抗水稻黑條矮縮病轉(zhuǎn)基因材料的鑒定分析

尹鮮思，王少嶺，崔益平，陳秋紅，王國梁,2，王志龍*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.美國俄亥俄州立大學(xué)植物病理系，俄亥俄 哥倫布 43210)

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抗水稻黑條矮縮病轉(zhuǎn)基因材料的鑒定分析

尹鮮思1，王少嶺1，崔益平1，陳秋紅1，王國梁1,2，王志龍1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.美國俄亥俄州立大學(xué)植物病理系，俄亥俄 哥倫布 43210)

針對(duì)水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)的核心粒子外殼蛋白基因(S8)、毒質(zhì)與非結(jié)構(gòu)蛋白基因(S9)及其嵌合基因(S8&S9)構(gòu)建了6個(gè)RNAi載體，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化武陵粳1號(hào)獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過潮霉素溶液浸泡法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行初步篩選，剔除假陽性植株；再通過PCR從DNA水平進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽性鑒定；進(jìn)一步通過qRT–PCR 從RNA水平進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)量分析。選取qRT–PCR表達(dá)量高的單拷貝純系S8后代進(jìn)行灰飛虱傳毒試驗(yàn)，結(jié)果表明，含有S8 RNAi片段的轉(zhuǎn)基因水稻材料對(duì)RBSDV具有一定抗性。

水稻；水稻黑條矮縮??；轉(zhuǎn)基因株系；RNA干擾；熒光定量PCR

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水稻黑條矮縮病是由水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)引起的一種病毒性病害，發(fā)病植株表現(xiàn)為矮化、分蘗增多，葉片短闊、僵直，葉色濃綠，葉脈和莖稈呈蠟白色，漸變?yōu)楹稚虠l瘤狀隆起，穗小或不抽穗結(jié)實(shí)[1–3]。RBSDV的宿主主要有水稻、玉米、小麥等禾本科植株，其傳播媒介為灰飛虱和白背飛虱[4–6]。水稻黑條矮縮病20世紀(jì)50年代在日本被首次報(bào)道[7]，并于1968年大規(guī)模暴發(fā)，導(dǎo)致糧食減產(chǎn)絕收[8]。20世紀(jì) 60年代在中國首次被報(bào)道[9–10]。20世紀(jì)90年代末以來，在中國南方稻區(qū)再次暴發(fā)流行，造成水稻大面積減產(chǎn)[11]。

水稻黑條矮縮病毒屬呼腸孤病毒科斐濟(jì)病毒屬，其病毒粒子為直徑75~80 nm的二十面體，包含雙層衣殼[12–13]，具有外層衣殼上的 A–突起和核心粒子表面的 B–突起[14]。RBSDV全基因組由 10條雙鏈RNA(dsRNA)組成[15]，分別命名為S1~S10，其對(duì)應(yīng)編碼蛋白分別為P1~P10，其中，S8具有1 927 bp，P8的相對(duì)分子質(zhì)量為65 000，屬小核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白，在RBSDV侵染過程中抑制轉(zhuǎn)錄[16]。S9具有1 900 bp，含2個(gè)非重疊ORFs，分別編碼P9–1和P9–2，P9–1為聚集在侵染細(xì)胞的病毒基質(zhì)，參與病毒復(fù)制和聚集，P9–2為非結(jié)構(gòu)蛋白[17]。

Jia等[18]針對(duì)P7–1基因進(jìn)行RNA干擾，有效抑制了病毒在昆蟲媒介的傳播；Shimizu等[10]對(duì)P9–1進(jìn)行干擾，發(fā)現(xiàn)可以達(dá)到抗病效果。筆者針對(duì)水稻黑條矮縮病毒核心粒子外殼蛋白基因(S8)、毒質(zhì)與非結(jié)構(gòu)蛋白基因(S9)及 S8&S9嵌合片段，利用兩步法快速高效構(gòu)建了6個(gè)RNAi載體，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化武陵粳 1號(hào)，獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株，并通過qRT–PCR選擇雙鏈RNA表達(dá)量高的單拷貝純系進(jìn)行了灰飛虱傳毒試驗(yàn)與抗性評(píng)估，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料

水稻武陵粳1號(hào)(高感RBSDV)；已感染RBSDV水稻病株及葉片(貯藏于–80 ℃冰箱，揚(yáng)州大學(xué)左示敏教授惠贈(zèng))；灰飛虱(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)飼養(yǎng))。

1.2方法

1.2.1RNA干擾載體的構(gòu)建

使用pENTR載體和pANDA載體，參照兩步法[19]，構(gòu)建RBSDV S8、S9及S8&S9的RNA干擾載體(PCR引物見表1)。

表1　PCR和qRT–PCR引物信息Table 1 Sequence information for PCR and qRT–PCR primers

S8的RNAi干擾載體的構(gòu)建：以含有RBSDV的水稻葉片cDNA為模板，擴(kuò)增 S8干擾片段，將其連接到入門載體pENTR上，經(jīng)BamHI、XhoI雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證后，再與目的載體pANDA進(jìn)行重組反應(yīng)，陽性重組子經(jīng)菌落PCR及KpnI、SacI雙酶切驗(yàn)證后，用于轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。S9的RNAi干擾載體構(gòu)建與S8的相同。

S8–1&S9–2嵌合片段載體的構(gòu)建：以已構(gòu)建的pENTR–S8–1為模板，S8–1–F與A引物擴(kuò)增嵌合片段中的S8–1部分；以pENTR–S9–2為模板，B引物與S9–2–R引物擴(kuò)增嵌合片段中的S9–2部分，A引物與B引物為反向互補(bǔ)序列(表1)，將2個(gè)片段分別切膠回收，共同作為模板，S8–1–F與S9–2–R引物擴(kuò)增整個(gè)嵌合片段，再連接到入門載體pENTR上，BamH I、XhoI雙酶切驗(yàn)證，測(cè)序正確后，與pANDA進(jìn)行重組反應(yīng)，重組子采用菌落PCR和質(zhì)粒KpnI、SacI雙酶切驗(yàn)證，正確重組子用于轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。S8–2&S9–1的 RNAi干擾載體構(gòu)建與S8–1&S9–2的相同。

1.2.2根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化

運(yùn)用電擊法，將構(gòu)建的 RNAi載體 pANDA–S8/S9/S8&S9轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證和雙酶切(KpnI和SacI)驗(yàn)證。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻黑條矮縮病高感品種武陵粳1號(hào)，采用潮霉素篩選法，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.3轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定與表達(dá)分析

將得到的轉(zhuǎn)基因 T1代植株從生根培養(yǎng)基上取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移植到大田，待植株健壯后，剪取少許葉片置于含有潮霉素溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%)的管子中浸泡5~7 d；選取潮霉素溶液鑒定陽性(葉片仍為綠色)的植株，提取其葉片基因組 DNA，使用目的引物(表1)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因PCR陽性鑒定。再對(duì)PCR鑒定為陽性的植株進(jìn)行qRT–PCR表達(dá)量分析，確定插入片段的轉(zhuǎn)錄水平，以鑒定轉(zhuǎn)基因陽性表達(dá)效率。進(jìn)一步選取轉(zhuǎn)基因T2代及T3代陽性植株，進(jìn)行潮霉素溶液鑒定，PCR及qRT–PCR分析，篩選高表達(dá)目的片段的T3代單拷貝轉(zhuǎn)基因純系。

1.2.4灰飛虱室內(nèi)傳毒與轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定

將挑選的T3代單拷貝轉(zhuǎn)基因純系浸種發(fā)芽，水稻幼苗在溫室采用長日照培養(yǎng)(光照 14 h，溫度26 ℃，相對(duì)濕度80%；黑暗10 h，溫度20 ℃，相對(duì)濕度保持不變)。在人工氣候模擬培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)灰飛虱，恒溫27 ℃，相對(duì)濕度70%，光照16 h。用感染RBSDV的水稻葉片飼養(yǎng)灰飛虱。待T3植株長到四葉期進(jìn)行灰飛虱傳毒，持續(xù)20 d，期間不定時(shí)驅(qū)趕灰飛虱取食待傳毒水稻葉片，保證傳毒效率最大化。傳毒完成后，隨機(jī)抓取一定量傳毒灰飛虱，提取RNA，RT–PCR檢測(cè)其帶毒率。將完成傳毒的水稻幼苗移栽到大田中，觀察水稻抽穗期表型，確定水稻是否發(fā)病。

2　結(jié)果與分析

2.1RNAi載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

選取編碼RBSDV結(jié)構(gòu)蛋白基因S8以及S9作為構(gòu)建RNAi干擾載體的候選基因，利用入門載體及LR重組反應(yīng)[19]，構(gòu)建2個(gè)S8片段S8–1和S8–2以及2個(gè)S9片段S9–1和S9–2的干擾載體(圖1)。

圖1　RBSDV S8 RNAi載體的構(gòu)建Fig. 1 The construction of RNAi vector for RBSDV S8

為了增強(qiáng)干擾效果，將S8基因和S9基因利用Overlapping PCR方法拼接到一起構(gòu)成一個(gè)較大的RNA干擾片段，共構(gòu)建2個(gè)嵌合片段 S8–1&S9–2 和S8–2&S9–1的RNAi載體，pANDA–S8&S9的構(gòu)建如圖2所示。

圖2　RBSDV S8&S9 RNAi載體構(gòu)建Fig.2 The construction of RNAi vector for RBSDV S8&S9

2.2轉(zhuǎn)基因水稻植株的陽性鑒定

對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株，采取了潮霉素溶液浸泡法、PCR擴(kuò)增以及qRT–PCR表達(dá)量分析3個(gè)步驟進(jìn)行鑒定。

圖3　RBSDV S8–1轉(zhuǎn)基因植株的潮霉素浸泡鑒定結(jié)果Fig.3 The identification of transgenic plants with RBSDV S8–1 by hygromycin detection

將得到的轉(zhuǎn)基因 T1代植株采用潮霉素浸泡法進(jìn)行初步篩選。S8–1的RNAi轉(zhuǎn)基因株系，陽性植株具有潮霉素抗性，葉片表現(xiàn)為綠色(如 CK+，已確定的轉(zhuǎn)基因植株)，未轉(zhuǎn)基因的 CK–葉片呈黃色(圖3)，由此初步鑒定1~8號(hào)、11~15號(hào)為轉(zhuǎn)基因陽性，9號(hào)和10號(hào)為轉(zhuǎn)基因陰性植株。將初步鑒定的轉(zhuǎn)基因陽性植株(1~8號(hào)、11~15號(hào))提取DNA，以未轉(zhuǎn)基因植株為陰性對(duì)照，載體pANDA–8–1為陽性對(duì)照，使用目的片段引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，如圖4–A所示。1~8號(hào)及11~15號(hào)的擴(kuò)增片段與陽性對(duì)照大小一致，確定這13株植株中插入了目的基因片段。從中選取 7株(1、2、3、5、6、14、15號(hào))進(jìn)行qRT–PCR表達(dá)量分析，如圖4–B，以武陵粳1號(hào)為對(duì)照組(WT)，RBSDV基因與水稻基因組無同源性，測(cè)量S8與水稻泛素基因(Ubiquitin，UBQ)的表達(dá)量比值(S8/UBQ)，與對(duì)照組相比，7株轉(zhuǎn)基因材料相對(duì)表達(dá)量均有一定程度的增加，其中在8號(hào)植株中增加約60倍，在2號(hào)和14號(hào)植株中分別增加約36、41倍，進(jìn)一步表明RBSDV外源片段已導(dǎo)入水稻中，并且可以在水稻中轉(zhuǎn)錄，為轉(zhuǎn)基因陽性植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因陽性植株的T2代，繼續(xù)采用上述3個(gè)步驟篩選，以獲得目的基因單拷貝插入的高表達(dá)株系，并篩選其T3代純系用于病毒傳毒鑒定。

圖4　RBSDV S8–1轉(zhuǎn)基因植株鑒定結(jié)果Fig.4 The identification of transgenic plants with RBSDV S8–1

按照以上篩選方式，對(duì)pANDA–S9–1轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行鑒定，如圖 5–A所示。PCR鑒定顯示14株T1轉(zhuǎn)基因植株中，有12株(1~6號(hào)、9~14號(hào))為陽性植株，2株(7、8號(hào))為陰性植株。選取2號(hào)和5號(hào)植株的T2代高表達(dá)株系進(jìn)行qRT–PCR表達(dá)量分析，結(jié)果(圖5–B)顯示，T2轉(zhuǎn)基因植株2–4的相對(duì)表達(dá)量高達(dá)約800倍，T2轉(zhuǎn)基因植株2–1和5–1的相對(duì)表達(dá)量約600倍，其余植株的相對(duì)表達(dá)量約200~400倍，這些高表達(dá)株系將用于篩選單拷貝的T3代純系。

圖5　RBSDV S9–1轉(zhuǎn)基因植株鑒定結(jié)果Fig.5 The identification of transgenic plants with RBSDV S9–1

同樣地，對(duì)pANDA–S8&S9轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行鑒定，如圖6–A所示。結(jié)果顯示，17株T1轉(zhuǎn)基因植株中，有16株(1~11號(hào)、 13~17號(hào))為陽性植株，1株(12號(hào))為陰性植株。選取1、25和30號(hào)植株的T2代進(jìn)行qRT–PCR表達(dá)量分析，結(jié)果顯示(圖6–B)，植株1號(hào)的3株T2代(1–2號(hào)、1–4號(hào), 1–6 號(hào))相對(duì)表達(dá)量約為20~60倍，其余植株的相對(duì)表達(dá)量均低于20倍，相對(duì)表達(dá)量高于20倍的株系被考慮用于篩選T3代的單拷貝純系。

圖6　RBSDV S8–1&S9–2轉(zhuǎn)基因植株鑒定結(jié)果Fig.6 The identification of transgenic plants with RBSDV S8–1&S9–2

2.3轉(zhuǎn)基因水稻植株的傳毒接種與鑒定

在進(jìn)行傳毒試驗(yàn)之前，提取RBSDV病毒供體水稻單株材料葉片 RNA，采用 S8基因引物進(jìn)行RT–PCR分析，以水稻Ubiquitin基因作為對(duì)照，檢測(cè)供體材料帶毒情況，如圖 7–A所示。高表達(dá)RBSDV病毒S8基因的水稻單株4號(hào)和5號(hào)可以用來作為接種RBSDV的供體。

圖7　感染RBSDV水稻病株鑒定Fig.7 The identification of infected plants with RBSDV and inoculation of RBSDV by Lalielphax striatellus

根據(jù)圖4–B的qRT–PCR表達(dá)量分析結(jié)果，選取S8–1的6號(hào)轉(zhuǎn)基因株系T3后代純系種子，于播種后植株2~3葉期，開始采用離體葉片法，進(jìn)行灰飛虱傳毒，如圖7–B所示。傳毒完成后，通過檢測(cè)傳毒灰飛虱的帶毒率來確定傳毒效果，若帶毒率高于80%便認(rèn)定傳毒有效。

經(jīng)有效傳毒后，植株在同等生長條件下，繼續(xù)生長25 d，觀察表型變化。已接受傳毒的武陵粳1號(hào)與轉(zhuǎn)基因材料相比，植株生長緩慢，部分植株干枯而死，葉片上出現(xiàn)條紋病斑，而攜帶有 RBSDV 的S8–1 RNAi干擾載體的轉(zhuǎn)基因植株以及未進(jìn)行傳毒的武陵粳1號(hào)則正常生長，植物無枯死現(xiàn)象，葉片也無明顯病斑(圖 8–A、圖 8–B)。溫室接種數(shù)據(jù)初步表明，含有 S8–1 RNAi片段的轉(zhuǎn)基因材料對(duì)RBSDV具有一定抗性。

圖8　S8–1轉(zhuǎn)基因植株傳毒后的表型Fig.8 The phenotypes of S8–1 transgenic plants after RBSDV inoculation

3　結(jié)論與討論

水稻黑條矮縮病具暴發(fā)性、間歇性和遷移性，其防控難度極大。針對(duì)RBSDV的S8、S9及S8&S9嵌合基因，通過兩步法構(gòu)建了6個(gè)RNAi載體，轉(zhuǎn)化高感水稻品種武陵粳1號(hào)，獲得了S8、S9及S8&S9 的RNAi轉(zhuǎn)基因材料。由于獲得的轉(zhuǎn)基因材料較多，因而先采用潮霉素浸泡法(較簡便有效)對(duì)轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行初步篩選，排除假陽性，以降低后續(xù)工作量。接著利用PCR鑒定目的基因是否整合到陽性植株基因組中，再通過qRT–PCR測(cè)量目的基因在轉(zhuǎn)基因植株的相對(duì)表達(dá)量。通過上述對(duì)水稻轉(zhuǎn)基因陽性植株的層層遞進(jìn)鑒定，成功篩選到了 S8、S9及 S8&S9嵌合基因的RNAi轉(zhuǎn)基因陽性植株，為RBSDV室內(nèi)接種及田間抗性鑒定提供了材料基礎(chǔ)。

在進(jìn)行RBSDV室內(nèi)接種前，先確定田間采集的水稻矮化病株是否帶毒。在接種過程中，檢測(cè)了新鮮的及凍存的水稻帶毒葉片，發(fā)現(xiàn)二者均能使灰飛虱有效傳毒，特別是凍存的水稻帶毒葉片，能夠全年安排灰飛虱傳毒試驗(yàn)，進(jìn)行田間抗性鑒定。

在目前獲得的轉(zhuǎn)基因材料中，僅對(duì)S8的RNAi株系進(jìn)行了室內(nèi)接種鑒定及表型觀察，初步結(jié)果表明，含有S8 RNAi片段的轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)RBSDV具有一定抗性，但還有待大量接種病毒后的田間群體表型鑒定。同樣，含有S9以及S8&S9 RNAi片段的轉(zhuǎn)基因材料也需要室內(nèi)大量接種和田間群體表型鑒定。由于使用的目的載體pANDA含有篩選標(biāo)記抗潮霉素基因，考慮到水稻為重要糧食作物，將在后續(xù)試驗(yàn)中采用無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲取抗RBSDV的轉(zhuǎn)基因材料，以便用于水稻育種與種質(zhì)創(chuàng)新。

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責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅 維

Identification and analysis of transgenic lines against rice black-streaked dwarf virus

Yin Xiansi1, Wang Shaoling1, Cui Yiping1, Chen Qiuhong1, Wang Guoliang1,2, Wang Zhilong1*
(1.College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Department of Plant Pathology, The Ohio State University, Columbus, Ohio 43210, USA)

Genome segments S8 (encoding minor core capsid protein), S9 (encoding virplasm and non-structual protein) and their chimeric sequences S8&S9 of RBSDV were used to construct six RNAi vectors and transferred into rice cultivar Wulingjing 1 to generate transgenic plants by Agrobacterium-mediated transformation. Transgenic plants were first screened by immersion with hygromycin solution to eliminate the false-positive plants, then identified by PCR genotyping analysis from the DNA level，followed by qRT–PCR analysis of candidate genes at the RNA level. Single-copy transgenic lines with high expression of S8 detected by qRT–PCR were picked up for Laodelphax striatellus-mediated virus transmission test, and the results showed that transgenic lines containing S8 RNAi vector displayed resistance to RBSDV.

rice; rice black-streaked dwarf virus (RBSDV); transgenic lines; RNA interference (RNAi); qRT–PCR

；*通信作者，王志龍，博士，教授，主要從事作物遺傳育種與水稻抗逆分子生物學(xué)研究，zhilongwang@126.com

Q786

A

1007-1032(2016)04-0380-06

2016–03–24 修回日期：2016–04–08

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng) (2012ZX08009001)；教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IRT1239)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(XCX15145)

尹鮮思(1990—)，男，湖南邵陽人，碩士研究生，主要從事水稻抗逆分子生物學(xué)研究，1614974545@qq.com；王少嶺為共同