UPLC-MS/MS法測(cè)定動(dòng)物源食品中金剛烷胺殘留

徐艷清（深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東 深圳 518001）

UPLC-MS/MS法測(cè)定動(dòng)物源食品中金剛烷胺殘留

徐艷清
（深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東 深圳 518001）

建立動(dòng)物源性食品中金剛烷胺的高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）殘留分析方法。樣品用1 %乙酸乙腈提取，加入正己烷除雜；吹干濃縮后用0.1 %甲酸水溶液+甲醇（V∶V=1∶1）溶解，以0.1 %甲酸水溶液-甲醇為流動(dòng)相，經(jīng)C18柱分離，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子模式進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金剛烷胺提取效果好，檢出限為0.05 μg/kg，在1.0 μg/kg～10.0 μg/kg添加水平的平均回收率在89.4 %～110.2 %之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.02 %～4.31 %。本方法適用于動(dòng)物源性食品中金剛烷胺殘留檢測(cè)。

金剛烷胺；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；抗病毒

金剛烷胺（別名：三環(huán)癸胺）是最早用于抑制流感病毒的抗病毒藥，廣泛用于人類流感治療.但是，將人用抗病毒藥物用于畜禽，不僅容易導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中藥物殘留、動(dòng)物中毒、動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制和耐藥性等問題，還可導(dǎo)致病毒發(fā)生變異，影響動(dòng)物疫病控制及人用抗病毒藥物的有效性。我國農(nóng)業(yè)部2005年第560號(hào)公告明確規(guī)定金剛烷胺等抗病毒藥物在獸醫(yī)上禁止使用［1］，美國FDA于2006年也禁止將金剛烷胺等人類抗病毒藥物用于畜禽類。

目前，文獻(xiàn)資料中關(guān)于金剛烷胺在動(dòng)物源性組織內(nèi)殘留的檢測(cè)方法較少，國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也是空白，對(duì)此類藥物的監(jiān)管帶來了不便。而雞肉中殘留的金剛烷胺含量低，基質(zhì)干擾大，急需有效的前處理方法和高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)。目前，金剛烷胺的檢測(cè)方法有液相色譜法、毛細(xì)管電泳法［5］、液相色譜-質(zhì)譜法［2-4］等，其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法以其高靈敏度和可靠的確證性能，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。本文采用超高效液相色譜質(zhì)譜法（UPLC-MS/ MS）測(cè)定雞肉中金剛烷胺的殘留量，并對(duì)樣品前處理方法和儀器分析條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，為禽類養(yǎng)殖環(huán)節(jié)金剛烷胺藥物的監(jiān)控提供了技術(shù)支持

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

AcQuity UPLC/XeVo TQMS液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司），電子天平（Mettler Toledo公司型號(hào)：PL2002），高速冷凍離心機(jī)（SIGMA公司，型號(hào)3K15），純水機(jī)（德國Millipore公司），渦旋混勻器（vortex Genie2型）。

金剛烷胺（Chroma DEX公司，0.1 g/支），金剛烷胺-D15（加拿大TRC公司，1 mg/支），甲醇、乙腈（色譜純，Merck公司）；甲酸（色譜純，Aladdin公司）無水硫酸鈉、冰乙酸。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取10 mg金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg/mL金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，精確稱取1 mg金剛烷胺-D15標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成0.10 mg/mL金剛烷胺-D15標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃以下避光保存。

1 %乙酸乙腈溶液：取冰乙酸10 mL，用乙腈稀釋至1 000 mL。

0.1 %甲酸水溶液：取1 mL甲酸，用水稀釋至1 000 mL。

1.2 樣品前處理

取雞肉充分絞碎，勻質(zhì)，-18 ℃以下避光保存。

稱取2.00 g（精確到0.01 g），樣品于50 mL離心管中，加入濃度為1 μg/mL 的金剛烷胺-D15內(nèi)標(biāo)工作液0.04 mL，然后加入1 %乙酸乙腈溶液10 mL，漩渦2 min，3 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入另一50 mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，備用。備用液中加入無水硫酸鈉3 g，正己烷10 mL，渦旋1 min，3 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層，剩余溶液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈桑尤? mL甲醇：0.1 %甲酸水溶液（體積比為1：1），渦旋30 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液供上機(jī)測(cè)定，過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣，UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm），柱溫：40 ℃；流動(dòng)相及洗脫條件如下A為甲醇，B 為0.1 %甲酸水溶液，流速為0.6 mL/mim，梯度洗脫：起始時(shí)間至0.5mni 30 %A+70 %B，0.5 min至3 min 90 %A+10 %B，3 min至5 mni 10 %A + 90 %B，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，分別對(duì)金剛烷胺和金剛烷胺-D15標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行一級(jí)離子掃描，確定化合物的電離方式和分子離子，在獲得分子離子峰（母離子）質(zhì)荷比后，再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（子離子）掃描，優(yōu)化碰撞能量，確定兩個(gè)豐度比較高的子離子作為定性和定量離子。在ESI（+）檢測(cè)模式下，化合物質(zhì)譜采集參數(shù)見表1

1.4 方法靈敏度確定

將適量金剛烷胺加入到空白雞肉中，制成0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、2.0 μg/kg三個(gè)濃度添加樣品，經(jīng)上述方法進(jìn)行前處理后，用超高效液相色譜質(zhì)譜法檢測(cè)，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比（S/N）和對(duì)應(yīng)藥物濃度，S/N＞3 者定其為方法的檢測(cè)限；S/N＞10 者定其為方法的定量限。

1.5 準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白雞肉中各添加1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10 .0 μg/kg三個(gè)不同濃度藥物進(jìn)行回收率試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行6個(gè)樣品平行試驗(yàn)，求RSD。

圖2 空白基質(zhì)色譜圖譜

圖3 雞肉添加2.0 μg/kg的金剛烷胺色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限

配制金剛烷胺的質(zhì)量濃度為0.10 μg/L～10.0 μg/L的基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)工作液，內(nèi)標(biāo)濃度均為4.0 μg/L，以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度X（μg/L）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

以加標(biāo)樣品中待測(cè)化合物色譜峰的信噪比等于3對(duì)應(yīng)的濃度為方法檢出限，確定雞肉中的金剛烷胺的檢出限為0.05 μg/kg。其中空白基質(zhì)及添加藥物樣品色譜圖譜見圖2和圖3。

2.2 方法回收率實(shí)驗(yàn)

分別取雞肉空白樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10.0 μg/kg。將加標(biāo)樣品和空白樣品按前述方法進(jìn)行處理，上機(jī)測(cè)試，結(jié)果見表2，表3和表4。

2.3討論：樣品前處理方法的選擇

從雞肉樣品中提取利巴韋林和金剛烷胺通常使用酸化或堿化的甲醇、乙腈等［2-4］。樣品提取液中常含有大量的蛋白質(zhì)，1 %的乙酸溶液能夠使蛋白質(zhì)沉淀并抑制蛋白與這些分析物結(jié)合。選擇該溶液與甲醇、乙腈組成適宜濃度的混合溶液作為提取液，比較了不同配比提取液的提取效率，發(fā)現(xiàn)含有金剛烷胺的樣品用1 %乙酸乙腈混合溶液有較高的回收率。

文獻(xiàn)報(bào)道金剛烷胺的除雜凈化都是用不同類型的SPE小柱來實(shí)現(xiàn)的，包括活化-上樣-淋洗-洗脫等步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)［2-4］。我們通過實(shí)驗(yàn)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不使用SPE柱，直接加入10 mL的正己烷除脂除雜后，氮吹后，用甲醇：0.1 %甲酸水溶液（體積比為1：1）溶解殘?jiān)?，渦旋30 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液過膜上機(jī)檢測(cè)，目標(biāo)物分離效果好，基質(zhì)干擾很少，空白基質(zhì)圖譜（圖1）及2.0 μg/kg陽性加標(biāo)色譜圖（圖2），完全能達(dá)到檢測(cè)要求。因此我們采用加正己烷除脂吹干后，直接溶解殘?jiān)?，離心過膜的方法，大大節(jié)省了人力，物力。

3 結(jié)論

本方法建立了雞肉中金剛烷胺的超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定方法。樣品經(jīng)過酶解、提取、凈化，有效地消除了基質(zhì)干擾，方法具有較高的靈敏度，以金剛烷胺- D15為內(nèi)標(biāo)，提高了定量準(zhǔn)確性。經(jīng)過優(yōu)化試驗(yàn)驗(yàn)證，一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液 （0.1 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、4.0 μg/L、10.0 μg/L）的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9；方法檢出限確定為0.05 μg/kg，滿足日常檢測(cè)需要；在1.0 μg/kg～10.0 μg/kg添加水平的平均回收率在89.4 %～110.2 %之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.02 %～4.31 %；通過回收率和多種食品樣品的實(shí)測(cè)實(shí)驗(yàn)證明：上述方法樣品前處理方法簡(jiǎn)便、快捷、易操作，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的條件設(shè)置合理，相關(guān)參數(shù)優(yōu)化較佳，靈敏度較高，可準(zhǔn)確進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，適用于可食動(dòng)物肌肉、肝臟、雞蛋中金剛烷胺殘留的檢測(cè)。

［1］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部560號(hào)公告獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄.

［2］ 白亞敏，楊小珊，毛 慶，等.超高效液相色譜質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中抗病毒類藥物殘留［J］.食品工業(yè)科技，2014，24（7）：76-78

［3］ 云環(huán)，張朝暉，羅生亮，等.固相萃取/LCMS/MS法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的金剛烷胺［J］.現(xiàn)代儀器，2009，15（6）：42-45.

［4］ 陳慧華，韋敏玨，周煒，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物組織中金剛烷胺和金剛乙胺的殘留量［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2013，34（4）：226-232.

［5］ 韓加怡，傅紅云.毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定復(fù)方鹽酸金剛乙胺膠囊中的鹽酸金剛乙胺［J］. 色譜，2005，23（6）：683.

S859.79+6

A

1001-0769（2016）07-0064-04