17味中藥對(duì)豚鼠皮膚TNF-α、IL-10作用的影響

姜麗莎，張曉東，張國斌，張慶瑞，王強(qiáng)（.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，錦州 00；.解放軍第0醫(yī)院，沈陽 0003）

17味中藥對(duì)豚鼠皮膚TNF-α、IL-10作用的影響

姜麗莎1，張曉東2，張國斌2，張慶瑞2，王強(qiáng)2
（1.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，錦州 121001；2.解放軍第202醫(yī)院，沈陽 110003）

目的探討17味中藥對(duì)豚鼠皮膚腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）的調(diào)節(jié)作用。方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分4組，17味中藥乙醇提取液為實(shí)驗(yàn)組，8-甲氧補(bǔ)骨脂素（8-MOP）、75%乙醇為陽性及陰性對(duì)照組，均涂于豚鼠皮膚上，40 d后取皮膚標(biāo)本免疫組化染色，測TNF-α、IL-10平均光密度，比較其作用結(jié)果。結(jié)果當(dāng)歸、甘草、枸杞、紅花、女貞子、首烏、益母草、黑芝麻、梔子對(duì)TNF-α表達(dá)下調(diào)；甘草、枸杞、合歡皮、黃芪、女貞子、沙參、沙苑子、菟絲子、黑芝麻對(duì)IL-10表達(dá)上升，其中甘草、枸杞、女貞子、黑芝麻對(duì)TNF-α、IL-10均表現(xiàn)正向調(diào)節(jié)作用；合歡皮、黑桑葚對(duì)TNF-α表達(dá)上調(diào)，旱蓮草、黑桑葚使IL-10表達(dá)下降，出現(xiàn)負(fù)向調(diào)節(jié)作用。結(jié)論通過中藥對(duì)TNF-α、IL-10調(diào)節(jié)作用探討，為研制治療白癜風(fēng)的有效組方提供可靠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

中藥；豚鼠；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-10；白癜風(fēng)

目前認(rèn)為白癜風(fēng)（Vitiligo）是多基因遺傳的自身免疫性疾病，多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子參與了疾病的發(fā)生。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在皮膚中主要由角質(zhì)形成細(xì)胞分泌，具有顯著抑制黑素細(xì)胞增殖和降低酪氨酸酶活性的作用［1-2］。白細(xì)胞介素（IL）-10是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其可能通過影響細(xì)胞因子合成，參與白癜風(fēng)發(fā)?。?］。

中醫(yī)藥治療白癜風(fēng)有悠久的歷史，我們依據(jù)疏肝解郁、活血祛風(fēng)辨證理論為法則組方，紅花復(fù)方制劑治療白癜風(fēng)，取得良好效果［4］，本研究觀察該制劑中的17味中藥乙醇提取液對(duì)豚鼠皮膚TNF-α與IL-10的作用，以探討其作用機(jī)制并為最佳組方提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物棕黃色豚鼠24只（遼寧長生生物技術(shù)有限公司），體質(zhì)量350 g左右，雌雄各半兼用。

1.1.2試劑0.1%8-甲氧補(bǔ)骨脂素（8－MOP）-甲氧沙林（重慶華邦制藥有限公司，批號(hào)H50021839），即用型免疫組化SP試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），兔抗鼠IL-10多克隆抗體和兔抗鼠TNF-α多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3主要儀器中藥粉碎機(jī)（ST-10B，永康市帥通工具有限公司），電子稱（BS124S，德國賽多利斯集團(tuán)），超聲機(jī)（KQ-400DB，昆山市超聲儀器有限公司），自動(dòng)組織脫水機(jī)、烤片機(jī)、生物組織包埋冷凍機(jī)（天津天利航空機(jī)電有限公司），共覽顯微鏡（DMD108），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.2方法

1.2.1藥物制備黃芪、當(dāng)歸、白芷、女貞子、枸杞、菟絲子、沙苑子、旱蓮草、首烏、沙參、黑芝麻、黑桑葚、益母草、甘草、合歡皮、紅花、梔子17味中藥，80℃烘干粉碎，20目篩出取粗粉10 g，分別用75%乙醇100 mL，室溫密閉浸泡24 h，超聲提取2 h，濾過，即得濃度為0.1 g/mL的中藥提取液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分中藥實(shí)驗(yàn)組，8-MOP陽性對(duì)照組，75%乙醇陰性對(duì)照組。取豚鼠24只，隨機(jī)分4組，每組6只。每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部取6個(gè)3 cm×3 cm相隔離區(qū)域剪毛，暴露皮膚，以便涂擦藥物。外用中藥提取液分別涂擦每個(gè)隔離脫毛區(qū)，并每只均涂0.1%8-甲氧補(bǔ)骨脂素酊與75%乙醇做陽性、陰性對(duì)照。涂豚鼠脫毛區(qū)，每次用0.5 mL，2次/d，連續(xù)40 d。在涂藥時(shí)要反復(fù)擦，盡量使之滲透。各組涂藥后1h，日光燈照射15 min（功率40 W，距離30 cm）。每組豚鼠每3天脫毛1次。

1.2.3取材末次給藥后1 h，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20%烏拉坦麻醉（0.5 mL/100 g），用藥部位中心取1 cm×1 cm皮膚。皮膚標(biāo)本給予10%甲醛固定石蠟包埋。

1.2.4結(jié)果測定及判定測定TNF-α與IL-10水平按試劑盒說明操作。TNF-α和IL-10標(biāo)記陽性的切片為表皮細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，見圖1、2，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍（×40倍物鏡）視野觀察，并采圖測量光密度值。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件處理系統(tǒng)測定視野中表皮層中陽性細(xì)胞平均光密度。

圖1　梔子在豚鼠表皮TNF-α表達(dá)陽性（SP染色×40）

圖2　黑芝麻在豚鼠表皮IL-10表達(dá)陽性（SP染色×20）

2　結(jié)果

2.1TNF-α與IL-10陽性細(xì)胞主要分布于表皮基底層、棘層、顆粒層，少數(shù)陽性細(xì)胞分布在真皮淺層。

2.217味中藥對(duì)TNF-α的影響對(duì)TNF-α下調(diào)：當(dāng)歸、甘草、枸杞、紅花、女貞子、首烏、黑芝麻、梔子與75%乙醇對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；益母草與75%乙醇對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)TNF-α上調(diào)：合歡皮、黑桑葚與75%乙醇對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)TNF-α無影響：白芷、旱蓮草、黃芪、沙參、沙苑子、菟絲子與75%乙醇對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.317味中藥對(duì)IL-10影響IL-10上升：甘草、枸杞、合歡皮、黃芪、女貞子、沙參、沙苑子、菟絲子、黑芝麻與75%乙醇對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；IL-10下降：旱蓮草、黑桑葚與75%乙醇對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；對(duì)IL-10無影響：白芷、當(dāng)歸、紅花、首烏、益母草、梔子與75%乙醇對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

3　討論

白癜風(fēng)的發(fā)生和發(fā)展與自身免疫系統(tǒng)各個(gè)方面、各個(gè)環(huán)節(jié)存在密切的聯(lián)系，而機(jī)體的免疫應(yīng)答大部分經(jīng)由細(xì)胞因子調(diào)控，所以細(xì)胞因子與白癜風(fēng)的發(fā)病關(guān)系就顯得尤為重要。目前以機(jī)體內(nèi)各種細(xì)胞因子之間的相互調(diào)節(jié)和影響為特點(diǎn)的免疫學(xué)說受到廣泛重視［5-6］。

表1　不同17味中藥對(duì)TNF-α與IL-10在豚鼠皮膚中的表達(dá)作用?。ā纒）

表1　不同17味中藥對(duì)TNF-α與IL-10在豚鼠皮膚中的表達(dá)作用?。ā纒）

注：與75%乙醇對(duì)照組比較，正向作用：*P＜0.05，**P＜0.01；負(fù)向作用：△P＜0.05，△△P＜0.01。

藥品　n　TNF-α平均光密度　IL-10平均光密度75%乙醇　6　1.47±0.13　0.54±0.12甲氧沙林　6　1.30±0.15**　0.68±0.12**白芷　6　1.34±0.18　0.44±0.10當(dāng)歸　6　1.26±0.17**　0.46±0.15甘草　6　1.30±0.19**　0.69±0.07**枸杞　6　1.03±0.16**　0.70±0.13**旱蓮草　6　1.43±0.15　0.33±0.10△△合歡皮　6　1.54±0.16△　0.70±0.12**紅花　6　1.33±0.21**　0.50±0.09黃芪　6　1.53±0.17　0.67±0.06**女貞子　6　1.20±0.15**　0.70±0.11**黑桑葚　6　1.53±0.15△　0.35±0.19△△沙參　6　1.47±0.16　0.70±0.10**沙苑子　6　1.47±0.17　0.73±0.07**首烏　6　1.19±0.25**　0.48±0.09菟絲子　6　1.34±0.22　0.67±0.08**益母草　6　1.40±0.24*　0.52±0.21黑芝麻　6　1.22±0.14**　0.65±0.07**梔子　6　1.17±0.20**　0.56±0.13

TNF-α在皮膚中能夠顯著地降低黑素細(xì)胞活力，減少黑素細(xì)胞增殖及黑素細(xì)胞酪氨酸酶和酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1的含量［7］。研究表明白癜風(fēng)患者皮損內(nèi)TNF-α表達(dá)高于正常人皮膚，并表現(xiàn)出對(duì)黑素細(xì)胞增殖的抑制作用，且與濃度呈正相關(guān)，即濃度越高，抑制作用越明顯［8］，同時(shí)可對(duì)黑素細(xì)胞造成免疫攻擊，從而導(dǎo)致色素脫失［9-10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)歸、甘草、枸杞、紅花、女貞子、首烏、益母草、黑芝麻、梔子對(duì)豚鼠TNF-α起下調(diào)作用，可有效地降低TNF-α濃度，減少對(duì)黑素細(xì)胞增殖的抑制作用，在一定程度上增加了酪氨酸酶活性，提高黑素細(xì)胞活力，促使黑素細(xì)胞增殖。

IL-10是近年來發(fā)現(xiàn)的一種與Th2免疫應(yīng)答密切相關(guān)的負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，主要來源于Th2細(xì)胞、B細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞的分泌，幾乎能夠抑制所有細(xì)胞因子的合成與釋放，是目前發(fā)現(xiàn)的重要免疫抑制性因子之一［11-12］。Tahers等［13］研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者血漿中IL－10水平顯著低于正常對(duì)照組，說明白癜風(fēng)的發(fā)病可能與IL－10的下降相關(guān)。甘草、枸杞、合歡皮、黃芪、女貞子、沙參、沙苑子、菟絲子、黑芝麻在實(shí)驗(yàn)中對(duì)IL-10起到上升調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫和炎癥抑制作用，并抑制巨噬細(xì)胞的活化，通過影響細(xì)胞因子合成而影響白癜風(fēng)的發(fā)展。實(shí)驗(yàn)中，甘草、枸杞、女貞子、黑芝麻對(duì)TNF-α、IL-10均表現(xiàn)出正向調(diào)節(jié)作用，提示這4味中藥在提高酪氨酸酶活性，黑素細(xì)胞活力、黑素細(xì)胞增殖以及免疫細(xì)胞因子合成與釋放中起到重要作用，可作為治療白癜風(fēng)組方主要成分。實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，合歡皮、黑桑葚對(duì)TNF-α起著上調(diào)作用，旱蓮草、黑桑葚使IL-10下降，出現(xiàn)負(fù)向作用，其作用機(jī)制不清，有待于深入研究。

中藥作用機(jī)制與途徑復(fù)雜，但某些中藥可以通過免疫與炎癥反應(yīng)降低TNF-α濃度或使IL-10濃度增加而起到治療作用。筆者通過中藥對(duì)TNF-α、IL-10免疫調(diào)理作用的研究將中藥篩選，可為今后中藥的有效組方選擇提供可靠的依據(jù)，進(jìn)而為提高白癜風(fēng)的臨床診療水平帶來新的希望。

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Effects of 17 Kinds of Traditional Chinese Medicine on Tumor Necrosis Factor-α and Interleukin-10 in Guinea Pig Skin

Jiang Lisha1，Zhang Xiaodong2，Zhang Guobin2，Zhang Qingrui2，Wang Qiang2
1.The Medical College of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China；2.The 202 Military Medical University of Chinese PLA，Shenyang 110003，China

ObjectiveIn order to study effects of the 17 kinds of traditional Chinese medicine（TCM）on tumor necrosis factorα（TNF-α），Interleukin-10（IL-10）in guinea pig skin.MethodsThe rats were divided into four groups randomly，17 kinds of herbal extract in alcohol for the experimental group，8-methoxypsoralen（8-MOP）and 75%ethanol for positive group and negative group，coated on the skin of guinea pigs，forty days later cut off sample skin and process it with immunohistochemical staining，measured the mean optical density of TNF-α and IL-10，and compared the results.Results The expression of TNF-α was decreased in angelica，liquorice，wolfberry，safflower，ligustrum lucidum ait，polygonum multiflorum，herba leonuri，black sesame and gardenia.The expression of IL-10 was increased in liquorice，wolfberry，albizia，astragals，Ligustrum lucidum ait，adenophora，complanatus，semen cuscutae and black sesame.Among them，liquorice，wolfberry，ligustrum lucidum ait and black sesame had a positive effect on the expression of TNF-α and IL-10.The high expression of TNF-α in albizia and black mulberry and the low expression of IL-10 in eclipta and black mulberry had negative effects.ConclusionThe Chinese medicine regulating effect on TNF-α and IL-10 study provide reliable experimental data for the development of effective prescription for the treatment of vitiligo.

Traditional Chinese medicine；Guinea pigs；Tumor necrosis factor-α；Interleukin-10；Vitiligo

R285.5

A

1672－0709（2016）03-0169－03

遼寧省自然科學(xué)基金（201102231）

張曉東，E-mail:zhangxiaodong_202@163.com

2015-04-02）