人BRIT1基因在宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義分析*

麥　力，王　玎，胡　琴，聶　紅，趙　清，陳維賢，鄧淋曼

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科　400010)

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人BRIT1基因在宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義分析*

麥力，王玎，胡琴，聶紅，趙清，陳維賢，鄧淋曼△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科400010)

摘要:目的檢測(cè)宮頸癌組織和配對(duì)的宮頸非癌組織中的BRIT1表達(dá)情況，比較兩者之間的表達(dá)差異。方法分別應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR(RT-PCR)、免疫組化技術(shù)檢測(cè)宮頸癌組織及其配對(duì)的宮頸非癌組織中BRIT1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，分析BRIT1蛋白表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤類型、腫瘤的病理分級(jí)和臨床分期之間的關(guān)系。結(jié)果RT-PCR結(jié)果揭示宮頸癌組織中BRIT1 mRNA的表達(dá)水平低于配對(duì)的宮頸非癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；免疫組化技術(shù)結(jié)果揭示63例標(biāo)本中的44例(69.8%)宮頸癌組織BRIT1蛋白表達(dá)水平低于配對(duì)的宮頸非癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在高級(jí)的病理分級(jí)和臨床分期中，BRIT1蛋白的表達(dá)減少更為明顯。結(jié)論BRIT1在宮頸癌癌組織和非癌組織中的表達(dá)差異提示BRIT1可能在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用。

關(guān)鍵詞:BRIT1；宮頸癌；免疫組化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

宮頸癌是癌細(xì)胞起源于子宮頸的惡性腫瘤，又稱子宮頸癌。宮頸癌是全球第三位高發(fā)的女性惡性腫瘤，是引起全球女性死亡的第四大“腫瘤殺手”[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，僅2010年全球新發(fā)宮頸癌病例52.9萬，死亡病例27.5萬，病死率高達(dá)52%，其中88%的死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[1]。宮頸癌是導(dǎo)致女性死亡的一個(gè)主要疾病。因此，進(jìn)一步研究宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，研究開發(fā)新的宮頸癌診斷和治療方法，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。BRIT1(BRCT-repeat inhibitor of hTERT expression)又稱MCPH1(microcephalin)，是以大腦體積減小及智力遲鈍為特征的原發(fā)性小頭畸形的主要致病基因之一，因此該基因也稱作小腦癥基因[2]。目前研究證實(shí)BRIT1基因是DNA損傷應(yīng)答通路中一個(gè)重要分子[3]。DNA損傷應(yīng)答是機(jī)體早期抵御腫瘤發(fā)生的重要防線，因此推測(cè)BRIT1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要作用。然而目前，BRIT1在宮頸癌組織中的表達(dá)和其潛在功能尚未得到證實(shí)。因此研究BRIT1在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義，對(duì)認(rèn)識(shí)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制有著重要的理論意義，同時(shí)可能為宮頸癌的診斷和靶向治療提供重要的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料63對(duì)宮頸標(biāo)本包括宮頸癌組織和同一病例的宮頸非癌組織，采集于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院。所有標(biāo)本的病理資料包括患者年齡、腫瘤分型、腫瘤大小、腫瘤的病理分級(jí)和臨床分期等。每份組織標(biāo)本分成2份：一份由4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片用于免疫組織化學(xué)分析；另一份液氮凍存，用于提取總RNA，用于實(shí)時(shí)熒光PCR(RT-PCR)分析。

1.2試劑RNA提取試劑盒Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，BRIT1一抗購(gòu)自Abcam公司；HRP標(biāo)記的IgG二抗購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3方法

1.3.1PCR檢測(cè)宮頸癌組織中BRIT1 mRNA的表達(dá)提取宮頸組織中的RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，將cDNA稀釋10倍后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.1 μL， cDNA模板1 μL，ddH2O 3.8 μL。引物序列如下：BRIT1引物正義鏈 5′- AGT GGG AGA GGC AAA AAG CC-3′，反義鏈 5′-GTT CGA ACG GCT CCT CAG AA-3′；GAPDH引物正義鏈 5′-CGC TCT CTG CTC CTC CTG TT-3′，反義鏈 5′-CCA TGG TGT CTG AGC GAT GT-3′。反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，相同試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2免疫組化宮頸癌組織中BRIT1蛋白水平的表達(dá)宮頸癌組織石蠟包埋、切片，制作免疫組化組織片。免疫組化過程為：脫蠟，切片經(jīng)二甲苯洗3次，每次5 min，再水化；抗原修復(fù)，檸檬酸抗原修復(fù)液(pH6.0)100 ℃，20 min；5%的山羊血清封閉；BRIT1一抗4 ℃孵育過夜；HRP 標(biāo)記的IgG二抗25 ℃孵育30 min；鏈霉親和素-過氧化物酶孵育30 min；DAB顯色；顯微鏡觀察，結(jié)果判讀。由2位病理醫(yī)生在不知曉臨床病理參數(shù)的條件下，對(duì)免疫組化的結(jié)果進(jìn)行量化打分。量化分值根據(jù)染色陽性細(xì)胞比率和染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合量化。其中染色強(qiáng)度的打分標(biāo)準(zhǔn)如下：陰性(-，0分)，弱陽性(+，1分)，中等陽性(++，2分)，強(qiáng)陽性(+++，3分)。染色陽性細(xì)胞比率的打分標(biāo)準(zhǔn)如下：陽性細(xì)胞比率≤10%(0分)，10%<陽性細(xì)胞比率≤30% (1分)，30%<陽性細(xì)胞比率≤50%(2分)，50%<陽性細(xì)胞比率≤70%(3分)，70%<陽性細(xì)胞比率≤100%(4分)?？偡种?0～7分)= 染色強(qiáng)度的分值+染色陽性細(xì)胞比率的分值。

2結(jié)果

2.1宮頸癌標(biāo)本BRIT1 mRNA的表達(dá)采用RT-PCR檢測(cè)31對(duì)宮頸組織中BRIT1 mRNA的表達(dá)情況，在31例標(biāo)本中有19例(61.3%)宮頸癌組織標(biāo)本的BRIT1 mRNA的表達(dá)水平低于其配對(duì)的宮頸非癌組織的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)宮頸癌組織中BRIT1 mRNA的表達(dá)量比宮頸非癌組織中的表達(dá)量低(P=0.000 2)，見圖1。

圖1　　宮頸標(biāo)本BRIT1 mRNA表達(dá)水平的比較

圖2　　宮頸標(biāo)本BRIT1蛋白表達(dá)水平的比較(400×)

圖3　　宮頸組織中BRIT1蛋白的表達(dá)水平

2.2免疫組化檢測(cè)宮頸癌標(biāo)本BRIT1蛋白的表達(dá)采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)63對(duì)宮頸癌標(biāo)本中BRIT1蛋白的表達(dá)水平，各組織標(biāo)本的BRIT1蛋白的表達(dá)量化評(píng)分和經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后，結(jié)果顯示：63例標(biāo)本中的44例(69.8%)宮頸癌組織BRIT1蛋白的表達(dá)水平低于配對(duì)的宮頸非癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2；宮頸鱗癌組織和宮頸腺癌組織中BRIT1蛋白的表達(dá)均低于各自配對(duì)的宮頸非癌組織中BRIT1蛋白的表達(dá)，見圖3。宮頸癌中BRIT1的表達(dá)量與腫瘤分級(jí)、腫瘤分期有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤分型等沒有相關(guān)性，見表1。

表1　　BRIT1蛋白表達(dá)水平與臨床病理資料的相關(guān)性分析*

注：*BRIT1蛋白表達(dá)水平為免疫組化法檢測(cè)量化打分結(jié)果，≤3分為低表達(dá)，>3分為高表達(dá)；aP<0.05，與腫瘤分級(jí)3級(jí)比較；bP<0.05，與腫瘤分期Ⅲ期比較。

3討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，是威脅女性健康最常見的“腫瘤殺手”。因此，進(jìn)一步研究宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制將有助于宮頸癌診斷和治療。而BRIT1在宮頸癌組織的表達(dá)和功能目前尚未證實(shí)。

BRIT1基因是一個(gè)新的關(guān)鍵的DNA損傷應(yīng)答基因，可調(diào)控ATM/ATR信號(hào)通路，修飾染色體結(jié)構(gòu)，直接參與DNA修復(fù)等過程。DNA損傷應(yīng)答信號(hào)的正常激活是早期阻止腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制，是抵御細(xì)胞內(nèi)外損傷因子損傷基因組DNA的重要防線[4]。而BRIT1正是DNA損傷應(yīng)答信號(hào)通路中的關(guān)鍵一環(huán)，且處于DNA損傷應(yīng)答的早期階段。多個(gè)研究小組已證實(shí)：在乳腺癌[5]、卵巢癌[6]、前列腺癌[7]及慢性粒細(xì)胞白血病[8]等腫瘤組織中，BRIT1表達(dá)減少。此外，在BRIT1基因敲除的小鼠中，其基因組的不穩(wěn)定性增加，腫瘤的易感性增加[9]。這些研究提示BRIT1可能是一個(gè)新的腫瘤抑制基因。因此，研究BRIT1在宮頸癌組織的表達(dá)及其功能有助于宮頸癌對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)；有利于提高宮頸癌的早期診斷和治療。

本研究采用RT-PCR和免疫組化技術(shù)從mRNA和蛋白水平兩個(gè)方面證實(shí)了BRIT1在宮頸癌組織中的表達(dá)低于宮頸非癌組織中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示：在31例標(biāo)本中有19例(61.3%)宮頸癌組織中BRIT1 mRNA的表達(dá)低于配對(duì)的宮頸非癌組織的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比率進(jìn)行量化評(píng)分后統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：63例標(biāo)本中的44例(69.8%)宮頸癌組織BRIT1蛋白表達(dá)水平低于配對(duì)的宮頸非癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在mRNA水平和蛋白水平，宮頸癌組織較配對(duì)的宮頸非癌組織BRIT1的低表達(dá)率基本一致，均在60%以上。這一結(jié)果提示BRIT1在宮頸癌組織的低表達(dá)可能與BRIT1基因在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)調(diào)控失衡有關(guān)，如啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化、miRNA的調(diào)控失衡等。統(tǒng)計(jì)分析揭示，宮頸癌中BRIT1的表達(dá)量與腫瘤的病理分級(jí)和臨床分期有一定的相關(guān)性，與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤分型等沒有相關(guān)性。這一結(jié)果提示BTIT1可能是宮頸癌細(xì)胞惡性程度的一個(gè)重要標(biāo)志。此外，有多個(gè)報(bào)道顯示BRIT1在其他腫瘤組織中也呈低表達(dá)，如Richardson等[5]研究表明在319例乳腺癌標(biāo)本中，有93例乳腺癌標(biāo)本中BRIT1的表達(dá)低于其配對(duì)的正常乳腺的表達(dá)，其低表達(dá)率為29%，且BRIT1的表達(dá)量與腫瘤分級(jí)呈負(fù)相關(guān)；而也有研究證實(shí)BRIT1的表達(dá)與乳腺癌的轉(zhuǎn)移[10]和無復(fù)發(fā)生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[11]。另有報(bào)道BRIT1在30例卵巢癌標(biāo)本中有19例的癌組織較配對(duì)正常組織呈低表達(dá)[12]。在人體中，BRIT1基因定位于染色體8p23.1，在腫瘤細(xì)胞中這一區(qū)帶易于雜合性缺失，這個(gè)可能是BRIT1在多個(gè)腫瘤組織中的表達(dá)缺失的重要原因。此外，BRIT1的表達(dá)缺失也可能與其轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)調(diào)控失衡有關(guān)，需進(jìn)一步研究。這些研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了BRIT1可能是一個(gè)新的抑癌基因，參與抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。BRIT1在宮頸癌組織和宮頸非癌組織中的差異表達(dá)，提示BRIT1可能在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展具有重要的作用，為進(jìn)一步研究其作用奠定了基礎(chǔ)。

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* 基金項(xiàng)目：重慶市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)項(xiàng)目(2013-2-046)。

作者簡(jiǎn)介：麥力，男，主管檢驗(yàn)技師，主要從事腫瘤分子生物學(xué)研究。 △通訊作者，E-mail:denglinmancqmu@126.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.002

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)14-1904-03

(收稿日期：2016-01-08修回日期：2016-03-21)

Analysis of human BRIT1 expression and its clinical significance in cervical cancer*

MAILi,WANGDing,HUQin,NIEHong,ZHAOQing,CHENWeixian,DENGLinman△

(DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

Abstract:ObjectiveTo detect the expression of BRIT1 in cervical cancer tissues and cervical noncancer tissues,and to analyze the differences between the two tissues.MethodsThe expression of BRIT1 mRNA and protein in cervical cancer tissues and the paired cervical noncancer tissues was evaluated by RT-PCR and immmunohistochemistry.Its correlation with the clinicopathological parameters including age,tumor types,size,tumor pathological grade and clinical stage was analyzed.ResultsRT-PCR results showed that the BRIT1 mRNA level in cervical cancer tissues was significantly lower than that in the paired cervical noncancer tissues,the difference was statistically significant(P<0.05).The immmunohistochemistry results showed that the BRIT1 protein expression level in 44 cases of 63 (69.8%) samples wa slower than that in the paired cervical noncancer tissues,the difference was statistically significant(P<0.05);In high pathological grades and high clinical stages,the decrease of BRIT1 protein expression was more significant.ConclusionThe difference of the BRIT1 expression between the cervical cancer tissues and cervical noncancer tissues suggests that BRIT1 may play a certain role in the occurrence and development of cervical cancer.

Key words:BRIT1；cervical cancer；immmunohistochemistry；real time-PCR