1株小鼠腸道酵母菌的分離與鑒定

肖新云，劉又嘉，鄧艷玲，郭抗蕭，譚周進(jìn)*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410100）

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1株小鼠腸道酵母菌的分離與鑒定

肖新云1，劉又嘉1，鄧艷玲1，郭抗蕭2，譚周進(jìn)1*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410100）

為研制新型微生態(tài)制劑，從試驗(yàn)小鼠中分離出 1株腸道酵母菌，采用形態(tài)學(xué)、生理生化、基因測序和系統(tǒng)發(fā)育樹分析等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，該菌菌落呈白色、圓形，在顯微鏡下細(xì)胞呈橢圓形，出芽生殖；該菌能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和 D-甘露醇，能夠同化蛋白胨和硝酸鉀，不能耐受高濃度乙醇，脲酶試驗(yàn)結(jié)果為陰性。序列分析結(jié)果表明，該菌株 18S rDNA（登錄號(hào)為 KC534843） 與漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）18S rDNA（登錄號(hào)為 AB013567）的同源性達(dá) 99%，26S rDNA（登錄號(hào)為 KC534842） 與漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）26S rDNA（登錄號(hào)為 EU131182）的同源性達(dá) 99%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，該菌株18S rDNA與 Debaryomyces hansenii（登錄號(hào)為 AB013590）的親緣關(guān)系最近，26S rDNA與 Debaryomyces hansenii（登錄號(hào)為EU131182）的親緣關(guān)系最近。由以上結(jié)果可推斷該菌為漢遜德巴利酵母。

小鼠；腸道酵母菌；漢遜德巴利酵母；26S rDNA；18S rDNA

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近年來，隨著胃腸道微生物研究的深入，國內(nèi)外在腸道微生態(tài)制劑方面進(jìn)行了大量研究。酵母菌及其培養(yǎng)物含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、消化酶、促生長因子和肽、多種必需氨基酸、脂肪酸等，對(duì)促進(jìn)體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、腸道菌群調(diào)整、機(jī)體免疫力提高等具有顯著效果［1］。活性酵母為美國FDA于1989年批準(zhǔn)用于飼喂的益生菌和中國農(nóng)業(yè)部 1999年批準(zhǔn)使用的益生素品種。國外對(duì)活性酵母在單胃動(dòng)物中發(fā)揮益生菌作用的研究比對(duì)乳酸菌、雙歧桿菌和芽孢桿菌的研究少［2-3］，且研究結(jié)果不一致，所以目前已研發(fā)出的活性酵母微生態(tài)產(chǎn)品很少。

中藥微生態(tài)制劑被稱為“第四代益生素”，是以中草藥或提取物為載體接入乳酸菌、酵母菌等益生菌后進(jìn)行發(fā)酵的活菌制劑。中藥與微生態(tài)制劑結(jié)合，在增強(qiáng)藥效、減輕毒副作用、節(jié)約藥材資源等方面存在明顯優(yōu)勢，具有廣闊的研究與應(yīng)用前景［4］。臨床研究表明，采用白芷、苦參、白扁豆、蟬兌、防風(fēng)煎煮液灌腸聯(lián)合常美安微生態(tài)制劑治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床效果好，不良反應(yīng)少，安全性高［5］。白頭翁加甘草阿膠湯與金雙岐益生菌聯(lián)用對(duì)抗生素?zé)o效小兒細(xì)菌性痢疾的痊愈率高，二重感染減少［6］。在動(dòng)物飼養(yǎng)研究中也發(fā)現(xiàn)，中草藥微生態(tài)制劑能提高育肥豬的進(jìn)食量，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收［7］。中藥通過促進(jìn)正常菌群生長來維持菌群平衡，微生態(tài)制劑則是直接補(bǔ)充有益菌來維持菌群平衡，二者的作用相同。

七味白術(shù)散能改善菌群失調(diào)腹瀉小鼠的脾虛癥狀，促進(jìn)腸道雙歧桿菌、乳酸菌和真菌生長［8］。本課題組從小鼠腸道中分離出 1株腸道酵母菌，體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茯苓、白術(shù)、葛根等單味中藥及七味白術(shù)散復(fù)方在低藥物濃度下對(duì)該菌株有促進(jìn)作用［9］。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示，超微七味白術(shù)散和酵母菌都能促進(jìn)腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌的生長，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，其中 25%量超微七味白術(shù)散湯劑與 25%量酵母配伍能治療小鼠菌群失調(diào)腹瀉，其療效與超微七味白術(shù)散 50%量相當(dāng)，達(dá)到全量傳統(tǒng)湯劑的效果［10］。為了對(duì)該菌株進(jìn)行更加全面的鑒定，探討其與腸環(huán)境的相互關(guān)系，筆者采取形態(tài)學(xué)觀察、生理生化、基因測序以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1酵母菌

取試驗(yàn)動(dòng)物空腸至回腸段的腸道內(nèi)容物，將其放入裝有玻璃珠的無菌水三角瓶中，120 r/min搖床振搖 30 min，待微生物充分分散后，10倍系列稀釋，提取單菌落，劃線分離，純化腸道酵母菌。

1.1.2培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基、YPD液體培養(yǎng)基、麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基、同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、同化氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、同化乙醇基礎(chǔ)培養(yǎng)基、產(chǎn)類淀粉培養(yǎng)基、尿素分解培養(yǎng)基、麥芽汁液體培養(yǎng)基均參照文獻(xiàn)［11］進(jìn)行配制。

1.1.3試劑

試劑為葡萄糖、蔗糖、乳糖、D-木糖、D-甘露醇、尿素、碘液、Tris、SDS、醋酸鉀、氯仿-異戊醇（23∶1）、異丙醇、酚-氯仿-異戊醇（24∶23∶1）、70%乙醇、dNTPs、10×Taq Buffer、Taq 聚合酶、溴化乙錠、瓊脂糖、6×Loading Buffer、DL3000 DNA Marker等。

1.2方法

1.2.1形態(tài)學(xué)特征觀察

采用點(diǎn)接法將菌種接種到 PDA固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng) 3～7 d，觀察菌落形態(tài)。用水浸片法和堿性美藍(lán)染色法在顯微鏡下觀察，記錄酵母的出芽繁殖方式和細(xì)胞形狀。

1.2.2生理生化特征觀察

1） 碳水化合物的發(fā)酵。配制 0.5%的酵母提取物溶液，分裝試管，每管 3.6 mL，將葡萄糖、蔗糖、乳糖、D-木糖、D-甘露醇分別制成 20%的溶液，然后依次向分裝試管中各加入 0.4 mL，放入倒置的杜氏發(fā)酵管。棉塞封口后 121 ℃蒸汽滅菌30 min。制作菌懸液，以每管 0.5 mL的量接種于糖發(fā)酵試管內(nèi)，搖勻，28 ℃下培養(yǎng)，觀察杜氏管內(nèi)氣體的積存情況。

2） 碳源化合物的同化。采用液體試管法檢測碳源同化情況。每管加無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基 5 mL，分別加入0.025 g葡萄糖、D-果糖、乳糖、山梨醇、鼠李糖、D-甘露醇和蔗糖。以葡萄糖為陽性對(duì)照，28 ℃下培養(yǎng)2～3 d ，觀察記錄結(jié)果。

3） 氮源化合物的同化。采用固體生長譜法檢測試氮源的同化反應(yīng)。將已培養(yǎng) 24 h的菌種斜面用無菌生理鹽水洗下，制成菌懸液，倒入冷卻至50 ℃左右的無氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻，倒平板后將已凝固的2個(gè)平板皿劃分成4個(gè)區(qū)域，并標(biāo)明要點(diǎn)植的蛋白胨、尿素、硫酸銨和硝酸鉀的區(qū)域，用無菌牙簽分別挑取蛋白胨、尿素、硫酸銨和硝酸鉀對(duì)號(hào)點(diǎn)樣，28 ℃下培養(yǎng) 2～3 d，觀察、記錄結(jié)果。

4） 類淀粉化合物的形成鑒定。將酵母菌接種于PYG液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)1～2 h，加適量碘液于培養(yǎng)管中，搖勻，觀察、記錄結(jié)果。

5） 尿酶試驗(yàn)。將酵母菌接種于尿素液體培養(yǎng)基內(nèi)，置 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每 30 min觀察 1次，液體變紅色的為尿酶試驗(yàn)陽性。

6） 乙醇耐受性試驗(yàn)。將酵母種子液接入 10%乙醇麥芽汁中，于最適生長溫度培養(yǎng)，觀察生長情況。

1.3分子生物學(xué)分析

1.3.1DNA的提取

活化供試菌株并轉(zhuǎn)接至 YPD液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫?fù)u床上200 r/min培養(yǎng)24 h，待菌液渾濁后取出，于離心機(jī)中12 000 r/min 離心5 min，棄上清。將沉淀置于預(yù)冷的研缽中，加液氮快速研磨成粉末。將粉末置于1.5 mL離心管中。采用CTAB法提取DNA，用TE液溶解，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，于-20 ℃保存，備用。

1.3.2PCR擴(kuò)增及序列分析

PCR擴(kuò)增采用真菌通用引物。18S rDNA正向引物為NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′），反向引物為NS8（5′-TCCGCAGGTTCACCTACGG A-3′）；26S rDNA正向引物為NL1（5′-GCATATCA ATAAGCGGAGGAAAAG-3′），反向引物為NL4 （5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系 50 μL，其中，ddH2O 37.7 μL，10×Taq Buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 4 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，模板DNA 0.5 μL，Taq聚合酶（5 U/μL） 0.8 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 10 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 產(chǎn)物電泳檢測后由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在 GenBank中注冊(cè)。將所測序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行同源性比較，并從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)種的18S rDNA和26S rDNA基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。序列對(duì)排用 CLUSTAL X program［12］完成，進(jìn)化樹構(gòu)建用 MEGA 5.0軟件中的Neighbor-Joining［13］法進(jìn)行。

圖1　酵母菌的菌落及顯微形態(tài)Fig.1 Colony and microscopic morphology of the yeast

2　 結(jié)果與分析

2.1酵母菌菌落及顯微形態(tài)

將該菌株點(diǎn)接于PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)3 d（圖 1-A），菌落呈白色，圓形，邊緣整齊，不透明，從正面觀察，菌落凸起，培養(yǎng)皿內(nèi)酒味明顯，菌落最中心顏色淡，光滑，無毛狀。用PDA培養(yǎng)基制作水浸片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察（圖 1-B）， 該酵母菌呈不規(guī)則圓形，半透明。堿性美藍(lán)染色觀察結(jié)果（圖 1-C）顯示，菌體呈淡藍(lán)色，其代謝作用較弱，未形成假菌絲。電鏡觀察結(jié)果（圖 1-D、E）顯示，該菌無性生殖方式為出芽生殖，菌體呈圓形和橢圓形。

2.2生理生化分析結(jié)果

對(duì)該菌的生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，該酵母菌能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和 D-甘露醇，不能夠同化 D-木糖、D-果糖、乳糖和鼠李糖。氮源同化試驗(yàn)結(jié)果表明，該酵母菌能夠同化蛋白胨和硝酸鉀，不能同化尿素。耐受性試驗(yàn)結(jié)果表明，該酵母菌不形成類淀粉，尿酶試驗(yàn)為陰性，不能耐受高濃度乙醇。

2.3PCR測序結(jié)果及同源性比較結(jié)果

PCR擴(kuò)增酵母菌18S rDNA和26S rDNA序列的電泳結(jié)果（圖2）顯示，18S rDNA序列長度為1 775 kb，在GenBank中的序列登錄號(hào)為KC534843。將菌株的 18S rDNA序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該酵母菌與漢遜德巴利酵 母（Debaryomyces hansenii，序列 號(hào)為AB013567）的同源性達(dá) 99%。26S rDNA序列長度為 613 kb，在 GenBank中的序列登錄號(hào)為KC534842，與數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行同源性比較，該菌與漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii ，序列號(hào)EU131182）的同源性達(dá)99%。

圖2　酵母菌18S rDNA和26S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR results from 18S rDNA and 26S rDNA of the yeast

2.418S rDNA和26S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

用MEGA5.2 Tree軟件構(gòu)建18S rDNA與26S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 3），該酵母分別與Debaryomyces hansenii（序列號(hào)為 AB013590）和Debaryomyces hansenii（序列號(hào)為EU131182）的親緣關(guān)系較近。據(jù)此可知，該菌為漢遜德巴利酵母。

圖3　酵母菌18S rDNA和26S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree from 18S rDNA and 26S rDNA of the yeast strain

3　結(jié)論與討論

通過觀察菌落的形態(tài)和其在電鏡下的特征，輔以生理、生化營養(yǎng)試驗(yàn)，并對(duì)真菌 18S rDNA、 26S rDNA進(jìn)行序列和親緣關(guān)系分析，可鑒定該菌為漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）。

漢遜德巴利酵母是一種高耐鹽酵母菌，通常從鹵水食物和低水活性產(chǎn)品中被發(fā)現(xiàn)，可以將其從鹽水和太陽能鹽廠分離得出［14］。該菌株具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)和脂肪分解能力，常被用作微生物發(fā)酵劑，如干酪發(fā)酵、酒醅發(fā)酵、臘肉脂肪水解等［15-18］。有研究發(fā)現(xiàn)腸道漢遜德巴利酵母是刺參、凡納濱對(duì)蝦、虹鱒等的腸道內(nèi)優(yōu)勢菌種［3］。Kumura［19］在體外模仿腸環(huán)境對(duì)8種來源于乳制品酵母菌的益生菌潛力進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)漢遜德巴利酵母具有一定的腸壁粘附能力和耐酸耐鹽能力，具有一定的開發(fā)價(jià)值。漢遜德巴利酵母與乳酸乳球菌有互利共生關(guān)系，混合培養(yǎng)時(shí)能促進(jìn)乳酸乳球菌的生長［17］。漢遜德巴利酵母能夠在果蔬的傷口處快速增殖，適應(yīng)果蔬儲(chǔ)藏的低溫環(huán)境，拮抗果蔬的致病性霉菌，起到保鮮效果［20-22］。漢遜德巴利酵母的這些體外特性有助于其被開發(fā)成新型微生態(tài)制劑。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Isolation and identification of a yeast strain from intestine of mice

Xiao Xinyun1， Liu Youjia1， Deng Yanling1， Guo Kangxiao2， Tan Zhoujin1*
（1.School of Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2.Changsha Health Vocational College， Changsha 410100， China）

In order to develop a new type of probiotics， a yeast strain was isolated from intestine of mice， and it was identified using the methods of morphology， physiology， biochemistry， gene sequencing and phylogenetic tree. The results showed that the bacterial colony presented in white milky color and oval shape. Through microscopic observation，we found its cell presented in oval shape， and the asexual reproduction was gemmation. The yeast could ferment glucose，sucrose and D-mannitol， as well as assimilate peptone and potassium nitrate， while， it could not tolerate high concentration of alcohol， and the urease test was negative. The results from 18S rDNA sequencing analysis showed that DNA homology of the strain （Accession No. KC534843） and Debaryomyces hansenii （Accession No. AB013567）reached up to 99%， moreover， 26S rDNA sequencing analysis showed that the homology between the strain （Accession No. KC534842） and Debaryomyces hansenii （Accession No. EU131182） was also 99%. From the result of phylogenetic tree showed that 18s rDNA gene sequence of the strain was closest to Debaryomyces hansenii （Accession No. AB013590）， and 26S rDNA gene sequence of the strain was closest to Debaryomyces hansenii （Accession No. EU131182）. We could draw the conclusion that the yeast strain was Debaryomyces hansenii.

mice； intestinal yeast； Debaryomyces hansenii； 26S rDNA； 18S rDNA

肖新云（1990—），男， 江西吉安人，碩士研究生，主要從事中醫(yī)藥微生態(tài)學(xué)研究，1360953613@qq.com；*通信作者，譚周進(jìn)，博士，教授，主要從事中醫(yī)藥微生態(tài)學(xué)研究，tanzhjin@sohu.com

Q939.93

A

1007-1032（2016）04-0419-05

2015-11-20 修回日期：2015-12-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81573951）；長沙市科技局項(xiàng)目（K1508025-21）