小腦延髓池注射納洛酮對(duì)心肺復(fù)蘇大鼠腦組織c-Fos mRNA及蛋白表達(dá)的影響

朱明輝　陸婉暉　黎靖麟　成秋生　胡廣奮　劉四紅　鄧穗德　喻寧芳

廣州市第一人民醫(yī)院急診內(nèi)科(廣州 510180)

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小腦延髓池注射納洛酮對(duì)心肺復(fù)蘇大鼠腦組織c-Fos mRNA及蛋白表達(dá)的影響

朱明輝陸婉暉黎靖麟成秋生胡廣奮劉四紅鄧穗德喻寧芳

廣州市第一人民醫(yī)院急診內(nèi)科(廣州 510180)

【摘要】目的探討小腦延髓池注射納洛酮對(duì)心肺復(fù)蘇大鼠腦神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制。 方法將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、常規(guī)復(fù)蘇組和納洛酮復(fù)蘇組。采用窒息法建立大鼠心臟驟停模型，復(fù)蘇的同時(shí)給予藥物治療?；謴?fù)自主循環(huán)(ROSC)后24 h取腦組織，熒光定量PCR法檢測(cè)腦組織c-Fos mRNA表達(dá)水平，免疫組化法檢測(cè)腦組織c-Fos蛋白的表達(dá)。結(jié)果與常規(guī)復(fù)蘇組比較，納洛酮可顯著降低大鼠腦組織c-Fos mRNA及蛋白表達(dá)量(P<0.01)。 結(jié)論小腦延髓池注射納洛酮可及時(shí)有效的作用于c-Fos基因，發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】小腦延髓池納洛酮心肺復(fù)蘇腦缺血再灌注c-Fos基因

納洛酮是非競(jìng)爭(zhēng)性阿片肽受體拮抗劑，已在臨床廣泛應(yīng)用于救治顱腦外傷、 腦缺血、休克、呼吸衰竭等。它可以特異性地阻斷β內(nèi)啡肽(β-EP)的毒性作用，并通過非阿片受體樣作用增加心肺復(fù)蘇的成功率，如興奮延髓的呼吸中樞，穩(wěn)定細(xì)胞膜對(duì)Ca+的通透性，解除胞內(nèi)Ca2+超載，對(duì)腦組織及神經(jīng)發(fā)揮一定的保護(hù)作用[1-2]。傳統(tǒng)的給藥方法易受血腦屏障的影響，而影響心肺復(fù)蘇的效果。小腦延髓池注射給藥可使藥物通過局部作用或其他的局部滲透方法到達(dá)腦組織發(fā)揮作用，避免了血腦屏障的影響。

研究認(rèn)為c-fos是神經(jīng)元內(nèi)的一種原癌基因，當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，c-fos 的基因和蛋白均產(chǎn)生表達(dá)。c-fos 作為內(nèi)源性傷害因子，其表達(dá)程度是經(jīng)元的損傷程度的標(biāo)志[3]。前期研究表明[4]小腦延髓池注射納洛酮對(duì)心肺復(fù)蘇大鼠腦組織的保護(hù)效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的治療藥物腎上腺素。本研究采用窒息法建立大鼠心臟驟停模型，探討腦缺血再灌注損傷后，小腦延髓池注射納洛酮對(duì)腦缺血后即早基因c-fos基因及蛋白表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1藥品納洛酮注射液(2 mg/2 mL，貴州景峰注射劑有限公司)；腎上腺素注射液(1 mg/mL，福州海王福藥制藥有限公司)。

1.2動(dòng)物SD大鼠，雄性，SPF級(jí)別，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(粵)2013-0020，于廣州市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心中飼養(yǎng)，喂以標(biāo)準(zhǔn)的顆粒飼料，正常飲水。本實(shí)驗(yàn)由廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)監(jiān)督，符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則，符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)規(guī)定。

1.3儀器與與試劑Rabbit Anti-c-fos antibody(北京博奧森生物科技有限公司，bs-10172R)SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20150204)；微量丙二醛(MDA)試劑盒)(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20150131)；即用型UItraSensitive s-p超敏試劑盒(兔)(購自邁新生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：KIT-9706)；DAB顯色試劑盒(購自邁新生物科技有限公司，貨號(hào)：DAB-0031)；高純總RNA快速提取試劑盒(離心柱型，takara，批號(hào)：RP1201)；Recombinant DNase I (RNase-free)(takara，批號(hào)：2270A)；Recombinant Ribonuclease Inhibitor(takara，批號(hào)：2313A)；Oligo d(T)18 Primer(takara，批號(hào)：3806)；Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) (takara, 批號(hào)：2641A)；dNTP Mixture(takara，批號(hào)：T4019)；A100PCR儀(LongGene)；GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD)；JY200C電泳儀(君意)；5804R低溫離心機(jī)(Eppendorf)。

1.3動(dòng)物分組取雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、常規(guī)復(fù)蘇組、納洛酮處理組共3組，10只/組。各組大鼠在體質(zhì)量、基線血壓和心臟脈搏等生理參數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4模型制備及給藥手術(shù)前將SD大鼠禁食不禁水12 h，以10 %水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉。常規(guī)復(fù)蘇組及納洛酮處理組采用夾閉氣管窒息法建立大鼠心跳驟停模型[4-5]并進(jìn)行心肺復(fù)蘇，假手術(shù)組不予以夾管窒息和心肺復(fù)蘇。心跳驟停2 min后，采用Utstein模式[6]進(jìn)行心肺復(fù)蘇，開放夾閉的氣管，接動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，并進(jìn)行胸外按壓復(fù)蘇(按壓頻率160次/min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑的1/3)。復(fù)蘇的同時(shí)，各組大鼠給藥治療，常規(guī)復(fù)蘇組靜脈注射腎上腺素注射液0.2 mg/kg[7]；納洛酮處理組小腦延髓池穿刺注射納洛酮注射液2 mg/kg。假手術(shù)組作為對(duì)照靜脈注射生理鹽水。待自主呼吸完全恢復(fù)后，停止按壓，縫合傷口，并放回飼養(yǎng)籠中。

1.5q-PCR法檢測(cè)腦組織c-Fos mRNA表達(dá)取大鼠腦組織，剪取50 mg，加入適量Trizol勻漿，按照試劑說明書提供的參考步驟制備總RNA，經(jīng)SmartSpec plus核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定 OD260/OD280比值，要求比值在2.0左右，并計(jì)算RNA 濃度。將總 RNA 依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-PCR的引物、內(nèi)參配置及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)按照Invitrogen公司說明進(jìn)行，c-Fos的引物序列是：Forward primer：CCT TCA GCA CAG ATT GCG AC ，Reverse primer：CAC GTT TGG AAG AGC AAG CC，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為330 bp；內(nèi)參GAPDH的引物序列是：Forward primer：AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT，Reverse primer：GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為150 bp。反應(yīng)體系為20 μL，Rotor-Gene QPCR儀上反應(yīng)。反應(yīng)條件是94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的延伸階段收集熒光信號(hào)，將檢測(cè)的臨界點(diǎn)設(shè)定在PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)值，即CT值，記錄下其數(shù)值，得到相應(yīng)的擴(kuò)增曲線。并利用反應(yīng)儀和電腦記錄基因的熔解曲線。以假手術(shù)組為對(duì)照組，應(yīng)用2-⊿⊿Ct相對(duì)定量法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間c-Fos mRNA基因表達(dá)的差異。PCR 產(chǎn)物在 12 % 瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)分析驗(yàn)證。

1.6免疫組化法檢測(cè)腦組織c-Fos蛋白表達(dá)ROSC后 24 h，用乙醚麻醉大鼠，取腦組織，固定于4 %多聚甲醛溶液中。經(jīng)切片、脫蠟，用枸櫞酸櫞抗原修復(fù)液修復(fù)過氧化酶孵育15 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；PBS沖洗，非免疫性動(dòng)物血清孵25 min，加50 μl anti-c-fos antibody (1:100) 4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次，每次10 min；加50 μl生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育30 min。PBS沖洗3次，每次10 min；加50 μl鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育15 min。 PBS沖洗3次每次10 min；加入DAB溶液蘇木素復(fù)染組織脫水封片顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照組以PBS代替一抗。在高倍視野下(10×40)，觀察各組大鼠腦海馬組織。胞核有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞，選取5個(gè)高倍視野統(tǒng)計(jì)分析陽性細(xì)胞的百分率。陽性細(xì)胞百分率=陽性細(xì)胞數(shù) /(陽性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))×100 %。

2結(jié)果

2.1對(duì)c-Fos mRNA表達(dá)的影響結(jié)果顯示，常規(guī)復(fù)蘇組c-Fos mRNA表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；納洛酮復(fù)蘇組c-Fos mRNA表達(dá)量顯著高于常規(guī)復(fù)蘇組(P<0.01)(c-Fos mRNA相對(duì)表達(dá)量假手術(shù)組1，常規(guī)復(fù)蘇組1.47±0.01，納洛酮復(fù)蘇組1.12±0.09)。圖1為各組大鼠腦組織c-Fos mRNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。

圖1　各組大鼠腦組織c-Fos mRNA PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2對(duì)c-Fos蛋白表達(dá)的影響結(jié)果顯示，常規(guī)復(fù)蘇組較假手術(shù)組c-Fos蛋白表達(dá)量增加(見圖2)，陽性細(xì)胞率(%)顯著升高(P<0.01)；納洛酮復(fù)蘇組較常規(guī)復(fù)蘇組c-Fos蛋白表達(dá)量降低(見圖2)，陽性細(xì)胞率(%)顯著降低(P<0.01)(陽性細(xì)胞率%：假手術(shù)組6.6±2.70，常規(guī)復(fù)蘇組69.8±9.42，納洛酮復(fù)蘇組32.2±7.42)。

3討論

c-fos基因定位于細(xì)胞核，是一種即刻早期基因。研究發(fā)現(xiàn)多種刺激因子，如缺氧、光線刺激、機(jī)械刺激、疼痛刺激等均可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中c-fos基因的表達(dá)，且其在腦功能活動(dòng)時(shí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控過程中起到重要作用[8]。當(dāng)細(xì)胞受到缺氧刺激時(shí)，胞核內(nèi)的c-fos基因被激活，轉(zhuǎn)錄形成mRNA，并最終進(jìn)入細(xì)胞漿，翻譯合成分子量為55kD的核磷蛋白，即Fos蛋白。Fos蛋白經(jīng)過磷酸化修飾后返回胞核與Jun/AP-1蛋白通過各自的α螺旋區(qū)以光價(jià)鍵結(jié)合形成亮氨酸拉鏈。Fos-Jun/Ap-l復(fù)合物與目的基因結(jié)合，激活其轉(zhuǎn)錄活性。因此，c-fos被認(rèn)為是介導(dǎo)外界刺激，傳遞信息引起細(xì)胞病理反應(yīng)的第三信使[9]。

圖2各組大鼠腦組織c-Fos蛋白表達(dá)量(A：假手術(shù)組c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)較少見；B：常規(guī)復(fù)蘇組c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)較多，如箭頭所示，神經(jīng)元細(xì)胞的胞核及胞漿被染為棕黃色，Original magnification:×400)

低水平的c -fos表達(dá)，可直接參與神經(jīng)元的分化、 生長(zhǎng)、 學(xué)習(xí)記憶以及神經(jīng)突觸的可塑性變化等多種生理過程[10]。而高表達(dá)的c -fos 可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害。心肺復(fù)蘇后腦神經(jīng)細(xì)胞c-fos表達(dá)量增多，引起受體依賴的 Ca2+細(xì)胞內(nèi)流，而Ca2+細(xì)胞內(nèi)超載被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的最后共同通路。鈣超載學(xué)說認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)超載的Ca2+大量聚集在線粒體，導(dǎo)致線粒體腫脹、功能失調(diào)，進(jìn)一步導(dǎo)致ATP合成障礙[11]，當(dāng)Ca2+超載到一定程度可激活多種酶，從而引起細(xì)胞功能紊亂、壞死。另一方面，Ca2+超載還可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管源性的腦水腫[12]，是心臟停搏心肺復(fù)蘇后腦損傷的初始因素。本研究也發(fā)現(xiàn)常規(guī)復(fù)蘇組c-Fos mRNA及蛋白表達(dá)量均較假手術(shù)組升高，而小腦延髓池注射納洛酮可顯著降低腦組織c-Fos mRNA及蛋白表達(dá)水平。本研究表明小腦延髓池注射納洛酮可及時(shí)有效的作用于腦神經(jīng)細(xì)胞的c-fos基因，從而發(fā)揮腦神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。該方法在動(dòng)物模型上具有一定的可行性及可操作性，對(duì)今后急救醫(yī)療和臨床搶救，特別是心肺腦復(fù)蘇有一定的指導(dǎo)意義。

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基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B022000028)

通信作者：朱明輝，E-mail：Minghui_z@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.02.002

(收稿日期：2015-01-12)

Effects of naloxone injected into cisterna magna on expression of c-Fos proteins and c-Fos mRNA in brain tissues of rats following cardiopulmonary resuscitation

ZhuMinghui,LuWanhui,LiJinglin,etal.

DepartmentofEmergency,GuangzhouFirstPeople’sHospital,Guangzhou510180,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the neuroprotective mechanism of naloxone injected into cisterna magna on cerebral ischemia-reperfusion.MethodsThirty adult male SD rats were randomly divided into sham group, conventional cardiopulmonary resuscitation (CPR) group and naloxone CPR group. Asphyxiation was used to set up rat cardiac arrest model, and corresponding drugs were given when the resuscitation was carried out. The Brain tissues were taken at 24 h after restoration of spontaneous circulation (ROSC). Fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) and immunohistochemical was used to detect the expression of c-Fos proteins was used to detect the expression of c-Fos mRNA level.ResultsCompared with the conventional CPR group, Naloxone could significantly decrease the expression of c-Fos protein and c-Fos mRNA in rat brain.ConclusionNaloxone injected into cisterna magna can promptly and effectively act on c-Fos gene, playing a neuroprotective role.

【Key words】Cisterna magna; Naloxone; Cardiopulmonary resuscitation; Cerebral ischemia and reperfusion; c-Fos