顯微相襯技術分析去白細胞懸浮紅細胞上清液不同存儲期內細胞碎片及微粒的圖像變化*

鄧智豪，官亞妹△，伍偉健，陀偉為，黃耀熊

(1.廣東省佛山市中心血站　528000；2.暨南大學生物醫(yī)學工程系，廣州 510632)

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顯微相襯技術分析去白細胞懸浮紅細胞上清液不同存儲期內細胞碎片及微粒的圖像變化*

鄧智豪1，官亞妹1△，伍偉健1，陀偉為2，黃耀熊2

(1.廣東省佛山市中心血站528000；2.暨南大學生物醫(yī)學工程系，廣州 510632)

摘要:目的探索庫存去白細胞懸浮紅細胞，隨著保存時間的延長，紅細胞破損或溶血而產生的細胞碎片及微粒變化，為輸血安全提供啟示性實驗基礎。方法取不同保存天數(shù)(3、7、14、21 d)的庫存去白細胞懸浮紅細胞進行上清液制備，通過顯微靜態(tài)圖像分析技術對上清液中的微粒進行觀察和形態(tài)分析。結果保存3 d和7 d的樣品上清液中可見少量微粒，微粒大小和細胞相仿；從14 d開始微粒的數(shù)量顯著增加，微粒粒徑更小，到21 d微粒鋪滿了整個視場，呈現(xiàn)碎片化。結論保存期超過14 d的庫存去白細胞懸浮紅細胞，其上清液的細胞碎片及微粒顯著增多，較保存期不到14 d的細胞均有顯著的差異。這些外源細胞碎片或微?？赡軙蔀榭乖⒁饳C體的免疫反應，導致輸血不良反應發(fā)生，建議臨床上給患者輸注保存期在14 d以內的去白細胞懸浮紅細胞。

關鍵詞:去白細胞懸浮紅細胞；不同存儲期；顯微相襯圖像

長時間庫存的血液制品是否存在隱患已吸引了學界越來越多的關注，時有報道的因輸注舊血而導致的醫(yī)療事故也引起了人們恐慌。2006年，Tinmouth等[1]報道，輸注了保存時間超過14 d的庫存紅細胞的患者出現(xiàn)并發(fā)癥的概率明顯比輸注保存時間短(少于7 d)的紅細胞的患者高。Offner等[2]在對因外傷而需要接受輸血的患者的研究中發(fā)現(xiàn)輸注保存超過14 d紅細胞的患者比輸注保存時間少于14 d的患者更容易發(fā)生感染。Koch等[3]分析了1998～2006年2 872例接受心臟搭橋手術的患者手術結束當天、術后3 d及術后恢復1年內發(fā)生并發(fā)癥的情況，發(fā)現(xiàn)輸注保存超過2周的紅細胞會明顯增加術后并發(fā)癥的發(fā)生概率,并提出將保存超過14 d的血液劃分為舊血。在通常情況下，庫存紅細胞在儲存過程中會發(fā)生一系列生物化學與結構上的改變，且隨著儲存時間的延長變化更加顯著，這些改變通常被統(tǒng)稱為紅細胞的儲存損傷,臨床數(shù)據(jù)顯示全血及紅細胞制品儲存時間越長輸血效果越差且可增加輸血相關不良反應發(fā)生的風險[4-6]。其中，細胞碎片或微粒是紅細胞儲存損傷的1種重要產物，會在紅細胞破損時釋放到基質液體中,具有免疫調節(jié)作用，與輸血相關不良反應(炎癥、血栓等)的發(fā)生密切相關[6-7]。Belizaire等[8]利用小鼠模型證明儲存紅細胞來源的細胞碎片或微粒能活化中性粒細胞并且引起輸血相關肺損傷；同樣還有研究證實儲存紅細胞制品中的細胞碎片或微?？赏ㄟ^與補體和IgG結合，活化中性粒細胞來介導輸血相關急性肺損傷[9]。因此，這些保存時間較長的紅細胞，引起的副作用有一部分可能是由于庫存紅細胞在保存和處理過程中溶血所產生的細胞碎片或微粒導致的。為了了解庫存去白細胞懸浮紅細胞的溶血情況及其溶血產物狀態(tài)隨存儲時間的變化，本文在標準的血站采集、制備、運輸和保存條件下，對不同保存期的庫存去白細胞懸浮紅細胞進行溶血情況及其溶血產物方面的系統(tǒng)研究。本文主要采用了相襯顯微成像技術來對庫存去白細胞懸浮紅細胞上清液中的細胞碎片及微粒進行圖像拍攝及分析，觀察紅細胞老化與溶血、細胞碎片生成等一系列變化。

1材料與方法

1.1材料本文所用到的去白細胞懸浮紅細胞均是由本站根據(jù)標準規(guī)范完成制備，放置于專用儲血冰箱中2～6 ℃保存；隨機選取5份庫存去白細胞懸浮紅細胞，在保存到第3、7、14、21天時，在無菌環(huán)境下從血袋中各取出2 mL作為樣品，進行平行試驗；剩余的去白細胞懸浮紅細胞則在血袋熱合封口后待下一次實驗使用。

1.2儀器與試劑0.9% NaCl溶液(生理鹽水)；日立CF7D2離心機；NikonTE300倒置顯微鏡。

1.3方法使用日立CF7D2離心機在4 ℃下以1 500 r/min速度將樣品離心10 min，制備上清液，并做好標記；離心后各取30 μL上清液滴加到載玻片上，并置于NikonTE300倒置顯微鏡下，然后調節(jié)到相襯圖像模式，使用40倍物鏡觀察，再通過Panasonic高靈敏度CCD攝取顯微鏡觀察到的圖像。對保存時間為3、7、14、21 d的庫存去白細胞懸浮紅細胞上清液進行了顯微相襯圖像的拍攝和研究，每份樣品均進行25～30個視場拍攝，然后再使用顯微靜態(tài)圖像分析技術進行圖像處理和分析。

2結果

5組平行樣品在不同時期的顯微圖像均無顯著差異，各選取1張典型顯微相襯圖片來反映庫存去白細胞懸浮紅細胞上清液在保存過程中微粒數(shù)量和粒徑大小的變化，如圖1所示。從圖1中4張較有代表性的顯微圖像可觀察到，從細胞碎片及微粒數(shù)量上比較，保存3 d和7 d樣品上清液中可見少量微粒，從14 d開始微粒的數(shù)量顯著增加，到21 d微粒鋪滿了整個視場。從細胞碎片及微粒粒徑上比較，保存3 d和7 d的樣品上清液中微粒大小和細胞相仿，從14 d開始觀察到的微粒粒徑更小，到21 d時逐漸呈現(xiàn)碎片化。細胞碎片及微粒整體變化趨勢為：微粒數(shù)量在不斷增多，微粒的粒徑分布也有差異，形狀在改變，到21 d時逐漸呈現(xiàn)碎片化。

注：A～D分別表示保存3、7、14、21 d的去白細胞懸浮紅細胞上清液。

圖1不同保存期庫存去白細胞懸浮紅細胞上清液的顯微相襯圖像

3討論

隨著科學的發(fā)展，人們對血液的了解越來越深,血液保存技術的進步促使了庫存血的產生。輸庫存血已成為現(xiàn)今輸血治療中應用最廣泛和最重要的一種方式,如何讓新鮮血液獲得最有效的保存,使血細胞生命力和活力不在保存過程中損失,使血液在保存過程中保持新鮮,如何保證庫存血的輸注安全已成為現(xiàn)今臨床醫(yī)學治療中最關注的問題之一。庫存血液從收集、檢測、分離、保存，再配送到臨床上輸注使用，無法避免的有一定時間的周轉過程。需要輸注進入人體內的紅細胞制品均存在一個保存時間的問題,從理論上來說,血液從獻血者身上采集到制備成紅細胞制品,再到入庫編排保存,再發(fā)放到臨床使用至少需要3 d,那就是說,在醫(yī)院臨床上使用到的由血站配送的紅細胞制品至少是3 d以前采集的血液了。隨著時間的變化，正常狀態(tài)的紅細胞在內外環(huán)境等物理及化學因素的影響下，會發(fā)生不同程度的改變。這個改變是整體的，除了包含紅細胞本身的儲存損傷之外，還包括了隨著紅細胞破損而釋放到其懸液基質中的微粒，紅細胞破損后而產生的細胞碎片以及其他由于細胞溶血而產生的微粒會被釋放到庫存去白細胞懸浮紅細胞液體基質的改變。但是研究人員往往將注意力集中在紅細胞本身的變化。任素萍等[10]在用電子顯微鏡研究延期保存的紅細胞的超微結構時發(fā)現(xiàn),在使用超氧化物歧化酶保存液的條件下,紅細胞隨著儲存時間的延長，棘形紅細胞和畸形紅細胞越來越多。王愛梅等[11]在用不同保存時期的全血制備洗滌紅細胞的時候，發(fā)現(xiàn)用保存15 d以上的全血制備的洗滌紅細胞的形態(tài)發(fā)生不正常的變化，觀察到了棘形紅細胞的出現(xiàn)。許利民等[12]研究了紅細胞在不同溫度環(huán)境下長期凍存后平均體積的變化后，發(fā)現(xiàn)長期凍存的紅細胞平均體積均比正常的紅細胞大。本研究通過對不同保存時間的庫存去白細胞懸浮紅細胞上清液的觀察發(fā)現(xiàn)，隨著保存時間的延長，庫存去白細胞懸浮紅細胞上清液樣品的單位體積內的微粒數(shù)量呈不斷上升的趨勢，微粒數(shù)目隨著保存時間的增長而上升，更突出的是，保存期在14 d以內，樣品中的微粒數(shù)目的增長速度較為緩慢，而在保存期達到了14 d以后，從保存的第3周開始，微粒數(shù)目的增長明顯。從保存14 d的上清液顯微圖像中可以發(fā)現(xiàn)，形態(tài)尺寸也發(fā)生了變化，尺寸更小，形態(tài)更像一些囊泡和細胞碎片，到了保存后期(21 d)的上清液顯微圖像中的微粒已鋪滿整個視場，并且形態(tài)已呈現(xiàn)碎片化。結果表明，保存期超過14 d的庫存去白細胞懸浮紅細胞，紅細胞會由青齡紅細胞加速向老齡紅細胞發(fā)展，其上清液的細胞碎片及微粒顯著增多，較保存期不到14 d的細胞均有顯著差異。

綜上所述，庫存去白細胞懸浮紅細胞保存質量的評價不應當只關注紅細胞本身，其上清液的變化同樣有著重要的意義。外源細胞碎片或微?？赡軙蔀榭乖⒁饳C體的免疫反應，導致輸血不良反應發(fā)生。因此，建議臨床上給患者輸注保存期在14 d以內的去白細胞懸浮紅細胞，以減少輸血不良反應的發(fā)生。

參考文獻

[1]Tinmouth A,Fergusson D,Yee IC,et al.Clinical consequences of red cell storage in the critically ill[J].Transfusion,2006,46(11):2014-2027.

[2]Offner PJ,Moore EE,Biffl WL,et al.Increased rate of infection associated with transfusion of old blood after severe injury[J].Arch Surg,2002,137(6):711-717.

[3]Koch CG,Li L,Sessler DI,et al.Duration of red-cell storage and complications aftercardiac surgery[J].N Engl J Med,2008,358(12):1229-1239.

[4]Gkoumassi E,Margriet J,Hoentjen D,et al.Hemolysis of red blood cells during processing and storage[J].Transfusion,2012,52(3):489-492.

[5]Doctor A，Spinella P.Effect of processing and storage on red blood cell function in vivo[J].Semin Perinatol,2012,36(4):248-259.

[6]張寧潔,卜艷紅,王勇軍.紅細胞血液制品中紅細胞微粒檢測方法的建立[J].中國輸血雜志,2015,28(10):1218-1221.

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[8]Belizaire RM,Prakash PS,Richter JR,et al.Microparticles from stored red blood cells activate neutrophils and cause lung injury af-ter hemorrhage and resuscitation[J].J Am Coll Surg,2012,214(4):648-655.

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[10]任素萍,馬恩普,劉秀珍,等.4 ℃延期保存紅細胞超微結構的動態(tài)變化[J].中國實驗血液學雜志,2003,11(5):524-526.

[11]王愛梅,梁文華,王群，等.不同保存期全血制備洗滌紅細胞的超微結構變化[J].臨床輸血與檢驗,2007,6(3):173-176.

[12]許利民,馮江,張荷，等.紅細胞不同溫度長期凍存后形態(tài)和免疫功能的變化及其臨床意義[J].重慶醫(yī)學,2002,31(6):461-462.

* 基金項目：廣東省佛山市衛(wèi)計局科研課題項目(2014162)。

作者簡介：鄧智豪，男，主管檢驗技師，主要從事血液成分制備與檢測方面的研究。 △通訊作者，E-mail：455300438@qq.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.015

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)14-1939-03

(收稿日期：2016-01-12修回日期：2016-03-23)

Analysis on aleukocytic suspending red blood cell supernatant fragment and particle image changes at different stored periods by microscopic phase contrast technology*

DENGZhihao1,GUANYamei1△,WUWeijian1,TUOWeiwei2,HUANGYaoxiong2

(1.FoshanMunicipalCentralBloodStation,Foshan,Guangdong528000,China;2.DepartmentofBiomedicalEngineering,JinanUniversity,Guangzhou,Guangdong510632,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the cellular fragments and particle image changes of inventory aleucocytic suspending RBC produced by the storage time extension,RBC damage or hemolysis in order to provide the revelatory experimental basis for the transfusion safety.MethodsThe supernatant was prepared from different stored days (3,7,14,21 d) of stock aleukocytic suspending RBC.The particles in supernatant were observed and morphologically analyzed by using the microscopic static image analytic technology.Results There were a small amounts of visible particles in the sample supernatant preserved for 3,7 d and the particles′ sizes are similar to cells′;the number of particles began to significantly increase from 14 d and the diameter became smaller.The particles filled the entire field until 21 d,showing fragmentary status.ConclusionThe cellular fragments and particles in the supernatants of stock aleukocytic suspending RBC with the storage period exceeding 14 d are significantly increased and have significant difference compared with those stored for less than 14 d.These exogenous fragments and particles may become antigens and induce the body immune response,lead to transfusion adverse reactions.It is recommended that the patients should be transfused with stock aleukocytic suspending RBC within a storage period of 14 d.

Key words:aleukocytic suspending red blood cell;different stored periods;microscopic phase contrast image