，對彩葉植物生態(tài)生理學(xué)特性，特別是葉色形成機制方面的研究尚不多見，且對彩葉植物葉色動態(tài)變化及呈色機制的研究也無統(tǒng)一結(jié)論。何亦昆等[1]認為，彩葉植物的葉片呈色與葉肉細胞所含色素的種類、相對含量及其在葉片中的分布和組織定位有關(guān)，尤其是葉肉細胞中的色素種類及其相對比例的變化和時空組合最終決定了葉片呈色[2-3]。Tsuzuki等[4]認為，苗期顯現(xiàn)的葉色變異穩(wěn)定、便于觀察且易于檢測，是呈色機制研究的有效載體。

金葉銀杏‘萬年金’(‘Wannianjin’)為銀杏(GinkgobilobaLinn.)的1個芽變品種，由南京林業(yè)大學(xué)選育，其葉色在春季即為金黃色，具有很高的觀賞價值。隨著葉齡的增大，‘萬年金’的葉色由金黃色逐漸轉(zhuǎn)為黃綠色，并在盛夏出現(xiàn)“返綠”現(xiàn)象，觀賞價值隨之降低。觀察結(jié)果顯示，由‘萬年金’種子繁育出的實生苗出現(xiàn)明顯的葉色分化，有黃色和綠色之分，且不同單株間葉色深淺不一。目前，關(guān)于金葉銀杏的研究主要集中在組織培養(yǎng)[5]和扦插育苗[6]等方面，筆者在前期對‘萬年金’的葉色發(fā)育、光合特性、選育和區(qū)試等也進行了探索性研究[7-8]，然而關(guān)于‘萬年金’葉片的呈色機制尚不明確。

為了弄清金葉銀杏‘萬年金’半同胞子代無性系的葉色分化情況，明確不同色系的葉色發(fā)育規(guī)律和呈色機制，作者對‘萬年金’4個色系半同胞子代無性系葉片的色素含量和葉色參數(shù)(包括L*、a*和b*)的變化及葉綠體的超微結(jié)構(gòu)進行了比較，以期為金葉植物的呈色機制研究和良種選育提供指導(dǎo)和借鑒。

1　材料和方法

1.1材料

于2006年9月下旬采集‘萬年金’的成熟種實，經(jīng)常規(guī)調(diào)制后將得到的種子置于4 ℃冰箱中保存、備用；翌年春天進行催芽和播種，共獲得32株實生苗；于2010年3月下旬對所有實生苗進行剪枝嫁接，形成32個半同胞子代無性系，依次編號1至32，其中，26號無性系為雙胚實生苗，一個主干上的葉片呈淺黃色，記作26H，另一個主干上的葉片呈草綠色，記作26L；另采集親本的普通枝條和金葉芽變枝條進行嫁接，形成2個親本無性系，分別記作CK1和CK2。將各無性系按照編號順序種植于南京林業(yè)大學(xué)銀杏園內(nèi)，株距0.5 m、行距1.0 m，采取常規(guī)日常管理方式培育1 a。

南京林業(yè)大學(xué)銀杏園地處亞熱帶和暖溫帶過渡地區(qū)，屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年均溫15.4 ℃，最高月均溫28.1 ℃，最低月均溫-1.5 ℃，年降水量1 106 mm，年均空氣相對濕度76%，土壤的最大凍結(jié)深度為0.09 m，無霜期232 d。土壤為黃棕壤，0～30 cm土層為沙壤土，pH 7.36，土壤中有機質(zhì)、全氮、全磷和全鉀的含量分別為26.85、1.17、0.49和4.64 g·kg-1，堿解氮、速效磷和速效鉀的含量分別為46.27、9.78和95.2 mg·kg-1。

1.2方法

1.2.1葉色參數(shù)的測定參照丁廷發(fā)等[9]的方法測定葉色參數(shù)，具體操作略有改動。分別于2011年4月20日、 5月20日、 6月20日、 7月25日、 9月 5日、9月20日、10月20日和11月20日的10:00左右隨意采集各無性系植株頂芽下第4至第6位成熟、完整的功能葉1枚，平放在桌面上，將英國皇家比色卡置于葉旁，使用 SONY DSC-HX1數(shù)碼相機記錄葉片的實際視覺場景，葉片與相機鏡頭的間距為60 cm；以葉柄為軸將葉片分為左右兩部分，用Photoshop CS 8.01軟件將各部分中部的葉色轉(zhuǎn)化成Lab模式(其中，L*表示黑白亮度，值閾為0～100，數(shù)值越小顏色越暗；a*表示紅綠之間的變化，值閾為-120～120，正值偏紅，負值偏綠；b*表示黃藍之間的變化，數(shù)值越大顏色越黃，數(shù)值越小顏色越藍)，每個無性系各檢測4株，視為4個重復(fù)。描繪32個半同胞子代無性系在觀賞期和全年的葉色差異彩塊圖，并采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件進行不同色系葉色參數(shù)與色素含量間的相關(guān)性分析。

1.2.2葉片色素含量的測定參照熊慶娥[10]的方法測定葉片色素含量，略有改動。在每個無性系供拍照的葉片中隨機選擇1枚葉片，按照不同色系疊加，剪成長3 mm、寬1 mm的碎片，混合后稱取0.05 g，加入10 mL丙酮-乙醇(等體積比)混合液，避光并封口浸提24 h；取上清液，使用島津UV-1800紫外可見分光光度計(日本島津公司)測定光密度值，并計算葉片的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素及類胡蘿卜素含量，每個指標重復(fù)測定4次。

1.2.3葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察參照Ruppel等[11]的方法制作超微切片，略有改動。于葉片成熟初期(即5月20日)，根據(jù)各色系的L*、a*和b*的均值，選取L*、a*和b*值均接近均值的19號(金黃色系)、20號(藍綠色系)、22號(草綠色系)和31號(淺黃色系)子代無性系以及普通親本無性系(CK1)和金葉芽變親本無性系(CK2)，取正常生長植株頂芽下的第5枚葉片，切成寬0.1 cm長條，用戊二醛和鋨酸固定，并經(jīng)體積分數(shù)70%、80%、90%、100%乙醇系列脫水，用包埋劑滲透后用Epon812環(huán)氧樹脂包埋，切成超薄切片；先后用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行雙重染色，自然干燥后用HITACHI 7650透射電鏡(日本日立高新技術(shù)公司)觀察并拍照。每個無性系選擇3個玻片進行觀察，選擇最佳照片進行分析。

1.3數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

將最佳觀賞期32個子代無性系的比色結(jié)果直接導(dǎo)入Photoshop CS 8.01軟件，統(tǒng)計各子代無性系葉色參數(shù)L*、a*和b*，并輸出RGB最佳顏色模式制作成反映真實葉色的色塊；采用K-means方法對各子代無性系的葉色參數(shù)L*、a*和b*進行聚類。采用EXCEL 2013和SPSS 22.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析和相關(guān)性分析。

2　結(jié)果和分析

2.1觀賞期半同胞子代無性系葉色的比較分析

金葉銀杏‘萬年金’32個半同胞子代無性系及2個親本無性系葉色的比較結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示：金葉銀杏‘萬年金’32個半同胞子代無性系葉片呈現(xiàn)深淺不一的黃色或綠色，說明其子代實生苗的葉色出現(xiàn)明顯的遺傳分化。

K-means聚類結(jié)果顯示，金葉銀杏‘萬年金’32個半同胞子代無性系被劃分為金黃、淺黃、草綠和藍綠4個色系，與比色卡的比色結(jié)果相符。其中，金黃色系對應(yīng)的色卡區(qū)域為Yellow-green group N144A和151A，包括16、19、21和24號半同胞子代無性系，具有較高的觀賞價值；淺黃色系對應(yīng)的色卡區(qū)域為Yellow-green group N144A、144C和145A，包括1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、17、18、25、26H、31和32號半同胞子代無性系，具有一定的觀賞性；草綠色系對應(yīng)的色卡區(qū)域為Green group 137C～138B，包括2、15、22、23、26L、27、28、29和30號半同胞子代無性系；藍綠色系對應(yīng)的色卡區(qū)域為Green group 137C～138A，包括12、13、14和20號半同胞子代無性系。

1-32: 半同胞子代無性系，其中，26H和26L為雙胚實生苗的2個主干 Half-sib progeny clones, in which, 26H and 26L are two trunks of double embryo seedling; CK1: 普通親本無性系 Common parent clone; CK2: 金葉芽變親本無性系 Parent clone of gold leaf bud mutation.

圖1金葉銀杏‘萬年金’32個半同胞子代無性系及其親本無性系葉色的比較(以4月20日的比較結(jié)果為例)

Fig. 1Comparison on leaf color of 32 half-sib progeny clones of ‘Wannianjin’ of golden-leaf ginkgo (GinkgobilobaLinn.) and

their parent clones (taking comparison result in April 20 as an example)

2.2不同色系半同胞子代無性系葉片色素含量的比較分析

2.2.1色素含量的比較金葉銀杏‘萬年金’不同色系半同胞子代無性系葉片的色素含量見表1。結(jié)果表明：在4月20日至11月20日期間，草綠和藍綠色系無性系的總?cè)~綠素(Chl)、葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類胡蘿卜素(Car)含量均隨時間推移呈現(xiàn)“雙峰型”變化趨勢，且二者的Chl、Chla、Chlb和Car含量基本無顯著差異(P>0.05)，并在4月20日至6月20日期間顯著高于金黃和淺黃色系無性系(P<0.05)；而金黃和淺黃色系無性系的Chl、Chla、Chlb和Car含量則隨時間推移呈現(xiàn)“升高—降低—升高”的變化趨勢，并且這2個色系葉片的Chl、Chla、Chlb和Car含量均較低且無差異顯著。

總體而言，草綠和藍綠色系無性系葉片的色素含量峰值多出現(xiàn)在5月20日，而金黃和淺黃色系無性系的峰值則出現(xiàn)在7月25日；夏季(7月25日至9月5日)各色系葉片的色素含量均不同程度下降；進入秋季后，各色系葉片的色素含量又不同程度升高；11月份時，草綠和藍綠色系葉片的色素含量均有所下降，而金黃和淺黃色則略有升高。

2.2.2類胡蘿卜素與葉綠素含量比值的比較金葉銀杏‘萬年金’不同色系半同胞子代無性系葉片中類胡蘿卜素(Car)與葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和總?cè)~綠素(Chl)含量的比值見表2。結(jié)果表明：在4月20日至11月20日期間，金黃和淺黃色系無性系葉片的Car/Chl和Car/Chla比值隨時間推移的變化趨勢較為一致，總體表現(xiàn)為在生長前期(6月20日前)迅速降低、生長中期(6月20日至9月5日)相對平衡、生長后期(9月5日后)緩慢升高的趨勢；草綠和藍綠色系無性系葉片的Car/Chl和Car/Chla比值的變化趨勢也較為一致，均表現(xiàn)為小幅波動。然而，各色系葉片的Car/Chlb比值變化趨勢有較大差異，金黃色系葉片的Car/Chlb比值表現(xiàn)為在生長前期迅速降低并于6月20日降至最低值后逐漸升高，而藍綠色系的變化趨勢大體上與金黃色系相反；淺黃色系葉片的Car/Chlb比值表現(xiàn)為在生長前期迅速降低、生長中期維持在相對平衡的狀態(tài)、生長后期升高并維持在相對平穩(wěn)的水平，而草綠色系的變化趨勢與淺黃色系恰好相反。

表1金葉銀杏‘萬年金’不同色系半同胞子代無性系葉片中色素含量的變化1)

Table 1Change in pigment contents in leaf of different color series of half-sib progeny clones of ‘Wannianjin’ of golden-leaf ginkgo (GinkgobilobaLinn.)1)

色系Colorseries不同日期(MM-DD)葉片的葉綠素a含量/mg·g-1 Chlorophyllacontentinleafatdifferentdates(MM-DD)04-2005-2006-2007-2509-0509-2010-2011-20金黃色Goldenyellow0.241±0.068b0.651±0.109b0.869±0.050b0.969±0.086a0.798±0.110bc0.579±0.047a0.672±0.045b0.762±0.056a淺黃色Lightyellow0.303±0.088b0.656±0.095b0.846±0.050b0.946±0.237a0.473±0.046c0.564±0.109a0.782±0.043ab0.867±0.106a草綠色Grassgreen1.240±0.125a1.489±0.063a1.614±0.150a1.314±0.054a1.207±0.115a0.977±0.189a1.355±0.276a0.804±0.343a藍綠色Blue-green1.308±0.227a1.762±0.046a1.670±0.217a1.237±0.163a0.911±0.017ab0.945±0.143a1.231±0.124ab0.983±0.389a

色系Colorseries不同日期(MM-DD)葉片的葉綠素b含量/mg·g-1 Chlorophyllbcontentinleafatdifferentdates(MM-DD)04-2005-2006-2007-2509-0509-2010-2011-20金黃色Goldenyellow0.074±0.016b0.170±0.035c0.240±0.001b0.238±0.035a0.167±0.022b0.123±0.006a0.112±0.020b0.152±0.009a淺黃色Lightyellow0.119±0.033b0.252±0.012bc0.276±0.004b0.269±0.045a0.179±0.025b0.129±0.018a0.165±0.019b0.203±0.024a草綠色Grassgreen0.446±0.034a0.514±0.086ab0.342±0.017a0.309±0.024a0.261±0.003a0.256±0.063a0.382±0.048a0.285±0.114a藍綠色Blue-green0.425±0.081a0.587±0.119a0.350±0.011a0.329±0.017a0.296±0.025a0.246±0.094a0.434±0.057a0.321±0.133a

色系Colorseries不同日期(MM-DD)葉片的總?cè)~綠素含量/mg·g-1 Totalchlorophyllcontentinleafatdifferentdates(MM-DD)04-2005-2006-2007-2509-0509-2010-2011-20金黃色Goldenyellow0.315±0.084b0.821±0.144b1.109±0.049b1.207±0.121a0.965±0.132bc0.702±0.041a0.784±0.065c0.914±0.047a淺黃色Lightyellow0.422±0.122b0.908±0.107b1.122±0.047b1.215±0.282a0.652±0.021c0.693±0.127a0.947±0.062bc1.070±0.081a草綠色Grassgreen1.686±0.159a2.003±0.024a1.956±0.167a1.623±0.078a1.468±0.118a1.233±0.252a1.737±0.324a1.089±0.457a藍綠色Blue-green1.733±0.308a2.349±0.165a2.020±0.227a1.566±0.179a1.207±0.008ab1.191±0.237a1.665±0.180ab1.304±0.522a

色系Colorseries不同日期(MM-DD)葉片的類胡蘿卜素含量/mg·g-1 Carotenoidcontentinleafatdifferentdates(MM-DD)04-2005-2006-2007-2509-0509-2010-2011-20金黃色Goldenyellow0.218±0.034b0.419±0.004c0.412±0.026b0.464±0.027bc0.411±0.052bc0.307±0.011a0.328±0.061b0.451±0.016a淺黃色Lightyellow0.262±0.029b0.377±0.005c0.386±0.016b0.418±0.067c0.284±0.011c0.305±0.036a0.377±0.042b0.460±0.042a草綠色Grassgreen0.660±0.069a0.798±0.002b0.794±0.039a0.716±0.033a0.651±0.072a0.507±0.118a0.742±0.110a0.522±0.138a藍綠色Blue-green0.705±0.139a0.982±0.071a0.841±0.097a0.647±0.074ab0.498±0.009ab0.515±0.094a0.703±0.081a0.541±0.221a

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

表2金葉銀杏‘萬年金’不同色系半同胞子代無性系葉片中類胡蘿卜素與葉綠素含量比值的變化1)

Table 2Change in ratios of carotenoid content to chloraphyll content in leaf of different color series of half-sib progeny clones of ‘Wannianjin’of golden-leaf ginkgo (GinkgobilobaLinn.)1)

色系Colorseries不同日期(MM-DD)葉片的Car/Chla比值 Car/Chlaratioinleafatdifferentdates(MM-DD)04-2005-2006-2007-2509-0509-2010-2011-20金黃色Goldenyellow0.905±0.130a0.645±0.085a0.474±0.002a0.479±0.018a0.515±0.007b0.530±0.021a0.488±0.052a0.591±0.027a淺黃色Lightyellow0.864±0.145a0.574±0.059a0.457±0.007a0.442±0.079a0.600±0.030a0.540±0.029a0.482±0.025a0.531±0.022a草綠色Grassgreen0.533±0.002a0.536±0.022a0.492±0.026a0.545±0.003a0.540±0.010ab0.519±0.014a0.548±0.051a0.650±0.057a藍綠色Blue-green0.539±0.009a0.557±0.027a0.504±0.010a0.523±0.012a0.547±0.001ab0.545±0.013a0.571±0.010a0.550±0.004a

色系Colorseries不同日期(MM-DD)葉片的Car/Chlb比值 Car/Chlbratioinleafatdifferentdates(MM-DD)04-2005-2006-2007-2509-0509-2010-2011-20金黃色Goldenyellow2.945±0.238a2.469±0.375a1.719±0.115b1.950±0.259ab2.468±0.011a2.490±0.217a2.924±0.022a2.967±0.249a淺黃色Lightyellow2.199±0.351ab1.497±0.050a1.398±0.079b1.556±0.015b1.586±0.386a2.359±0.038a2.282±0.004b2.273±0.388ab草綠色Grassgreen1.481±0.036b1.554±0.384a2.323±0.001a2.320±0.089a2.499±0.257a1.984±0.021a1.942±0.055c1.832±0.139b藍綠色Blue-green1.661±0.006b1.674±0.365a2.405±0.218a1.968±0.142ab1.684±0.205a2.094±0.237a1.620±0.032d1.683±0.005b

色系Colorseries不同日期(MM-DD)葉片的Car/Chl比值 Car/Chlratioinleafatdifferentdates(MM-DD)04-2005-2006-2007-2509-0509-2010-2011-20金黃色Goldenyellow0.692±0.091a0.511±0.070a0.372±0.006bc0.384±0.021a0.426±0.005a0.437±0.009a0.418±0.037a0.493±0.009a淺黃色Lightyellow0.620±0.103ab0.415±0.035a0.344±0.000c0.344±0.046a0.436±0.002a0.440±0.021a0.398±0.016a0.430±0.008a草綠色Grassgreen0.392±0.003b0.398±0.004a0.406±0.018ab0.441±0.001a0.444±0.016a0.411±0.008a0.427±0.026a0.480±0.041a藍綠色Blue-green0.407±0.006b0.418±0.001a0.417±0.002a0.413±0.000a0.413±0.010a0.433±0.005a0.422±0.004a0.415±0.002a

1)Chla: 葉綠素a含量 Chlorophyllacontent; Chlb: 葉綠素b含量 Chlorophyllbcontent; Chl: 總?cè)~綠素含量 Total chlorophyll content; Car: 類胡蘿卜素含量 Carotenoid content. 同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2.3不同色系半同胞子代無性系葉色及其參數(shù)的比較分析

在4月20日至11月20日期間金葉銀杏‘萬年金’不同色系半同胞子代無性系的葉色變化見圖2；各色系的葉色參數(shù)變化見表3。

由圖2可見：4個色系的葉色均為生長初期偏黃、生長中期漸綠、生長后期漸黃，并且，同一時期金黃和淺黃色系的葉色較草綠和藍綠色系偏黃。

由表3可見：4個色系葉色參數(shù)L*、a*和b*值的變化規(guī)律相似?？傮w上看，金黃和淺黃色系的L*、a*和b*值以及草綠和藍綠色系的L*和b*值均呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢，而草綠和藍綠色系的a*值則表現(xiàn)為先升高后下降的變化趨勢。金黃和淺黃色系的L*和b*值總體上顯著高于草綠和藍綠色系(P<0.05)，并且前二者的L*和b*值在9月5日前后降至最低，而后二者的L*和b*值則在7月25日降至最低；生長中期(6月20日至9月20日)，金黃和淺黃色系的a*值基本上顯著低于草綠和藍綠色系，并且前二者的a*值在7月25日前后降至最低，而后二者的a*值則在7月25日前后升至最高。

圖2　金葉銀杏‘萬年金’不同色系半同胞子代無性系葉色的變化

表3金葉銀杏‘萬年金’不同色系半同胞子代無性系葉色參數(shù)(L*、a*和b*)的變化1)

Table 3Change in leaf color parameters (L*, a* and b*) of different color series of half-sib progeny clones of ‘Wannianjin’ of golden-leaf ginkgo (GinkgobilobaLinn.)1)

色系Colorseries不同日期(MM-DD)葉片的L*值 L*valueofleafatdifferentdates(MM-DD)04-2005-2006-20 07-2509-0509-2010-2011-20金黃色Goldenyellow66.86±2.95a60.97±3.14a54.70±1.45a 51.80±1.39a49.02±1.41a51.85±2.08a56.00±0.65a57.29±1.84a淺黃色Lightyellow61.40±1.12a59.17±2.20a54.78±1.21a52.36±1.56a49.23±0.23a49.68±1.89a53.45±1.05a55.55±1.81a草綠色Grassgreen41.56±2.88b35.81±0.75b34.31±0.36b33.58±1.14b35.87±0.78c37.43±0.82b39.07±4.45b47.97±6.08a藍綠色Blue-green43.18±2.91b37.35±0.43b36.49±0.16b36.16±1.46b39.07±0.01b39.05±0.70b40.44±4.59b49.63±6.14a

色系Colorseries不同日期(MM-DD)葉片的a*值 a*valueofleafatdifferentdates(MM-DD)04-2005-20 06-20 07-2509-05 09-20 10-20 11-20 金黃色Goldenyellow-8.63±1.77a-12.16±3.74a -19.64±0.61c -20.86±0.77b-19.32±0.60b -18.11±1.97b -14.18±0.00a -14.18±1.01a 淺黃色Lightyellow-15.88±1.72b-19.31±0.89a-21.09±0.03c-21.04±0.66b-19.72±0.36b-19.01±1.67b-15.68±0.53a-16.74±1.29a草綠色Grassgreen-16.37±1.69b-12.99±0.73a-11.54±0.13a-11.28±0.55a-12.38±0.63a-11.12±1.08a-13.27±1.16a-15.60±1.30a藍綠色Blue-green-17.30±1.49b-14.31±0.21a-13.90±0.52b-12.87±0.20a-13.27±0.39a-14.05±0.54ab-15.12±0.28a-15.67±0.68a

色系Colorseries不同日期(MM-DD)葉片的b*值 b*valueofleafatdifferentdates(MM-DD)04-2005-2006-20 07-2509-0509-2010-2011-20金黃色Goldenyellow54.29±0.30a53.69±7.85a38.00±1.29a 35.42±2.14a31.15±0.68a32.50±3.03a38.56±0.30a39.16±7.27a淺黃色Lightyellow53.35±4.03a45.30±2.28a 40.74±2.34a36.06±2.26a31.55±0.44a32.42±2.29a37.00±0.97a38.95±3.17a草綠色Grassgreen23.96±4.05b15.86±1.14b 13.58±0.19b13.95±0.45b14.85±0.82c16.50±0.63b17.75±6.11b29.96±7.05a藍綠色Blue-green27.30±4.16b18.99±0.63b 17.72±0.88b15.96±0.89b17.75±0.78b19.30±1.14b21.58±4.75b31.08±6.05a

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2.4不同色系半同胞子代無性系葉色參數(shù)與葉片色素含量的相關(guān)性分析

金葉銀杏‘萬年金’不同色系半同胞子代無性系葉色參數(shù)與葉片色素含量的相關(guān)性分析結(jié)果見表4。結(jié)果表明：各色系的葉色參數(shù)與葉片色素含量均呈現(xiàn)一定相關(guān)性，其中，金黃和淺黃色系葉片的Car/Chl、Car/Chla和Car/Chlb比值與葉色參數(shù)L*、a*和b*值均呈正相關(guān)。金黃色系葉片的Chla和Chl含量與L*和a*值呈顯著負相關(guān)，而其Car/Chl和Car/Chla比值則與L*、a*和b*值呈顯著或極顯著正相關(guān)，其余指標間均無顯著相關(guān)性。淺黃色系葉片的Chlb含量與a*值呈顯著負相關(guān)，其Car/Chla比值與L*和b*值呈顯著正相關(guān)，Car/Chlb比值與a*值呈顯著正相關(guān)，其余指標間均無顯著相關(guān)性，Car/Chlb比值與L*和b*值呈中度的負相關(guān)關(guān)系。草綠色系葉片的Chla含量與L*值呈顯著負相關(guān)，Car/Chla比值與L*和b*值以及Car/Chlb比值與a*值呈顯著正相關(guān)，其余指標間均無顯著相關(guān)性。藍綠色系葉片的各指標間均無顯著相關(guān)性，但其Car/Chlb比值與L*和b*值呈中度負相關(guān)。

表4金葉銀杏‘萬年金’不同色系半同胞子代無性系葉片色素含量和葉色參數(shù)的相關(guān)系數(shù)1)

Table 4Correlation coefficient between leaf pigment contents and leaf color parameters of different color series of half-sib progeny clones of ‘Wannianjin’ of golden-leaf ginkgo (GinkgobilobaLinn.)1)

葉色參數(shù)Leafcolorparameter金黃色系無性系各指標間的相關(guān)系數(shù) CorrelationcoefficientamongdifferentindexesofgoldenyellowcolorseriesclonesChlaChlbChlCarCar/ChlCar/ChlaCar/ChlbL*-0.74#-0.43-0.72#-0.52 0.87##0.85##0.34a*-0.81#-0.65-0.80#-0.580.79#0.84#0.60b*-0.60-0.22-0.59-0.370.78#0.76#0.12

葉色參數(shù)Leafcolorparameter淺黃色系無性系各指標間的相關(guān)系數(shù) CorrelationcoefficientamongdifferentindexesoflightyellowcolorseriesclonesChlaChlbChlCarCar/ChlCar/ChlaCar/ChlbL*-0.32-0.12-0.180.020.530.75#0.22a*-0.39-0.70#-0.44-0.140.640.530.82#b*-0.45-0.18-0.31-0.160.620.84#0.18

葉色參數(shù)Leafcolorparameter草綠色系無性系各指標間的相關(guān)系數(shù) CorrelationcoefficientamongdifferentindexesofgrassgreencolorseriesclonesChlaChlbChlCarCar/ChlCar/ChlaCar/ChlbL*-0.72#-0.06-0.60-0.610.470.82#-0.51 a*0.35-0.37-0.58-0.610.29-0.570.69#b*-0.690.02-0.55-0.570.420.81#-0.56

葉色參數(shù)Leafcolorparameter藍綠色系無性系各指標間的相關(guān)系數(shù) Correlationcoefficientamongdifferentindexesofblue-greencolorseriesclonesChlaChlbChlCarCar/ChlCar/ChlaCar/ChlbL*-0.49-0.11-0.39-0.41-0.20 0.36 -0.54 a*0.02-0.33-0.08-0.09-0.19-0.500.58b*-0.300.08-0.19-0.21-0.270.44-0.57

1)Chla: 葉綠素a含量 Chlorophyllacontent; Chlb: 葉綠素b含量 Chlorophyllbcontent; Chl: 總?cè)~綠素含量 Total chlorophyll content; Car: 類胡蘿卜素含量 Carotenoid content. #:P<0.05; ##:P<0.01.

2.5不同色系半同胞子代無性系葉綠體的超微結(jié)構(gòu)分析

金葉銀杏‘萬年金’不同色系半同胞子代無性系及普通親本和金葉芽變親本無性系葉肉細胞中葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果見圖版Ⅰ和Ⅱ。

觀察結(jié)果表明：4個色系半同胞子代無性系及普通親本和金葉芽變親本無性系葉綠體的形態(tài)及分布基本一致，大多呈橢球形且均環(huán)繞在葉肉細胞的內(nèi)表面；但不同色系葉肉細胞中葉綠體的超微結(jié)構(gòu)存在一定差異，主要表現(xiàn)在基粒數(shù)量以及基粒類囊體和基粒片層的垛疊狀況等方面。普通親本無性系 (圖版Ⅰ-2，3)以及藍綠色系 (圖版Ⅰ-5，6)和草綠色系(圖版Ⅰ-8，9)半同胞子代無性系的葉綠體超微結(jié)構(gòu)類似，基粒類囊體的垛疊層數(shù)均較多，并且類囊體發(fā)達，排列緊致、整齊，在葉肉細胞中的分布范圍大而稠密，基粒之間由基質(zhì)片層相互交聯(lián)成網(wǎng)；區(qū)別在于藍綠色系半同胞子代無性系葉片的基粒數(shù)量和基粒片層垛疊層數(shù)高于普通親本無性系和草綠色系的半同胞子代無性系。金葉芽變親本無性系(圖版Ⅱ-2，3)以及金黃色系(圖版Ⅱ-5，6)和淺黃色系(圖版Ⅱ-8，9)半同胞子代無性系葉肉細胞中的葉綠體超微結(jié)構(gòu)類似，基粒片層發(fā)育不全，基粒片層可見但排列疏松，無明顯垛疊，在葉肉細胞中的分布范圍小且稀疏，交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象不明顯，基質(zhì)片層近平行分布于葉綠體基質(zhì)中；區(qū)別在于淺黃色系半同胞子代無性系葉片的基粒片層垛疊不明顯，且垛疊層數(shù)較少，而金黃色系半同胞子代無性系和金葉芽變親本無性系的基粒片層幾乎無垛疊現(xiàn)象。

3　討論和結(jié)論

研究結(jié)果表明：金葉植物的色素種類及其相對含量的時空變化及葉綠體結(jié)構(gòu)的發(fā)育程度均對葉色有影響[12-14]；色素是金葉植物體內(nèi)的主要呈色物質(zhì)，且受到葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育程度和外部環(huán)境因子的共同調(diào)控作用[12,15]。通常認為，金葉植物葉片中的Car/Chl比值高于普通葉片[14,16]。在金葉銀杏‘萬年金’半同胞子代無性系中，金黃和淺黃色系無性系葉片的葉綠素和類胡蘿卜素含量基本上均低于草綠和藍綠色系，且在黃色呈現(xiàn)期前二者葉片的Car/Chl和Car/Chla比值均高于草綠和藍綠色系，據(jù)此推測Car/Chl和Car/Chla比值偏高可能是‘萬年金’半同胞子代無性系中金黃和淺黃色系葉片呈現(xiàn)黃色的主要原因之一。與陳芳等[13]和范燕萍等[17]的相關(guān)研究結(jié)果一致。

本研究中，金葉銀杏‘萬年金’草綠和藍綠色系半同胞子代無性系的各色素含量隨時間推移均呈明顯的“雙峰型”曲線，2個峰值分別出現(xiàn)在5月20日和10月20日，這可能與銀杏自身的生物學(xué)特性有關(guān)。眾所周知，銀杏屬于前期生長型樹種，在6月下旬停止高生長，這就要求植株在短暫的生長期尤其是速生期內(nèi)合成并積累大量的碳水化合物，用于組織和器官的構(gòu)建，因而形成第1個色素合成高峰。

夏季高溫和強光能夠顯著影響植物葉片中色素的合成和相對含量，從而影響葉色[18-21]。在7月25日至9月5日，‘萬年金’4個色系半同胞子代無性系葉片的葉綠素和類胡蘿卜素含量均下降，其Car/Chl比值降至約0.4，4個色系的葉色最綠，說明‘萬年金’4個色系半同胞子代無性系葉片的呈色與色素含量無密切關(guān)系，但與Car/Chl比值密切相關(guān)。由于存在暗反應(yīng)能障，導(dǎo)致高溫和強光條件下葉綠素捕捉的光能未相應(yīng)增加，造成機體將過剩的光能從葉綠體傳遞給O2并生成活性氧，進而損害葉肉細胞的膜系統(tǒng)；而含有共軛雙鍵的類胡蘿卜素分子則能保護膜系統(tǒng)免受過剩光能的這種損害作用[12]。本研究中，4個色系半同胞子代無性系的葉綠素和類胡蘿卜素含量雖然均有所下降，但后者的降幅相對較小，推測這可能是銀杏對夏季高溫、強光等逆境的適應(yīng)性反應(yīng)。

相關(guān)性分析結(jié)果表明：‘萬年金’4個色系半同胞子代無性系的葉色由Car/Chl、Car/Chla和Car/Chlb比值共同決定，其中，金黃和淺黃色系葉片的Car/Chl和Car/Chla比值與L*、a*和b*值呈顯著或中等程度正相關(guān)；草綠和藍綠色系葉片的Car/Chla比值與a*值呈中等程度負相關(guān)，Car/Chlb比值與L*和b*值均呈中等程度負相關(guān)，說明較高的Car/Chl和Car/Chla比值能夠直接反映葉片的黃色程度。

超微觀察結(jié)果顯示：‘萬年金’金黃和淺黃色系半同胞子代無性系及金葉芽變親本無性系的葉綠體基粒片層發(fā)育均不完全，基粒片層的排列較疏松且無明顯垛疊，且分布范圍較窄，這可能是該時期(5月20日)金黃和淺黃色系葉片呈現(xiàn)黃色的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。多數(shù)彩葉樹種存在返綠現(xiàn)象，這可能與葉綠體結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)育完善有關(guān)。推測，隨著葉片的發(fā)育，‘萬年金’金黃和淺黃色系半同胞子代無性系葉片的葉綠體逐漸發(fā)育完全，葉綠素總量逐漸增加，葉色逐漸轉(zhuǎn)綠，能夠捕捉到更多的光能進行光合作用，以滿足植株生長的需要。這一現(xiàn)象也得到了“對葉色突變體中已經(jīng)退化或發(fā)育不良的葉綠體結(jié)構(gòu)進行重建可使葉片復(fù)綠”的研究結(jié)論[22-24]的佐證。據(jù)此認為這可能是彩葉樹種對季節(jié)變化和生長節(jié)律的一種本能響應(yīng)。

綜上所述，葉片的色素含量及比值、葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育狀況及生長環(huán)境的光照和溫度變化共同引起金葉銀杏‘萬年金’4個色系半同胞子代無性系葉片的呈色差異及葉色變化，葉片的Car/Chl和Car/Chla比值高且葉綠體基粒片層發(fā)育不健全是葉片呈現(xiàn)黃色的主要原因。由于葉色突變是一個復(fù)雜的生理現(xiàn)象，因此，應(yīng)從金葉銀杏的遺傳學(xué)和細胞結(jié)構(gòu)等方面對其葉片呈色機制進行深入研究，同時開展光照、溫度、濕度和土壤等環(huán)境因子對葉片呈色影響的系統(tǒng)研究。

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(責(zé)任編輯： 佟金鳳)

圖版說明Explanation of Plates

圖版Ⅰ1-3. 普通親本無性系: 1. 葉肉細胞顯微結(jié)構(gòu); 2. 葉綠體超微結(jié)構(gòu); 3. 葉綠體局部超微結(jié)構(gòu). 4-6. 藍綠色系半同胞子代無性系(20號無性系): 4. 葉肉細胞顯微結(jié)構(gòu); 5. 葉綠體超微結(jié)構(gòu); 6. 葉綠體局部超微結(jié)構(gòu). 7-9. 草綠色系半同胞子代無性系(22號無性系): 7. 葉肉細胞顯微結(jié)構(gòu); 8. 葉綠體超微結(jié)構(gòu); 9. 葉綠體局部超微結(jié)構(gòu).

Plate Ⅰ1-3. Common parent clone: 1. Microscopic structure of mesophyll cell; 2. Ultrastructure of chloroplast; 3. Ultrastructure of part of chloroplast. 4-6. Half-sib progeny cloneofblue-greencolorseries(No. 20 clone):4. Microscopicstructureofmesophyllcell;5. Ultrastructureofchloroplast;6. Ultrastructure of part of chloroplast. 7-9. Half-sib progeny clone of grass green color series (No. 22 clone): 7. Microscopic structure of mesophyll cell; 8. Ultrastructure of chloroplast; 9. Ultrastructure of part of chloroplast.

圖版Ⅱ1-3. 金葉芽變親本無性系: 1. 葉肉細胞顯微結(jié)構(gòu); 2. 葉綠體超微結(jié)構(gòu); 3. 葉綠體局部超微結(jié)構(gòu). 4-6. 金黃色系半同胞子代無性系 (19號無性系): 4. 葉肉細胞顯微結(jié)構(gòu); 5. 葉綠體超微結(jié)構(gòu); 6. 葉綠體局部超微結(jié)構(gòu). 7-9. 淺黃色系半同胞子代無性系(31號無性系): 7. 葉肉細胞顯微結(jié)構(gòu); 8. 葉綠體超微結(jié)構(gòu); 9. 葉綠體局部超微結(jié)構(gòu).

Plate Ⅱ1-3. Parent clone of gold leaf bud mutation: 1. Microscopic structure of mesophyll cell; 2. Ultrastructure of chloroplast; 3. Ultrastructure of part of chloroplast. 4-6. Half-sib progeny clone of golden color series (No. 19 clone): 4. Microscopic structure of mesophyll cell; 5. Ultrastructure of chloroplast; 6. Ultrastructure of part of chloroplast. 7-9. Half-sib progeny clone of light yellow color series (No. 31 clone): 7. Microscopic structure of mesophyll cell; 8. Ultrastructure of chloroplast; 9. Ultrastructure of part of chloroplast.

GT: 基粒片層Grana lamella; ST: 基質(zhì)片層Stromal lamella.

郁萬文， 等： 金葉銀杏半同胞子代無性系的葉色和色素含量變化及呈色機制分析

圖版Ⅰ

YU Wanwen, et al: Analyses on changes in leaf color and pigment contents and

coloring mechanism of half-sib progeny clones of golden-leaf ginkgo

Plate Ⅰ

See the explanation at the end of the text

郁萬文， 等： 金葉銀杏半同胞子代無性系的葉色和色素含量變化及呈色機制分析

圖版Ⅱ

YU Wanwen, et al: Analyses on changes in leaf color and pigment contents and

coloring mechanism of half-sib progeny clones of golden-leaf ginkgo

Plate Ⅱ

See the explanation at the end of the text

Analyses on changes in leaf color and pigment contents and coloring mechanism of half-sib progeny clones of golden-leaf ginkgo

YU Wanwen1,2, ZHU Zunling1, CAO Fuliang1, ZHOU Chunli1

(1. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China； 2. Jiangsu Sulin Garden Engineering Limited Company, Suqian 223600, China),J.PlantResour. &Environ., 2016, 25(1): 43-53

Differences in leaf color of 32 half-sib progeny clones and parents of ‘Wannianjin’ of golden-leaf ginkgo (GinkgobilobaLinn.) from April to November were compared. Changes in leaf pigment contents and ratios and leaf color parameters of (L*, a* and b*) different color series were compared, correlation between leaf color parameters and leaf pigment contents was analyzed, and ultrastructure of chloroplast of different color series was observed. The results show that 32 half-sib progeny clones are divided into four color series including golden yellow, light yellow, grass green and blue-green. As time goes on, contents of total chlorophyll (Chl), chlorophylla(Chla), chlorophyllb(Chlb) and carotenoid (Car) in leaf of grass green and blue-green color series all appear the trend of “double-peak”, change ranges in ratios of Car/Chl and Car/Chlaboth are smaller; while contents of the above pigments in leaf of golden yellow and light yellow color series appear the trend of “increasing-decreasing-increasing”, and ratios of Car/Chl and Car/Chlagenerally appear the trend of “decreasing rapidly-relatively stable-increasing slowly”. Contents of the above pigments in leaf of different color series during summer all decrease at different degrees, difference in their Car/Chlbratio change is large, and pigment contents of golden yellow and light yellow color series are all lower than those of grass green and blue-green color series. As time goes on, L*, a* and b* values in leaf of golden yellow and light yellow color series and L* and b* values in leaf of grass green and blue-green color series all decrease at first and then increase, while a* value of the latter two color series increases at first and then decreases; and L* and b* values of the first two color series are generally significantly higher than those of the latter two color series, while a* value is generally lower than that of the latter two color series. There are significantly negative correlations of Chlaand Chl contents of golden yellow color series with L* and a* values, while significantly orextremelysignificantlypositivecorrelations of its Car/Chl and Car/Chlaratios with L*, a* and b* values. There is a significantly negative correlation of Chlbcontent of light yellow color series with a* value, and significantly positive correlations of its Car/Chlaratio with L* and b* values and Car/Chlbratio with a* value. There is a significantly negative correlation of Chlacontent of grass green color series with L* value, and significantly positive correlations of its Car/Chlaratio with L* and b* values and Car/Chlbratio with a* value. There is no significant correlation among other indexes in leaf of three color series and among indexes in leaf of blue-green color series. The observation result shows that development of grana lamella in chloroplast of golden yellow and light yellow color series is imperfect, which is visible with a loose arrangement, but without obviously stacking, its distribution is small and sparse. Stacking layers of grana thylakoids in chloroplast of blue-green and grass green color series are more, grana lamella is developed with a compact and regular arrangement, its distribution is large and dense. The comprehensive analysis result indicates that coloring difference and leaf color change of four color series of half-sib progeny clones of ‘Wannianjin’ are controlled by many factors, in which, high ratios of Car/Chl and Car/Chlaand imperfect development of grana lamella in chloroplast are the main reasons for appearing yellow leaf.

golden-leaf ginkgo; leaf color; pigment content; leaf color parameters; ultrastructure; coloring mechanism

10.3969/j.issn.1674-7895.2016.01.06

2015-06-09

江蘇省“雙創(chuàng)計劃”企業(yè)創(chuàng)新類基金項目； 江蘇省“六大人才高峰”項目(2014-NY-045)； 江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(PAPD)

郁萬文(1979—)，男，山東臨沂人，博士，講師，主要從事經(jīng)濟林培育研究工作。

S684.03； S664.3

A

1674-7895(2016)01-0043-11