棘白菌素對(duì)念珠菌體外藥敏試驗(yàn)產(chǎn)生“矛盾現(xiàn)象”的分析

曾　吉，金　策，黃舟瑩，李　辰，王瑞琦

(1.湖北省武漢市普愛醫(yī)院檢驗(yàn)科　430033；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，武漢430031)

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棘白菌素對(duì)念珠菌體外藥敏試驗(yàn)產(chǎn)生“矛盾現(xiàn)象”的分析

曾吉1，金策1，黃舟瑩2，李辰2，王瑞琦2

(1.湖北省武漢市普愛醫(yī)院檢驗(yàn)科430033；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，武漢430031)

摘要:目的觀察棘白菌素對(duì)念珠菌的“矛盾現(xiàn)象”。方法體外藥敏試驗(yàn)中，采用微量稀釋法分別觀察卡泊芬凈和米卡芬凈對(duì)180株念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)和“矛盾現(xiàn)象”。結(jié)果卡泊芬凈對(duì)白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌均產(chǎn)生“矛盾現(xiàn)象”，發(fā)生率分別為66.0%、77.5%、55.0%和35.0%，各菌矛盾現(xiàn)象的起點(diǎn)/終點(diǎn)中位數(shù)濃度分別為8/32、16/32、8/32、4/16 μg/mL；米卡芬凈只對(duì)白色念珠菌和熱帶念珠菌產(chǎn)生“矛盾現(xiàn)象”，發(fā)生率分別為45%和67.5%，各菌矛盾現(xiàn)象的起點(diǎn)/終點(diǎn)中位數(shù)濃度分別為4/16、8/32 μg/mL。結(jié)論“矛盾現(xiàn)象”的產(chǎn)生存在念珠菌種間差異性和棘白菌素類藥物特異性。卡泊芬凈出現(xiàn)“矛盾現(xiàn)象”的發(fā)生率高于米卡芬凈。各菌株對(duì)卡泊芬凈、米卡芬凈產(chǎn)生“矛盾現(xiàn)象”的發(fā)生率與MIC的高低無(wú)明顯相關(guān)性。

關(guān)鍵詞:念珠菌；卡泊芬凈；米卡芬凈；矛盾現(xiàn)象

棘白菌素是一類新型的抗真菌藥物,能非競(jìng)爭(zhēng)性抑制真菌細(xì)胞壁β-1,3-D-葡聚糖合成酶,造成真菌細(xì)胞壁中β-葡聚糖減少，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，有較高的特異性,能迅速殺滅真菌[1]。因?yàn)椴溉轭悇?dòng)物的細(xì)胞中不存在β-1,3-D-葡聚糖合成酶,故該類化合物對(duì)人體正常細(xì)胞影響不大。作為一種新型抗真菌藥物,棘白菌素類抗真菌藥已在臨床逐步推廣應(yīng)用[2]。目前國(guó)內(nèi)外均有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)棘白菌素作用于念珠菌屬會(huì)出現(xiàn)低濃度時(shí)抑制、高濃度時(shí)出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)的“矛盾現(xiàn)象”[3]。目前此現(xiàn)象和臨床關(guān)系尚未明確。已有研究通過對(duì)不同念珠菌種對(duì)卡泊芬凈、米卡芬凈體外藥敏試驗(yàn)出現(xiàn)“矛盾現(xiàn)象”的動(dòng)態(tài)觀察，念珠菌屬對(duì)卡泊芬凈、米卡芬凈的體外藥敏試驗(yàn)有可能出現(xiàn)“矛盾現(xiàn)象”，并具有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系[4]。本研究通過微量稀釋法驗(yàn)證了“矛盾現(xiàn)象”的存在，并初步探討了“矛盾效應(yīng)”的發(fā)生率。

1材料與方法

1.1材料菌株：收集武漢地區(qū)從臨床患者分離的念珠菌共180株，包括白色念珠菌100株、熱帶念珠菌40株、近平滑念珠菌20株、光滑念珠菌20株。使用近平滑念珠菌ATCC22019作為質(zhì)控菌株。

1.2儀器與試劑卡泊芬凈(美國(guó)Merck公司)，米卡芬凈(日本Fujisawa公司)。RPMI1640(干粉裝，Sigma)，MOPS緩沖液(干粉裝，Sangon)。

1.3方法

1.3.1真菌接種液制備各受試念珠菌株先在沙氏培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種2 次，再經(jīng)24 h培養(yǎng)后，選擇直徑大于1 mm的菌落5個(gè)，將其用0.85%的無(wú)菌鹽水制成懸液。用牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子，調(diào)整含菌量，使集落形成單位(CFU)為(1～5)×106/mL，待用。

1.3.2最低抑菌濃度(MIC)和“矛盾效應(yīng)”的測(cè)量參考CLSI M27-A3文件推薦的微量液基稀釋法的規(guī)范[5]，本研究依據(jù)實(shí)際情況作出修改，藥物濃度梯度設(shè)計(jì)為0.03～64.00 μg/mL,共12組濃度梯度。往已稀釋好的含有不同藥液的微孔中加入待測(cè)菌液，使真菌接種液最終CFU調(diào)至(0.5～2.5)×103/mL。最終96孔板每孔體積為200 μL，35 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.3結(jié)果判定48 h后肉眼觀察結(jié)果，肉眼判讀MIC和“矛盾效應(yīng)”的起始濃度和終止?jié)舛取Ｔ诟哂贛IC 2倍稀釋濃度以上出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)的情況判定為“矛盾現(xiàn)象”。

2結(jié)果

卡泊芬凈和米卡芬凈白色念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌的MIC90都比較低，沒有發(fā)現(xiàn)耐藥株，對(duì)近平滑念珠菌的MIC較高，MIC50、MIC90分別為1.00、2.00 μg/mL。卡泊芬凈對(duì)這4種念珠菌均有“矛盾現(xiàn)象”出現(xiàn)，米卡芬凈只對(duì)白色念珠菌和熱帶念珠菌有“矛盾現(xiàn)象”出現(xiàn)?？ú捶覂魧?duì)念珠菌“矛盾現(xiàn)象”起點(diǎn)濃度中位數(shù)較米卡芬凈高，見表1。

表1　　念珠菌對(duì)卡泊芬凈、米卡芬凈出現(xiàn) “矛盾現(xiàn)象”

注：-表示未檢測(cè)。

3討論

本研究測(cè)定了卡泊芬凈和米卡芬凈對(duì)念珠菌的MIC，結(jié)果顯示卡泊芬凈和米卡芬凈對(duì)白色念珠菌和熱帶念珠菌的MIC90/MIC50均分別為0.13/0.25 μg/mL和0.03/0.03 μg/mL，對(duì)光滑念珠菌分別為0.03/0.03 μg/mL和0.03/0.25 μg/mL，與Macro等[6]、Pfaller等[7]、曾榮等[8]報(bào)道相似。卡泊芬凈和米卡芬凈對(duì)近平滑念珠菌的 MIC90/MIC50為1.00/0.50 μg/mL和2.00/1.00 μg/mL。本研究結(jié)果表明，棘白菌素類藥物卡泊芬凈、米卡芬凈對(duì)念珠菌總體有較好的抗菌作用，其中對(duì)白念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌的MIC值較低，對(duì)近平滑念珠菌的MIC值相對(duì)其他3種念珠菌高。

本研究證實(shí)了棘白菌素對(duì)念珠菌“矛盾現(xiàn)象”的存在，卡泊芬凈較米卡芬凈更易出現(xiàn)“矛盾現(xiàn)象”。本研究中，所有念珠菌在卡泊芬凈作用下均出現(xiàn)該現(xiàn)象，且發(fā)生率遠(yuǎn)高于米卡芬凈。對(duì)比MIC濃度和“矛盾現(xiàn)象”起點(diǎn)/終點(diǎn)濃度發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)明顯相關(guān)性。本研究中，“矛盾現(xiàn)象”的發(fā)生率與曾榮等[8]研究結(jié)果相似，但顯著高于Fleischhacker等[9]報(bào)道的結(jié)果，出現(xiàn)差異可能與實(shí)驗(yàn)的樣本量較小、菌種來(lái)源不同等多種因素有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，“矛盾現(xiàn)象”發(fā)生率的變化存在念珠菌種屬差異性和棘白菌素類藥物特異性，而且與藥物作用時(shí)間有一定的關(guān)系?？ú捶覂簟懊墁F(xiàn)象”發(fā)生率的變化情況較米卡芬凈更加明顯，且發(fā)生率更高。一定時(shí)間內(nèi)“矛盾現(xiàn)象”的發(fā)生率會(huì)隨藥物作用時(shí)間增加而有所增加。目前，“矛盾現(xiàn)象”的原因尚無(wú)定論。有觀點(diǎn)認(rèn)為“矛盾現(xiàn)象”是念珠菌在高濃度棘白菌素類藥物作用時(shí)產(chǎn)生的一種自身保護(hù)性代償機(jī)制，其通過改變細(xì)胞壁組分而免受藥物殺傷。其產(chǎn)生機(jī)制目前還未完全闡明，可能的機(jī)制有念珠菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量升高、細(xì)胞壁蛋白激酶C(PKC)途徑等[10-12]。

本研究結(jié)果表明，念珠菌屬對(duì)卡泊芬凈、米卡芬凈的體外藥敏試驗(yàn)有可能出現(xiàn)“矛盾現(xiàn)象”，其與藥物特異性有關(guān)，并和藥物作用時(shí)間有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，但其發(fā)生率無(wú)確定參考范圍。不同念珠菌種的“矛盾現(xiàn)象”出現(xiàn)的時(shí)間、起點(diǎn)/終點(diǎn)不一，同一菌種不同菌株之間也存在差異。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.046

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)14-2008-02

(收稿日期：2016-01-17修回日期：2016-03-19)