紫虎燒傷膏抗菌作用的研究

王　霞

郴州市第一人民醫(yī)院(郴州 423000)

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紫虎燒傷膏抗菌作用的研究

王霞

郴州市第一人民醫(yī)院(郴州 423000)

【摘要】目的研究紫虎燒傷膏的抑菌作用強度。方法采用體外試驗測定紫虎燒傷膏的MIC和MBC，紙片法比較紫虎燒傷膏和濕潤燒傷膏對不同代表性菌種抑菌圈大?。粍游飳嶒灡容^紫虎燒傷膏和濕潤燒傷膏用于大鼠Ⅱ度燙傷模型24 h,48 h后創(chuàng)面菌落計數。結果紫虎燒傷膏對金黃色葡萄球菌的MIC(Minimum inhibitory concentration)為8 mg/mL，MBC (Minimum bactericidal concentration)32 mg/mL；對銅綠假單胞菌的MIC為16 mg/mL，MBC32 mg/mL；對大腸桿菌的MIC為16 mg/mL，MBC64 mg/mL。抑菌圈試驗結果顯示，紫虎燒傷膏和濕潤燒傷膏沒有顯著性差異。動物實驗表明，紫虎燒傷膏和濕潤燒傷膏均有不同程度的抑制大鼠Ⅱ度燙傷局部細菌的作用。紫虎燒傷膏的作用更強。用藥時間越長，抑菌效果越明顯。結論紫虎燒傷膏能夠有效抑制Ⅱ度燒燙傷局部細菌，防止燒燙傷創(chuàng)面感染，保護創(chuàng)面，從而起到治療Ⅱ度燙傷的作用。

【關鍵詞】紫虎燒傷膏抗菌作用MIC(最低抑菌濃度)MBC(最低殺菌濃度)抑菌圈試驗

燒傷創(chuàng)面是燒、燙傷感染中明顯而主要的病原菌侵入途徑,燒傷后創(chuàng)面及全身感染是患者致死的主要原因。可以說，感染是直接影響燒、燙傷創(chuàng)面愈合的關鍵?？刂聘腥臼菬齻委熯^程中極其重要的環(huán)節(jié)。局部用藥仍是燒、燙傷治療中控制感染的重要治療手段。紫虎燒傷膏是用于燒傷燙傷治療的正在研發(fā)的醫(yī)院制劑，是采用現代制劑工藝方法研制而成的中藥外用復方制劑,主要由紫草[1]、虎杖等藥等組成,具有清熱解毒、消腫止痛、斂瘡生肌之功效[2]。為了考察紫虎燒傷膏防治燒燙傷后感染的效果，我們通過體外試驗對其對燒傷感染常見致病菌的抗菌活性進行了測定。采用大鼠Ⅱ度燙傷模型對紫虎燒傷膏在活體動物試驗中的抑菌效果進行了試驗考察。試驗經郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會同意并在其監(jiān)督下進行，試驗后動物采用麻醉處死辦法處理。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠生產；SHP-250型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司生產；Air Tech超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司制造。

1.1.2藥品和試劑紫虎燒傷膏，自制，批號20120311；濕潤燒傷膏[3]，汕頭市美寶制藥有限公司生產，批號20111206；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，杭州微生物試劑廠生產；M-H瓊脂培養(yǎng)基，杭州天和微生物試劑有限公司生產。試驗中的藥品均為藥用級，試劑均為分析純級。

1.1.3菌株[4]金黃色葡萄球菌 (ATCC25923)，來自郴州市第一人民醫(yī)院檢驗科；銅綠假單胞菌[5](ATCC22853)，來自郴州市第一人民醫(yī)院檢驗科；大腸桿菌(ATCC25922)，來自郴州市第一人民醫(yī)院檢驗科；標準比濁管，來自郴州市第一人民醫(yī)院檢驗科。

1.1.4實驗動物清潔級SD大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，購自中南大學湘雅醫(yī)學院動物學部，合格證號：SCXK(湘 2012-0002)。

1.2方法

1.2.1供試溶液的制備

1.2.1.1樣品溶液的制備分別取濕潤燒傷膏，紫虎燒傷膏藥物用吐溫80(45℃)攪拌均勻，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液充分乳化，制備成濃度為1.28 g/mL的樣品溶液。

1.2.1.2陰性樣品溶液的制備按樣品溶液制備項下方法不加藥物，同法制成陰性樣品溶液。

1.2.1.3菌液的制備分別接種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃ 恒溫箱培養(yǎng)(20±1)小時，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，調整濃度為0.5麥氏比濁管。用營養(yǎng)肉湯將上述菌懸液進行1∶100稀釋后得到1～2×106CFU/mL的菌液，備用。

1.2.2藥物最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定方法采用試管二倍稀釋法對藥物最小抑菌濃度(MIC)進行測定[6]?；鶅扰囵B(yǎng)法測定最低殺菌濃度。瓊脂擴散打孔法測抑菌圈大小。

1.2.2.1試管二倍稀釋法測定MIC樣品溶液的稀釋、制備及菌液接種 嚴格無菌操作，取3組無菌試管(13×100 mm，每組代表1個菌株)各13支，每組各2個樣品(紫虎燒傷膏，濕潤燒傷膏)共排成一排，除第1，12，13管加入1.8 mL營養(yǎng)肉湯外，其余每管加入營養(yǎng)肉湯1 mL，在第1管加入1.28 g/mL的樣品溶液0.2 mL混勻，第13管加入陰性樣品溶液0.2 mL。然后從第1管吸取1 mL至第2管，混勻后再從第2管吸取1 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1 mL棄去，第12管為不含藥物的菌液陽性生長對照。然后在每管內加入上述制備好的菌液各0.1 mL，使每管最終菌液濃度約為0.5～1×105CFU/mL。第1管至第11管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125 mg/mL。以上各管至35℃培養(yǎng)(22±1)小時，肉眼觀察未發(fā)生混濁的最小藥物濃度為最小抑菌濃度(MIC)。結果見表1。

1.2.2.2基內接種法測最低殺菌濃度(MBC)取試管兩倍稀釋法中無細菌生長管,用無菌操作法分別全部倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中,再分別倒入已融化并冷卻至 45℃～50℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,輕輕搖動培養(yǎng)皿,使菌液與培養(yǎng)基混合均勻,待冷凝后將培養(yǎng)皿翻轉于 35℃培養(yǎng)(36±2)h,觀察結果。以菌落數不超過5個的平板所對應的小試管的最低藥物濃度即為該藥物的最低殺菌濃度(MBC)。結果見表1[7]。

表1　二倍稀釋法測定MIC(mg/mL)、MBC(mg/mL)

1.2.3抑菌圈大小測定用無菌棉拭子蘸取濃度為0.5麥氏比濁管菌液，在管壁上擠壓去掉多余菌液。用棉拭子涂布整個M-H培養(yǎng)基表面，反復幾次，涂均勻。取3組無菌平皿(直徑15 cm，每組代表1個菌株)各5個，每組各2個樣品(紫虎燒傷膏，濕潤燒傷膏)共排成一排，取直徑5 mm左右無菌紙片分別浸泡于紫虎燒傷膏，濕潤燒傷膏樣品溶液，陰性樣品溶液中，浸透。用無菌鑷子取浸透樣品溶液的紙片貼在平板表面。每個平板貼4張紙片，其中3張為同一樣品溶液紙片，另外一張為陰性樣品溶液紙片。每張紙片間距不少于24 mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15 mm。將平板反轉，35℃孵育(20±2)h小時后取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。(用ATCC 25922大腸桿菌(Escherichia coli)做質控。只有當質控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內測試菌株的結果才可以報告)。結果見表2。

菌種n紫虎燒傷膏濕潤燒傷膏金黃色葡萄球菌1512.58±0.5112.44±0.82銅綠假單胞菌158.04±0.508.45±0.88大腸桿菌1511.05±1.7510.94±1.38

注：與濕潤燒傷膏比較，P>0.05，二者抑菌圈試驗無差異。

1.2.4大鼠感染性Ⅱ度燙傷模型創(chuàng)面抑菌試驗50只體重180～220 g大鼠于實驗前24 h,用硫化鈉脫毛,面積約30 cm2,用戊巴比妥鈉(30 mg /kg)腹腔麻醉,浸入100℃水浴槽孔(面積約30 cm2)內持續(xù)燙15 s,造成約10%Ⅱ度燙傷創(chuàng)面。傷后5 min,用苦味酸劃出創(chuàng)面邊界,計算面積,立即腹腔注射5%葡萄糖鹽水復蘇。并取經培養(yǎng)制備濃度為1. 0×108cfu/mL金黃色葡萄球菌0.5 mL,均勻涂布于創(chuàng)面上。將50只大鼠隨機分為5組,即濕潤燒傷膏組,紫虎燒傷膏低中高0. 524、1.048、2.096 g/g3個劑量組及賦形劑組。于動物傷后10 min分別對燙傷局部施以相應外用藥并予以包扎。各治療組每日換藥一次,于感染后24 h、48 h各采樣一次作創(chuàng)面菌落計數。采樣時,用3只消毒無菌棉簽輕浸漬肉湯并擠干,先后由創(chuàng)面一側向另側滾動均勻涂抹創(chuàng)面一次,并立即置入盛5 mL無菌肉湯培養(yǎng)液中。將標本充分振蕩80～100次,用無菌吸管吸取1 mL至9 mL 1%蛋白胨水稀釋液中混勻,按此法連續(xù)稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5倍,吸取每一稀釋液分別注入到3個滅菌平皿內,每皿1 mL。將熔化并冷卻到45～50℃的營養(yǎng)瓊脂注入平皿,每皿15 mL,以另一不加標本的空白皿作為對照。轉動平皿使標本與菌液充分混合均勻,待凝固后,翻轉平皿并于35℃孵育(22±2)h,觀察結果,計數菌落,以求得標本中所含活菌數。并折算出單位創(chuàng)面面積所含細菌菌落數。以t檢驗測定各治療組與賦形劑對照組組間的差異顯著性。同時進行3個治療劑量組間等效性分析。

表2　大鼠Ⅱ度燙傷模型創(chuàng)面菌落計數表

注:△與濕潤燒傷膏組相比，有顯著性差異(P<0.05)；*與賦形劑組相比，有極顯著差異(P<0.01)

2討論

2.1二倍稀釋法測量藥物的MIC試驗中陽性菌試驗管和陰性樣品溶液試驗管試驗菌生長良好，可以排除菌種因素和賦形劑對實驗結果的影響。

2.2紙片法測定分別紫虎燒傷膏和濕潤燒傷膏的抑菌圈大小，結果表明二者之間對3種試驗菌均有一定抑制作用，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑大于銅綠假單胞菌抑菌圈直徑，抑菌效果更明顯。兩種藥物對3種菌種抑菌圈大小比較，沒有顯著差異。

2.3動物創(chuàng)傷模型活體用藥后24 h、48 h分別計量創(chuàng)面菌落數，結果表明紫虎燒傷膏低中高劑量組對創(chuàng)面均有明顯抑制細菌生長的作用，與賦形劑對照組比較有顯著性的差異。隨著創(chuàng)面用藥時間延長，抑菌效果更顯著。紫虎燒傷膏中高劑量組染菌24 h后菌落計數與濕潤燒傷膏組(劑量與紫虎燒傷膏中劑量組相當)比較有顯著差異，紫虎燒傷膏高中低3個劑量組之間組間劑量等效性結果分析表明，除低劑量組抑菌效果較差外，其余2個劑量組基本等效?？梢圆捎弥袆┝拷M配比給藥。

2.4紫虎燒傷膏是純中藥制劑，對2度燒燙傷抑菌效果明顯，且隨著用藥時間的延長效果更好。這對于保護創(chuàng)傷組織，促進創(chuàng)面愈合具有重要作用。

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DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.02.010

(收稿日期：2015-11-16)

Study on the antibacterial effect of purple tiger burn ointment

WangXia.

ChenzhouFirstPeople’sHospital,Chenzhou423000,China

【Abstract】ObjectiveTo study the antibacterial effect of the purple tiger burn ointment.MethodsThe MIC and MBC were determined by using in vitro test. Comparison of the inhibition zone size of the different representative strains of the purple tiger burn ointment and the moist burn ointment were made, the animal experiment was used to compare the colony count of the wound of the rat model of second degree scald after 24 h, 48 h with the purple tiger burn ointment and the moist burn ointment.ResultsMIC(Minimum inhibitory concentration)of purple tiger burn ointment on Staphylococcus aureus was 8 mg/mL, MBC(Minimum bactericidal concentration ) of purple tiger burn ointment on Staphylococcus aureus was 32 mg/mL; MIC of purple tiger burn ointment on Pseudomonas aeruginosa was 16 mg/mL, MBC of purple tiger burn ointment on Pseudomonas aeruginosa was 32 mg/mL, MIC of purple tiger burn ointment on Escherichia coli was 16 mg/mL, MBC of purple tiger burn ointment on Escherichia coli was 64 mg/mL. The results showed that there was no significant difference between the purple tiger burn ointment and the moist burn ointment. Animal experiments showed that the purple tiger burn ointment and the moist burn ointment had different degrees of inhibition of the role of local bacteria in the second degree scald in rats. Purple tiger burn cream showed stronger function. The longer the time took, the more obvious the antibacterial effect was.ConclusionThe purple tiger burn ointment can effectively inhibit the second degree burn of local bacteria, prevent the wound infection and protect the wound, so as to play a role in the treatment of second degree scald.

【Key words】The purple tiger burn ointment; Antibacterial action; MIC (minimum inhibitory concentration); MBC (minimum bactericidal concentration); Antibacterial circle test