微泡增強的超聲空化對荷瘤兔乳腺癌作用效果的研究

位紅芹　余美玲　韋英麗　肖妮娜　柳建華

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院超聲科(廣州 510180)

?

微泡增強的超聲空化對荷瘤兔乳腺癌作用效果的研究

位紅芹余美玲韋英麗肖妮娜柳建華

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院超聲科(廣州 510180)

【摘要】目的探討微泡增強的超聲空化對荷瘤兔乳腺癌的治療效果。方法建立兔VX2乳腺癌模型，腫瘤兔隨機分成兩組，超聲微泡組及單純超聲組，各組于治療前及治療后分別行超聲造影，分析造影前后腫瘤灌注情況。結(jié)果超聲微泡組治療前后造影灰階值改變明顯，造影灰階值從治療前的(20.26±2.59)降至(3.71±1.61)(P<0.01)；而單純超聲組腫瘤造影灰階值無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論微泡增強的超聲空化對荷瘤兔乳腺癌有一定的治療效果。

【關(guān)鍵詞】超聲空化微泡乳腺癌

微泡聯(lián)合超聲空化可引起生物組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，從而應(yīng)用于疾病的治療，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)微泡空化能夠有效阻斷兔正常肝、脾血流及腸系膜微血管血流。研究發(fā)現(xiàn)微泡聯(lián)合超聲空化可致腫瘤及其周圍組織中的微小血管破損，阻斷腫瘤區(qū)域新生血管，抑制腫瘤生長[1]。本研究以兔VX2乳腺癌移植瘤為研究對象，采用脈沖式超聲治療儀聯(lián)合靜脈注射微泡方法，并用超聲造影對治療前后乳腺癌腫瘤血流灌注的改變情況進行評價。

1材料與方法

1.1實驗材料①實驗動物：健康新西蘭白兔(雌)10只，平均體重(2.15±0.45)kg，南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。VX2荷瘤種兔購于中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院。②主要試劑與儀器：超聲造影劑為“脂氟顯”脂膜微泡由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院超聲科提供，核心氣體為全氟丙烷，平均粒徑2 μm，微泡濃度為(7～9)×109/mL。新型脈沖式超聲空化治療儀，發(fā)射頻率1 MHz，占空比0.2%，聲壓3 MPa。Philipiu 22超聲診斷儀，9 MHz高頻探頭，配有造影成像模式條件。

1.2實驗方法①荷瘤兔模型建立：將荷瘤兔軟組織內(nèi)VX2腫瘤剪成碎片，置于生理鹽水中，制備成組織塊懸液。新西蘭大白兔10只，每兔無菌條件下局部消毒，取1 mL組織塊懸液分別注射于兔胸壁第2對乳頭墊下，見局部形成隆丘后退針，定期觀察腫瘤生長情況。2～3周后，腫瘤直徑約為1～2 cm，高頻超聲可清晰顯示腫瘤。這項研究已通過當(dāng)?shù)氐膫惱砦瘑T會的批準(zhǔn)，所有的實驗動物是根據(jù)國家衛(wèi)生研究院的規(guī)定和使用的實驗室動物。②實驗分組：10只大白兔分為兩組，超聲微泡空化組及單純微泡組，隨機法每組各5只。

1.3超聲造影使用Philip iu 22彩色超聲診斷儀，12 L線陣探頭，儀器所有條件設(shè)置為同一標(biāo)準(zhǔn)，顯像深度固定，TGC、聚焦范圍等參數(shù)均調(diào)至最佳狀態(tài)。所有荷瘤兔均于空化治療前、后行超聲造影檢查，并對造影動態(tài)圖像進行時間-強度曲線分析。

1.4超聲空化治療2%戊巴比妥麻醉荷瘤兔，并建立耳緣靜脈通道，超聲治療儀探頭置于腫瘤處，按照預(yù)設(shè)條件治療5 min，超聲微泡治療組治療時緩慢推注生理鹽水稀釋的微泡5 mL(0.2 mL/kg)，單純超聲組以5 mL生理鹽水代替微泡。

1.5病理學(xué)檢查完成超聲造影后處死荷瘤兔，取腫瘤組織以10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，行HE染色觀察。

2結(jié)果

2.1VX2荷瘤兔模型建立：10只新西蘭大白兔皮下移植腫瘤20d后可見橢圓形實體腫瘤，腫瘤直徑1.0～2.0 cm。腫瘤生長曲線見圖1。

圖1　腫瘤隨時間增長曲線圖

2.2超聲空化治療前超聲造影圖像可見腫瘤血流豐富，呈高灌注狀態(tài)；超聲微泡組治療后，腫瘤區(qū)域可見片狀充盈缺損，部分腫瘤區(qū)域無明顯造影劑灌注，造影的峰值強度明顯降低(20.26±2.59，3.71±1.61，P<0.05)；單純微泡組治療后，腫瘤區(qū)域造影圖像峰值強度無明顯變化(19.27±2.67，18.79±2.64，P>0.05)。見表1、圖2。

表1　治療前后兩組造影峰值強度比較

注：與治療前比較*P<0.01，#P>0.05

2.3病理檢查結(jié)果光鏡下可見腫瘤組織呈實體狀瘤細胞條索狀排列，細胞核大深染，異型明顯，腫瘤組織內(nèi)血管豐富；超聲微泡治療后可見腫瘤組織出血，血管內(nèi)皮細胞損傷，大量紅細胞外溢(見圖4)。

3討論

乳腺癌作為女性最常見、多發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國呈逐年上升趨勢，發(fā)病年齡趨于年輕[2]，對其有效的治療是延長患者生命、提高生存質(zhì)量的前提。目前臨床治療乳腺癌以手術(shù)為主，對于復(fù)發(fā)性腫瘤患者、腫塊較大患者、不能耐受手術(shù)的患者等，化療是必不可少的治療手段。乳腺癌全身化療時，藥物對目標(biāo)的選擇性不高，在殺傷腫瘤細胞的同時，體內(nèi)一些分裂增殖活躍的正常細胞或組織可能被誤傷，從而出現(xiàn)不同種類或不同程度的副作用，因此尋找一種提高腫瘤組織局部藥物濃度、減少全身化療劑量的方法十分必要。本研究采用脈沖式超聲治療儀聯(lián)合靜脈注射微泡造影劑的方法，探討超聲擊破微泡對荷瘤兔乳腺癌的治療效果。

圖2　治療前后，乳腺癌荷瘤超聲造影時間-強度曲線圖，治療后較治療前明顯降低

圖3　超聲微泡組治療前后造影的峰值強度變化圖像

超聲空化是微氣泡在超聲波作用下被激發(fā)，產(chǎn)生震蕩、膨脹、收縮以及爆破等一系列動力學(xué)過程。研究表明[3-4]，在組織中含有微泡劑時，低劑量超聲即可產(chǎn)生過去高功率超聲才能誘導(dǎo)的空化效應(yīng)，又可避免和減少高強度超聲對周圍正常組織的損傷。微泡造影劑作為空化核，可通過增加空化核的濃度，增強空化效應(yīng)，并減少產(chǎn)生空化效應(yīng)所需的超聲能量。同時超聲激勵微泡空化可直接作用于供應(yīng)腫瘤組織營養(yǎng)的微小血管網(wǎng)，致腫瘤及其周圍組織中的微小血管破損，阻斷腫瘤區(qū)域新生血管，抑制腫瘤生長。近年來，國內(nèi)外已有較多學(xué)者將微泡介導(dǎo)的超聲空化成功用于藥物靶向釋放[5]、提高微血管的通透性[6]、可逆性開放血腦屏障和促大分子物質(zhì)跨血腦屏障轉(zhuǎn)運[7]等。

圖4HE染色結(jié)果顯示(光鏡下×40)，正常腫瘤組織呈實體狀瘤細胞條索狀排列，細胞核大深染，異型明顯，超聲微泡治療后腫瘤組織出血，大量紅細胞外溢。

本研究采用荷瘤兔VX2腫瘤模型，利用脈沖式聚焦超聲，通過經(jīng)靜脈注射一定劑量微泡聯(lián)合超聲空化作用，初步實現(xiàn)了腫瘤微小血管的阻斷作用，表明了微泡增強的超聲空化對荷瘤兔乳腺癌腫瘤的一定作用效果。經(jīng)文獻報道發(fā)現(xiàn)，超聲微泡對局部組織的生物學(xué)作用的影響因素主要有三個方面：①微泡本身的特性，微泡作為外源性的"空化核"可降低空化閾值并且能加大生物學(xué)損害的程度。②發(fā)射超聲本身的參數(shù)，優(yōu)化超聲參數(shù)，在盡量降低不良反應(yīng)的基礎(chǔ)上釋放出更多能量，產(chǎn)生更多的外溢孔，使更多基因或藥物外溢到組織間隙, 提高超聲微泡基因、藥物傳輸效率。③微泡局部濃度及超聲微泡作用的局部環(huán)境，提高靶組織的微泡濃度可提高空化效應(yīng)，另外腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞間隙大，基底膜不完整，為空化效應(yīng)提供了有利的局部環(huán)境。

本研究結(jié)果表明，以發(fā)射頻率1MHz，聲壓3Mpa，占空比0.2%條件下，治療前腫瘤組織呈高灌注狀態(tài)，治療后幾乎腫瘤區(qū)造影灰階值明顯下降，說明該條件下對荷瘤兔腫瘤有一定的空化治療效果。本研究僅設(shè)一個條件下空化作用效果，但為以后不同聲壓下對腫瘤治療效果的研究提供了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 李秋穎，劉政，李佩瓊，等.微泡介導(dǎo)下脈沖式聚焦超聲空化導(dǎo)致血管損傷的實驗研究[J]. 中國超聲醫(yī)學(xué)雜志，2008，24(4):297-299.

[2] SEPAROVIC R,BAN M,SILOVSKA T,et al. Clinical guidelines for diagnosistreatment and monitoring of patients with invasive breast cancrer-croatian oncology socity[J]. Lijec Vjesn.2015,137(5-6):143-149.

[3] XIE B,LI YY,JIA L,et al. Experimental ablation of the pancreas with high intensity focused ultrasound (HIFU) in a porcine model[J]. Int J Med Sci,2010,8(1):9-15.

[4] LIU JH,XIAO SY,WU SZ,et al. Disruptionof splenic circulation using microbubble-enhanced ultrasound and prothrombin: a preliminary study[J]. Ultrasound in Medicine and Biology,2012,38(11):1930-1937.

[5] IWANAGA K,TOMINAGA K,YAMAMOTO K, et al. Local delivery system ofcytotoxic agents to tumors by focused sonoporation[J]. Cancer Gene Therapy,2007,14(4):354-363.

[6] 蕭淑宜，柳建華，區(qū)文財,等．超聲擊破微泡對犬睪丸組織及細胞影像的研究[J]. 中華超聲影像學(xué)雜志，2012，21(8)：723-726.

[7] WANG F,SHI Y,LU L，et al. Targeted delivery of GDNF through the blood-brainbarrier by MRI-guided focusedultrasound[J]. Plos One,2012,7(12):e52925.

基金項目：廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(20131A011001)；廣東省自然科學(xué)基金面上項目(S2013010016277)；廣東省公益研究與能力建設(shè)專項資金項目(2014A020212014)

通信作者：柳建華，E-mai：liujianhua666666@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.02.011

(收稿日期：2016- 01-22)

Experimental study of the effect using microbubbles-enhanced ultrasound cavitation on VX2 breast tumor in rabbits

WeiHongqin，YuMeiling，WeiYingli，etal.

DepartmentofUltrasound,GuangzhouFirstPeople’sHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the treatment effect of microbubbles-enhanced ultrasound cavitation on VX2 breast tumor in rabbits.MethodsThe rabbit model of VX2 breast tumor were established. The rabbits were randomly divided into two groups, microbubbles-enhanced ultrasound (US+MBs) group and standard ultrasound (US) group. The VX2 breast tumor perfusion were imaged and assessed using contrast enhanced ultrasonography (CUES) before and after treatment.Results The contrast enhanced grayscale value (GSV) of VX2 breast tumors decreased significantly in the US+MBs group, from 20.26±0.59(before treatment) to 3.71±.761 (after treatment)(P<0.01). While there was no significance of GSV before and after treatment (P>0.05) in the US group.ConclusionMicrobubble-enhancement ultrasound cavitation has a certain therapeutic effect on the VX2 breast tumor in rabbits.

【Key words】Ultrasound cavitation; Microbubbles; Breast tumor